מחקרים אימונולוגיים באורולוגיה

מתן אימונוגרמה לחולה אורולוגי פירושו שהרופא המטפל חושד בנוכחות הפרעות במערכת החיסון. זיהומים חיידקיים, ויראליים ופטרייתיים חוזרים, תופעות אלרגיות ומחלות מערכתיות עשויים להיות סימנים להפרעות אלו, המאופיינות במספר תסמונות (זיהומיות, אונקולוגיות, אלרגיות, אוטואימוניות, לימפופרוליפרטיביות). לחולה אחד עשויות להיות מספר תסמונות. לדוגמה, מחלות זיהומיות כרוניות (תסמונת זיהומית) יכולות לגרום לחוסר חיסוני, וחסר חיסוני יכול להתבטא כטובה למחלות זיהומיות ואונקולוגיות (תסמונת אונקולוגית). נטייה לזיהומים עשויה להתרחש על רקע חוסר חיסוני משני, שהתפתח כתוצאה ממחלה לימפופרוליפרטיבית, כגון לוקמיה. ישנן שלוש קבוצות עיקריות של שינויים פתולוגיים במערכת החיסון:

• חוסר כמותי או תפקודי של חוליה זו או אחרת של מערכת החיסון, מה שמוביל להתפתחות של מצב של חוסר חיסוני;
• הפרעה בזיהוי אנטיגנים על ידי מערכת החיסון, המובילה להתפתחות של תהליכים אוטואימוניים;
• תגובה חיסונית היפר-ריאקטיבית או "מעוותת", המתבטאת בהתפתחות של מחלות אלרגיות.

ישנן שיטות סקר (בדיקות רמה 1) ושיטות הבהרה (בדיקות רמה 2) של אימונודיאגנוסטיקה. הראשונות קיימות כדי לתעד הפרעות במערכת החיסון, והאחרונות - כדי לקבוע את המנגנונים המעורבים ביישומן לצורך תיקון אימונו נוסף.

חסינות תאי B

שיטות סינון

• קביעת המספר היחסי והמוחלט של לימפוציטים מסוג B באמצעות אימונופלואורסצנציה או ציטופלואורומטריה של זרימה עם נוגדנים חד שבטיים לאנטיגנים של תאי B (CD19, CD20, כאשר CD הוא אשכולות התמיינות). התכולה התקינה של לימפוציטים מסוג B במבוגרים היא 8-19% מכלל הלויקוציטים או 190-380 תאים/מיקרוליטר. עלייה בתכולת לימפוציטים מסוג B מתרחשת בזיהומים חיידקיים ופטרייתיים חריפים וכרוניים, מחלות כבד כרוניות, מחלות רקמת חיבור מערכתיות, לוקמיה לימפוציטית כרונית ומיאלומה.
• קביעת ריכוז האימונוגלובולינים הלא ספציפיים (F, M, G, E) על ידי אימונודיפוזיה רדיאלית פשוטה, נפלומטריה או טורבומטריה, רדיואימונו-אסאי או אימונו-אסאי אנזים (ELISA). נורמות למבוגרים: אימונוגלובולין (Ig) A 0.9-4.5 גרם/ליטר. IgM 03-3.7 גרם/ליטר. IgG 8.0-17 גרם/ליטר. עלייה בריכוז האימונוגלובולינים מתרחשת באותם תנאים פתולוגיים בהם מתרחשת עלייה בתכולת לימפוציטים מסוג B. ירידה בריכוז האימונוגלובולינים מתרחשת בהיפוגמגלובולינמיה מולדת, גידולים של מערכת החיסון, הסרת הטחול, אובדן חלבון, מחלות כליות או מעיים, טיפול בציטוסטטיקה ובמדכאי חיסון.

שיטות הבהרה

• קביעת קומפלקסים חיסוניים במחזור הדם על ידי משקעים סלקטיביים בפוליאתילן גליקול ולאחר מכן בדיקת צפיפות ספקטרופוטומטרית (תקינה 80-20 יחידות). עלייה בקומפלקסים חיסוניים במחזור הדם אופיינית לזיהומים חיידקיים, פטרייתיים וויראליים חריפים, מחלות אוטואימוניות, מחלות קומפלקס חיסוניות, מחלת סרום, תגובות אלרגיות מסוג 3;
• קביעת אימונוגלובולינים ספציפיים בדם ביחס לאנטיגנים חיידקיים וויראליים, חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) במחלות אוטואימוניות, גילוי נוגדנים נגד זרע (עקרות אוטואימונית) ונוגדנים נגד הכליות (פיאלונפריטיס וגלומרולונפריטיס) בשיטת אימונודיפוזיה רדיאלית או ELISA.
• קביעת נוגדנים נגד זרע בזרע [בדיקת MAR (תגובה אנטיגלובולין מעורבת)], תקינה - תוצאה שלילית.
• קביעת ריכוז האימונוגלובולינים בשתן לצורך אבחנה מבדלת בין פיילונפריטיס לגלומרולונפריטיס (סלקטיביות של פרוטאינוריה).
• קביעת תכולת IgE במיץ הערמונית לצורך אבחון דלקת ערמונית אלרגית באמצעות שיטת אימונודיפוזיה רדיאלית או ELISA.
• מחקר התגובה בתגובת טרנספורמציה של בלסט לימפוציטים B למיטוגן של תאי B (מיטוגן של פקעת לגירוי תגובת טרנספורמציה של בלסט לימפוציטים B בנוכחות לימפוציטים T), שערכו הנורמטיבי הוא 95-100%.

קישור תאי T לחסינות

שיטות סינון

• קביעת המספר היחסי והמוחלט של לימפוציטים בוגרים מסוג CD3 T על ידי תגובת אימונופלואורסצנציה או ציטופלואורומטריה של זרימה באמצעות נוגדנים חד שבטיים כנגד CD3. הנורמה למבוגרים היא 58-76% או 1100-1700 תאים/μl. ירידה במספר לימפוציטים T היא אינדיקטור לחוסר בקשר התאי של החסינות. זה אופייני לכמה ליקויים חיסוניים משניים וראשוניים (זיהומים חיידקיים וויראליים כרוניים: שחפת, תסמונת הכשל החיסוני הנרכש, גידולים ממאירים, אי ספיקת כליות כרונית, פציעות, לחץ, הזדקנות, תת תזונה, טיפול בציטוסטטיקה, חשיפה לקרינה מייננת). עלייה במספר לימפוציטים T מתרחשת על רקע היפראקטיביות חיסונית או במחלות לימפופרוליפרטיביות. עם דלקת, מספר לימפוציטים T עולה תחילה ואז יורד. היעדר ירידה בלימפוציטים T מצביע על תהליך דלקתי כרוני.
• הערכת תת-אוכלוסיות לימפוציטים.
  • קביעת מספר נוגדני T (נוגדנים נגד CD4). בדרך כלל 36-55% או 400-1100 תאים/mcl. עלייה במספר תאים אלה מתרחשת במחלות אוטואימוניות, מחלת וולדנסטרום, הפעלת חסינות נגד השתלות; ירידה במספר נוגדני T מתרחשת בזיהומים כרוניים חיידקיים, ויראליים, פרוטוזואים, שחפת, תסמונת הכשל החיסוני הנרכש, גידולים ממאירים, כוויות, פציעות, תת תזונה, הזדקנות, טיפול בציטוסטטיקה, חשיפה לקרינה מייננת.
  • קביעת מספר מדכאי T (נוגדנים נגד CD4). בדרך כלל 17-37% או 300-700 תאים/μl. עלייה במספר מדכאי T מתרחשת באותם תנאים בהם מספר עוזרי T יורד, וירידה שלהם מתרחשת באותם תנאים בהם תכולת עוזרי T עולה.
  • אינדקס אימונו-רגולטורי CD4/CD8, בדרך כלל 1.5-2.5. היפראקטיביות עם ערכים מעל 2.5 (מחלות אלרגיות ואוטואימוניות); היפואקטיביות - פחות מ-1.0 (נטייה לזיהומים כרוניים). בתחילת התהליך הדלקתי, אינדקס האימונו-רגולטורי עולה, וכאשר הוא שוכך, הוא מתנרמל.

שיטות הבהרה

• קביעת מספר תאי הרוצחים הטבעיים (תאי NK) - נוגדנים נגד CD16 ואנטי-CD56. הנורמה עבור לימפוציטים מסוג CD 16 היא 6-26%, CD56 - 9-19%. עלייה במספר תאי NK מתרחשת במהלך דחיית השתלים, ירידה - עם זיהומים ויראליים, סרטן, ליקויים חיסוניים ראשוניים ומשניים, כוויות, פציעות ולחץ, טיפול בציטוסטטיקה וחשיפה לקרינה מייננת.
• קביעת מספר הלימפוציטים מסוג T עם קולטן לאינטרלוקין-2 (סמן הפעלה) - נוגדנים נגד CD25. הנורמה היא 10-15%. עלייה במספרם נצפית במחלות אלרגיות, דחיית השתלות, תגובה לאנטיגנים תלויי-תימוס בתקופה האקוטית של זיהום ראשוני, ירידה - באותן מחלות בהן יש ירידה במספר תאי NK.
• מחקר ביטוי של סמן הפעלה - מולקולת היסטוקומפטביליות מסוג II HLA-DR. ביטוי מוגבר מתרחש בתהליכים דלקתיים, בחולים עם הפטיטיס C, מחלת צליאק, עגבת, מחלות נשימה חריפות.
• הערכת אפופטוזיס של לימפוציטים. ניתן לקבל מושג כללי על מוכנות הלימפוציטים לאפופטוזיס על ידי ביטוי קולטן Fas (CD95) על פני השטח שלהם והפרוטו-אונקוגן bd-2 במיטוכונדריה. אפופטוזיס של לימפוציטים מוערך על ידי טיפול בהם בשני צבעים פלואורסצנטיים: פרופידיום יודיד, הנקשר לשברי DNA, ואנקסין Y, הנקשר לפוספטידילסרין, המופיע על קרום התא עם תחילת האפופטוזיס. התוצאות מוערכות באמצעות ציטופלואורומטר זרימה. התוצאות מחושבות על סמך היחס בין תאים הצבועים בצבעים שונים. תאים לא צבועים הם ברי קיימא, תאים הקשורים רק לאנקסין Y הם ביטויים מוקדמים של אפופטוזיס, כאשר פרופידיום יודיד ואנקסין Y הם ביטויים מאוחרים של אפופטוזיס, צביעה עם פרופידיום יודיד בלבד מעידה על נמק.
• הערכת התפשטות לימפוציטים מסוג T במבחנה.
  • שינויים בבלסטוגנזה של תאים - תגובת טרנספורמציה של פיצוץ לימפוציטים. לויקוציטים מודגרים עם כל מיטוגן ממקור צמחי (לקטינים). פיטומהמגלוטינין משמש לרוב למשך 72 שעות, לאחר מכן נלקחת משטח, נצבעת ומספר הפיצוצים נספר! מדד הגירוי הוא היחס בין אחוז התאים שעברו טרנספורמציה בניסוי (תרבית עם פיטומהמגלוטינין) לאחוז התאים שעברו טרנספורמציה בקבוצת הביקורת (תרבית ללא פיטומהמגלוטינין). ניתן להעריך את תגובת טרנספורמציה של פיצוץ לימפוציטים על ידי הכללת תווית רדיואקטיבית (ZN-thymndinum) בתאים המתורבתים, מכיוון שסינתזת ה-DNA עולה במהלך חלוקת התאים. הפרעות בתגובה השגשוגית מתרחשות הן בכשלים חיסוניים ראשוניים והן בכשלים משניים הקשורים לזיהומים, סרטן, אי ספיקת כליות והתערבויות כירורגיות.
  • במחקרים אלה, נבדק הביטוי של סמני הפעלה (CD25, קולטן טרנספרין - CD71) ומולקולת קומפלקס ההיסטוקומפטביליות העיקרי מסוג II HLA-DR, אשר כמעט ואינם קיימים בלימפוציטים T במנוחה. לימפוציטים T עוברים גירוי באמצעות פיטוהמגלוטינין, ולאחר 3 ימים מנותח ביטוי סמני ההפעלה בשיטת תגובת אימונופלואורסצנציה ישירה או עקיפה, ציטופלואורומטריה של זרימה, תוך שימוש בנוגדנים חד שבטיים לקולטנים המבודדים.
  • מדידת כמות המתווכים המסונתזים על ידי לימפוציטים T מופעלים [אינטרלוקין (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-אינטרפרון וכו'] באמצעות רדיואימונו-אסאי או ELISA. חשיבות מיוחדת היא להערכת ריכוז γ-אינטרפרון ו-IL-4 כסמנים של Th1 ו-Th2 בנוזל העל-תאי של תרביות מופעלות ובתוך התא. במידת האפשר, כדאי לקבוע את ביטוי הגנים לציטוקין המתאים לפי רמת חומצה ריבונוקלאית במטריצה בתא היצרן ועוצמת הביטוי של קולטנים לציטוקינים המתאימים.
    
• תגובת עיכוב נדידת לימפוציטים. לימפוציטים מסוג T רגישים בתגובה לאנטיגן מפרישים לימפוקינים, כולל גורמים המעכבים נדידת לימפוציטים. תופעת העיכוב נצפית כאשר מיטוגנים מוכנסים לתרבית תאים. הערכת מידת העיכוב מאפשרת לנו לשפוט את יכולתם של לימפוציטים להפריש ציטוקינים. בדרך כלל, תדירות הנדידה, בהתאם למיטוגן הספציפי, היא 20-80%.
• הערכת ציטוטוקסיות של תאי NK. נקבעת יכולתם של תאי הרוצח הטבעי להרוג תאי מטרה של קו אריתרומילואידי K-562. אם מעריכים ציטוטוקסיות תלוית נוגדנים, משתמשים בתאי מטרה מצופים בנוגדני IgG. תאי מטרה מסומנים ב-3H-uridine ומודגרים עם תאי אפקטור. מוות תאי המטרה מוערך על ידי שחרור הסימון הרדיואקטיבי לתמיסה. ירידה בציטוטוקסיות מתרחשת בגידולים ממאירים. במקרים מסוימים, כאשר יש צורך לחזות את יעילות הטיפול באינטרלוקינים, מעריכים את הציטוטוקסיות של תאי NK במהלך הדגירה עם ציטוקינים מסוימים.

חקר תפקוד פגוציטים

שיטות סינון

מחקר עוצמת הספיגה של תאים מיקרוביאליים על ידי פגוציטים (פגוציטוזה של חלקיקי לטקס, תרבית בדיקה של סטפילוקוקוס, אי קולי או מיקרואורגניזמים שבודדו מהמטופל). על ידי צנטריפוגה של דם שעבר הפרין, מבודד תרחיף של לויקוציטים, מוסיפים סרום מקבוצת דם IV לאופסוניזציה (אופסונינים הם חלבונים המשפרים פגוציטוזה). תרחיף המיקרוביאלים מדולל, מעורבב עם לויקוציטים ומודגם במשך 120 דקות, תוך לקיחת דגימות לניתוח 30.90.120 דקות לאחר תחילת הדגירה. מריחות נעשות מתרחיף הלויקוציטים שנאסף. נקבעים מדדי הפגוציטוזה הבאים:

• אינדקס פגוציטי - אחוז התאים שנכנסו לפגוציטוזה תוך 30 דקות ו-120 דקות של דגירה; הערך הסטנדרטי של אינדקס הפגוציט (30) הוא 94%, אינדקס הפגוציט (120) הוא 92%;
• מספר פגוציטים - המספר הממוצע של חיידקים הממוקמים תוך תאיים; הערך הסטנדרטי של מספר הפגוציטים (30) הוא 11%, מספר הפגוציטים (120) הוא 9.8%;
• מקדם מספר פגוציטים - היחס בין מספר הפגוציטים (30) למספר הפגוציטים (120); בדרך כלל 1.16;
• מדד חיידקי נויטרופילים - היחס בין מספר המיקרובים שנהרגים בתוך פגוציטים למספר הכולל של המיקרובים שנספגים; בדרך כלל 66%.

שיטות הבהרה

• מחקר יכולת חיידקידת פגוציטים במבחן עם ניטרובלו טטרזוליום (NBT) - מבחן NBT. צבע ניטרובלו טטרזוליום צהוב מתווסף ללויקוציטים. כאשר נויטרופיל סופג את הצבע, מתרחש תהליך חיזור תחת השפעת רדיקלים חופשיים של חמצן, וכתוצאה מכך נוצר צבע כחול. התגובה מתבצעת בצלחת שטוחה בת 96 בארות. תמיסת הנקס (NBT ספונטני) מתווספת לשלוש הבארות הראשונות עם תערובת של NBT ולויקוציטים, וחלקיקי לטקס מתווספים לשנייה; התערובת מודגרת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות. התוצאות נקראות ב-540 ננומטר על קורא ומבוטאות ביחידות שרירותיות. מקדם הגירוי (Kst ₎ מחושב, השווה ליחס בין הצפיפות האופטית בבארות המגורות לצפיפות האופטית הממוצעת בבארות ללא גירוי. אצל אנשים בריאים, NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stimul = 140 ± 60 CU. סריגה _קשירה = 1.78±0.36.
• מחקר מולקולות הידבקות. ציטופלואורומטריה של זרימה משמשת לקביעת הביטוי של אנטיגנים שטחיים CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. ליקויים חיסוניים עם הידבקות לקויה מתבטאים בזיהומים חוזרים, ריפוי פצעים איטי והיעדר מוגלה במוקדי הזיהום.

חקר מערכת המשלים

שיטות סינון

קביעת הפעילות המוליטית של המשלים היא מחקר של המסלול הקלאסי של הפעלת המשלים. דילולים שונים של סרום מאדם חולה ובריא מוסיפים לאדומות האדומה של האף המצופות בנוגדנים. יחידת הפעילות המוליטית היא ההופכי של דילול הסרום שבו 50% מהאדומות האדומה נהרסות. דרגת ההמוליזה מוערכת פוטומטרית על ידי שחרור המוגלובין לתמיסה. ירידה בפעילות המוליטית של המשלים נצפית בזאבת אדמנתית מערכתית עם נזק לכליות, גלומרולונפריטיס חריפה, ליקויים חיסוניים משולבים, מיאסטניה, דלקת כבד נגיפית, לימפומות, עלייה - בצהבת חסימתית, בלוטת התריס של השימוטו, שיגרון, דלקת מפרקים שגרונית, דלקת עורקים נודולרית, דרמטומיוזיטיס, אוטם שריר הלב, קוליטיס כיבית, תסמונת רייטר, גאוט.

שיטות הבהרה

• קביעת רכיבי המשלים. קביעה כמותית מתבצעת על ידי אימונודיפוזיה רדיאלית ונפלומטריה.
  המחקר אינו אינפורמטיבי אלא אם כן משתנים התכונות האנטיגניות של רכיבי המשלים.
• נקבע כי רכיב Clq של המשלים מגביר פגוציטוזה ומתווך ציטוטוקסיות תאית. ירידתו מתרחשת במחלות קומפלקס חיסוני, זאבת אדמנתית מערכתית, זיהומים מוגלתיים וגידולים.
• רכיב ה-C3 מעורב בהפעלת מסלולי המשלים הקלאסיים והאלטרנטיביים. ירידה בריכוזו קשורה לזיהומים חיידקיים ופטרייתיים כרוניים, נוכחות של קומפלקסים חיסוניים במחזור הדם או ברקמות.
• רכיב ה-C4 מעורב בהפעלת המסלול הקלאסי. ירידה בריכוזו קשורה להפעלה ממושכת של המשלים על ידי קומפלקסים חיסוניים ולירידה בריכוז מעכב ה-C1, השולט בהפעלת מסלול המשלים הקלאסי. מחסור ב-C4 מתרחש בזאבת אדמנתית מערכתית, עלייה ב-C4 מתרחשת במחלת כליות, דחיית השתלות, דלקת חריפה ומחלות במערכת העיכול.
• C5a הוא חלק קטן של מולקולת C5, אשר מתנתק ממנה כתוצאה מהפעלת מערכת המשלים. ריכוזו עולה במהלך דלקת, אלח דם, מחלות אטופיות ואלרגיות.
• מעכב Cl הוא גורם רב-תכליתי. הוא שולט על הפעלת רכיב המשלים C1, מעכב את פעילותם של קליקריין, פלסמין וגורם האגמן המופעל, Cls ופרוטאזות Or. מחסור במעכב C1 מוביל לאנגיואדמה.
• מחקרים פונקציונליים של המשלים. נסיוב הבדיקה מתווסף לסרום סטנדרטי חסר כל רכיב משלים ונקבעת הפעילות ההמוליטית של המשלים. אם הפעילות ההמוליטית לא חוזרת למצב נורמלי, פעילות רכיב המשלים הזה בסרום הבדיקה נחשבת כמופחתת.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]