תאי גזע עובריים

גילוי תאי גזע עובריים לא התרחש במקרה, אלא הופיע על הקרקע המוכנה של המחקר המדעי בתחום הביולוגיה ההתפתחותית. המונח "תא גזע" הוצג לרפואה בשנת 1908 בקונגרס של האגודה ההמטולוגית בברלין על ידי אלכסנדר מקסימוב ביחס לתאים המטופויאטיים. הרבה לפני בידוד וייצור של שורות יציבות של תאי גזע עובריים פלוריפוטנטיים, תאי גזע טרטו (קרצינומה של עוברים) שימשו במחקרים של תהליכי התפתחות מוקדמים, בעזרתם נחקרו מנגנונים לא ידועים של אמבריוגנזה, כולל רצף הביטוי של גנים מוקדמים ותוצרי חלבון של פעילותם.

אבל האם הטוטפוטנטיות של הגנום האנושי אבדה באופן בלתי הפיך בתהליך האבולוציה? לא, ואמבריוגנזה היא הוכחה לכך. אם זה כך, אז מתי, באופן עקרוני, יתממש הנתיב השני של התפתחות אבולוציונית? כנראה, כאשר האדם ייכנס לחלל, שבו תנאי הסביבה יהיו קבועים יחסית למשך זמן מספיק ארוך. אובדן רקמת העצם (דה-מינרליזציה של עצמות במצב של חוסר משקל), אשר נתון לאט מאוד לעיצוב מחדש והתחדשות, יכול להיחשב כצעד הראשון בתהליך ההסתגלות של האדם, כמין, לקיום בתנאי חלל. עם זאת, המחיר עבור הנתיב השני של התפתחות אבולוציונית יהיה שונה - המחיר עבור החזרת הטוטפוטנטיות והפלסטיות המוחלטת לכל התאים יהיה סטריליות. אז, בעולם הזה של "זיקיות אבולוציוניות", נצטרך להתרבות ללא מיוזה, על ידי הנצה. אבל נחיה זמן רב. אלמוות טלומראז הוא אלמוות של אמבה. באורגניזם רב-תאי, תאי גזע הם המצע של אריכות ימים כמותית ואיכותית.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

מקורות של תאי גזע עובריים

כיום, מקורות תאי גזע עובריים למחקר מעבדתי הם קווי טרטוקרצינומה של עכברים (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) וטרטוקרצינומה אנושית (שיבוט NTERA-2, TERA-2, H-9), כמו גם קווי ESC של Trauneon. עם זאת, הזמינות של דרכון תאים מפורט המציין את הפנוטיפ החיסוני, תוצאות ניתוח כרומוזומלי, פרופילי ביטוי mRNA, קולטנים חשופים וחלבוני איתות תוך תאיים אינה מפצה על החסרונות המשמעותיים של קווי ESC של טרטוקרצינומה - אובדן מהיר של טוטיפוטנטיות וחוסר האפשרות להשתמש בהם בניסויים קליניים, בעוד שהתמיינות מעורבת בתרבית מקשה מאוד על בידוד קו מיוחד טהור מאוכלוסיית תאים הטרוגנית. לכן, מקור קווי ה-ESC שנוצרו למטרות קליניות הוא בדרך כלל מסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט, בלסטומרים בודדים של עוברים בשלב 8 תאים, תאי מורולה בשלבים מאוחרים יותר, כמו גם תאי נבט ראשוניים.

יש לציין כי תאי טרטוקרצינומה, למרות שיש להם את התכונה של פלוריפוטנטיות, מאופיינים בפוטנציאל פלוריפוטנטי נמוך משמעותית בהשוואה לתאי ESC. שילובם עם תאים עובריים מוביל לעיתים רחוקות להיווצרות כימרות, אשר, יתר על כן, לעולם אינן יוצרות גמטות עם הגנוטיפ של תאי טרטוקרצינומה. ההערכה היא שזה נובע מהופעה תכופה של אנומליות כרומוזומליות במהלך גידול תאי טרטוקרצינומה: אובדן כרומוזום Y, טריזומיות שונות, מחיקות או טרנסלוקציות.

ניסיונות לבודד קו ESC אנושי נעשו שוב ושוב, אך משימה זו לא נפתרה, מכיוון שקשה לגשת לבלסטוציסטים אנושיים תקינים. בנוסף, שכיחות האנומליות הכרומוזומליות בבני אדם גבוהה יותר מאשר באמבריוגנזה של בעלי חיים. הרוב המכריע של עוברים אנושיים מוקדמים המתקבלים לאחר הפריה חוץ גופית מציגים פסיפס כרומוזומלי כאוטי ולעתים קרובות יש להם סטיות מספריות ומבניות. אפילו מאוחר יותר, בשלב הבלסטוציסט, רק 20-25% מהעוברים האנושיים מורכבים מתאים בעלי קריוטיפ תקין. היה כמעט בלתי אפשרי להשתמש בעוברים כאלה כדי ליצור ESCs, מכיוון שזיגוטות גודלו בדרך כלל לשלב של שני או ארבעה בלסטומרים ולאחר מכן הושתלו ברחם. רק לאחרונה יחסית פותחה טכניקה אמינה לגידול ביציות אנושיות מופרות לשלב הבלסטוציסט. הכנסת טכניקה זו לפרקטיקה של הפריה חוץ גופית לא רק הגדילה את שכיחות תוצאות ההשתלה המוצלחות, אלא גם הפכה בלסטוציסטים תקינים לנגישים יותר.

מקור נוסף לתאי גזע פלוריפוטנטיים הוא תאי הנבט הקדומים, אשר, בניגוד לאוכלוסיות האב המתקדמות יותר של האפיתל הגרמינלי, אינם מכילים בטא-אינטגרין על פני השטח שלהם, אך מבטאים פעילות גבוהה של פוספטאז אלקליין. יש לציין כי אוכלוסיות של תאי גזע שנוצרו מתאי נבט קדומים נחקרו בניסוי מאז שנות ה-80. באותה תקופה פותחה טכניקה לבידוד תאי נבט קדומים מהבסיס של בלוטת המין של עובר העכבר. התוצאות הלא מוצלחות הראשונות של גידול תאי נבט קדומים במבחנה הצביעו על חוסר התוחלת של ניסיונות אלה, שכן התאים, למרות ששרדו, לא התרבו ומתו בתוך היום הראשון. מאוחר יותר נקבע כי תאי נבט קדומים של עכברים מתרבים במבחנה רק בנוכחות גורמי גדילה פוליפפטידיים ספציפיים מסיסים וקשורים לממברנה במדיום הגידול. תוצאותיהם של מחקרים רבים הראו כי להישרדותם ולריבוים של תאי נבט ראשוניים, נוכחותם של לא רק LIF אלא גם גורמי פלדה (SIF) קשורים לממברנה ומסיסים במדיום הגידול היא הכרחית. פפטידים אלה מיוצרים על ידי תאים סומטיים של עוברים הומוזיגוטים למוטציה Steel, ואחד מהם הוא ליגנד של הפרוטו-אונקוגן cKit.

לתאי נבט ראשוניים של יונקים ובני אדם מקורם מחוץ לגונדום והם מקור ההתפתחות השבטית של קו תאי הנבט. מקור קו תאי הנבט הקדמוני, כמו גם כל הרקמות העובריות והמזודרם החוץ-עוברי, הוא האפיבלסט (אקטודרם ראשוני) של עוברים מוקדמים, בעל ארגון מבני פסיפי. באמצעות שיטת הסרה מיקרוסקופית של חלקים שונים של העובר המוקדם, נקבע אזור לוקליזציה באפיבלסט של השיבוט של תאי נבט קדמוניים שעברו תהליך התפתחותם. באמצעות רודמין דקסטרן, ששימש כסמן תאים, נקבע כי תאי הנבט הקדמוניים ממוקמים באזור הפרוקסימלי של האפיבלסט, ליד האקטודרם החוץ-עוברי. קו תאי הנבט הקדמוני נובע משיבוט בן 45 תאים, שהקצאתו מתרחשת ממש בתחילת הגסטרולציה. לאחר מכן, השיבוט מתבודד, ובמהלך הגסטרולציה תאי הנבט הראשוניים נכנסים למזודרם החוץ-עוברי ונמצאים בבסיס ראש האלנטואיס, מאחורי הפס הראשוני. משם תאי הנבט הראשוניים נודדים לכיוון החלק הגחוני של האנדודרם במעי האחורי ואז נעים באופן פעיל לאורך המסנטריום, ומאכלסים את רכסי הגניטלים בסוף הנדידה. במהלך הנדידה, כמו גם ב-2-3 הימים הראשונים של המיקום בראש הגונדה, תאי הנבט הראשוניים מתרבים באופן פעיל ועוברים שמונה מחזורי שכפול. אם בתחילת הנדידה ישנם כ-50 תאי נבט ראשוניים, אז ברכסי הגניטלים של עוברי עכברים בני שנים עשר ימי התפתחות מספר תאי הנבט הראשוניים עולה על 25,000.

הדמיון התפקודי של תאי ESC ותאי נבט ראשוניים מתבטא בשילוב המלא של האחרונים בבלסטוציסט עם החלפת מסת התאים הפנימית והתפתחות מלאה שלאחר מכן של העובר, שרקמותיו מורכבות רק מצאצאי תאי הנבט הראשוניים. בתכונות אחרות, תאי נבט ראשוניים של עכברים התגלו גם הם זהים ל-ESC, והדגימו את היכולת להתמיין במגוון כיוונים, ליצור גופי עובר במבחנה, וליצור טרטומות in vivo כאשר ניתנות תת עורית לעכברים בעלי לקות חיסונית, בדומה לטרטומות אשכים ספונטניות בעכברים 129/ter.

נמצא שכאשר מוסיפים למדיום LIF, SIF קשור לממברנה ו-SIF מסיס, תאי נבט ראשוניים מבודדים של עוברי עכברים בני 8 ימים שורדים ומתרבים בתרבית במשך 4 ימים, אך לאחר מכן מתים. יתר על כן, התקופה בה נצפה מוות של תאי נבט ראשוניים בתרבית חופפת לשלב ההתפתחות של עוברי עכברים (12.5-13.5 ימים) כאשר תאי נבט ראשוניים נקביים נכנסים למיוזה ביסודות הגונדות, וחלוקות מיטוטיות נחסמות בתאי נבט ראשוניים זכריים. עם זאת, אם מוסיפים למדיום לא רק את גורמי הגדילה LIF ו-SIF, אלא גם FGF2, תאי הנבט הראשוניים ממשיכים להתרבות, ומושבות של תאים המסוגלים להתרבות גם לאחר הסרת גורמי גדילה (SIF ו-FGF) מהמדיום נוצרות בתת-התרבויות. ניתן לגדל תאים כאלה במשך זמן רב על מצע של פיברובלסטים עובריים מבלי להוסיף את גורם הגדילה המסיס LIF. הוצע לקרוא לקווי תאים יציבים אלה המתקבלים מתאי נבט ראשוניים בשם תאי נבט עובריים. מונח זה אינו מוצלח כלל, מכיוון שאי אפשר להשיג תאי נבט עובריים המסוגלים לבצע שלבים נוספים של אואוגנזה או יצירת זרע בעת גידול תאי EG. זאת בשל העובדה שקווי תאי EG, למרות שמקורם בתאי נבט ראשוניים, רוכשים את התכונות של תאי גזע פלוריפוטנטיים עובריים בתרבית, מאבדים את היכולת להתחבר לשושלות נבט. במילים אחרות, תאי נבט ראשוניים, כאשר הם גדלים, מאבדים את התכונות של מבשרי הגמטות והופכים לתאים פלוריפוטנטיים דמויי ESC.

צוין כי טרטומות אינן נוצרות כאשר תאי EG מוכנסים לעכברים בעלי חסינות חיסונית. ההנחה היא שאובדן היכולת של תאי EG אנושיים להוליד טרטומות נובע מהעובדה ששורות אלו לא נוצרו ישירות מתאי נבט ראשוניים בתרבית, אלא התקבלו מתאים שבודדו מגופים עובריים. לכן, ייתכן שהן צאצאים של תאים פלוריפוטנטיים, אך כבר מחויבים.

יש לציין כי ישנם הבדלים מהותיים בין תאי EG לתאי נבט ראשוניים. האחרונים אינם מאפשרים קבלת עוברי עכבר כימריים, דבר המצביע על חוסר היכולת של תאי נבט ראשוניים להשתלב במסת התאים הפנימית או בטרופקטודרם. מאפייני אוכלוסיית תאי הנבט הראשוניים דומים יותר לקווים מחויבים של תאים סומטיים של עוברים מאוחרים יותר, שהחדרתם לבלסטוציסט גם אינה מובילה להיווצרות עוברים כימריים.

שינוי בטכניקת גידול גופי עובר שהתקבלו על ידי צבירה של תאי EG אפשר להשיג אוכלוסייה נוספת של תאים פלוריפוטנטיים, הנקראים "תאים שמקורם בגוף עוברי" (EBD cells), באמצעות סלקציה במצע סלקטיבי. יכולתם של תאי EBD להתרבות בתרבית במשך זמן רב אפשרה ליצור שורות תאים יציבות של תאים מחויבים. הושגו שיבוטים של תאים המבטאים מגוון רחב של סמני mRNA וחלבון של תאים מיוחדים. גישה זו הוכיחה בסופו של דבר שתאי נבט ראשוניים אנושיים הם פלוריפוטנטיים ומתמיינים במבחנה לסוגי תאים שונים: נוירונים, נוירוגליה, אנדותל כלי דם, תאים המטופויאטיים, תאי שריר ותאי אנדודרם.

מקורות חלופיים לתאי גזע עובריים

מקור חלופי לקווי ESC אנושיים עשוי להיות תאים היברידיים. השתלה ברחם של פרות בהריון מדומה של מבנה הטרוגני המתקבל על ידי איחוי אלקטרופורציה של תאים סומטיים של העובר האנושי עם ביצית פרה שממנה הוסר קודם לכן הגרעין מאפשרת קבלת מסת תאים פנימית מעובר מלאכותי בשלבי התפתחות טרום-השרשה. לשם כך, בשלב הראשון מתקבלת בלסטוציסט מביצית פרה עם גרעין תא אנושי מושתל.

בשלב השני, מבודד אמברובלסט מהבלסטוציסט, וממנו מבודדים תאי ESC בשיטת תומסון. ראוי לציין כי התוצאות הטובות ביותר בבידוד קווי ESC בשיטה זו התקבלו באמצעות גרעינים של תאי זקיקים או תאי נבט ראשוניים שנשארים בגוף האדם במצב של תרדמת חורף. זאת בשל העובדה שגרעיני תאים אנושיים המושתלים לביצית פרה חייבים להיות בעלי טלומרים לא מקוצרים ופעילות טלומיאז גבוהה, מה שעוזר למנוע הזדקנות מוקדמת של שיבוטי ESC המתקבלים מביצית היברידית (Repin, 2001). ידוע שחלבוני הסמן התוך-תאיים החשובים ביותר של ESC הם Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, השייכים לחלבוני משתיקי כרומטין. משתיקי הדמה מספקים חבילה קומפקטית במיוחד של הטרוכרומטין, המונעת היווצרות של לולאות אאוכרומטין. אריזת הכרומטין בתיווך חלבונים אלה מתואמת עם הטוטפוטנטיות של גנום ה-ESC. עד היום נקבע כי ביציות בקר ובני אדם בוגרים הן הסוג היחיד של תאים מיוחדים המכילים ריכוזים גבוהים של חלבוני משתיק בציטופלזמה. על בסיס זה, פותחה שיטה להשגת תאי ESC היברידיים על ידי העברת גרעיני תאים סומטיים לתוך ביציות בקר שעברו גרעין. מחקרים ראשוניים במבחנה הראו כי הציטופלזמה של ביציות בקר משיבה את הטוטיפוטנטיות של גנום גרעיני התאים הסומטיים האנושיים לאחר 12-24 שעות של טיפוח.

מעניינים במיוחד הנתונים על הייחודיות של התפתחות טרום-השרשה של עוברים אנושיים, דבר המצביע על החלפה מאוחרת יותר של תאים טוטיפוטנטיים על ידי אוכלוסייה של תאים פלוריפוטנטיים מאשר בעכברים. מחקר על טרנספורמציות תאיות הראה שתאי טרופובלסטים נובעים גם מתאי מסת התא הפנימית של בלסטוציסטים אנושיים, בנוסף לתאי תאי...

ידוע שבשלב הבלסטוציסט נוצרות שתי אוכלוסיות תאים בעלות מחויבות שונה. אחת מהן יוצרת את השכבה החיצונית של הבלסטוציסט - הטרופקטודרם, אשר נגזרותיו הן תאי הטרופובלסט ורכיבים עובריים אחרים של השליה. אוכלוסיית התאים השנייה מקובצת למסה צפופה הנוגעת למשטח הפנימי של הטרופקטודרם. נגזרות אוכלוסיית התאים של מסת התאים הפנימית הן כל הרקמות והיסודות של איברי העובר. בשלב הבלסטוציסט המאוחר, האנדודרם החוץ-עוברי נוצר ממסת התאים הפנימית ונוצר האפיבלסט (אקטודרם ראשוני). במקרה זה, תאי האפיבלסט שומרים על פלוריפוטנטיות, בעוד שיכולת ההתמיינות של תאי האנדודרם החוץ-עוברי מוגבלת.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

השגת תאי גזע עובריים אנושיים

עד לאחרונה, האמינו כי בלתי אפשרי להשיג תאי ESC מטרופובלסט. עם זאת, שורה של תאי גזע טרופקטודרם דיפלואידיים שבודדו מבלסטוציסט מתרבים והופכים לתאי גזע במצע המכיל FGF2 והפרין במקום LIF. אם FGF2 מוסר מהמצע, תאי הטרופקטודרם מפסיקים להתרבות, מתחילה בהם שכפול כרומוזומים, ואלמנטים תאיים של הטרופקטודרם הופכים בהדרגה לתאי טרופובלסט ענקיים. סביר להניח ש-LIF אינו מגרה את התפשטות תאי הטרופקטודרם בשל העובדה ש-FGF2 מפעיל מנגנון איתות טרנס שונה, מכיוון ש-FGF2, הנקשר לקולטן הפלזמה (FGFR2), מפעיל קינאזות MAP בציטופלזמה - ERK1 ו-ERK2. כתוצאה מכך, כאשר מסלול איתות אחד (LIF - gpl30 - JAK kinase - STAT3) מופעל בתאי בלסטוציסט, תאי מסת התא הפנימית הופכים לתאי ESC פלוריפוטנטיים, וכאשר המנגנון השני של התמרת אותות טרנסממברנליים (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1/ERK2) מופעל, נוצרים תאי גזע טרופקטודרם בבלסטוציסט. בחירת מסלול האיתות, בתורה, תלויה בפעילות הגן oct4. גן זה, השייך לתחום POU, ממוקם בלוקוס t של אוטוזום 17 ומתבטא במהלך האואוגנזה, במהלך תקופת הביקוע, כמו גם בתאי מסת התא הפנימית של הבלסטוציסט ובתאי הנבט הראשוניים. התפקיד הפונקציונלי של הגן oct4 הוא לקודד גורם שעתוק הדרוש להופעת תאים פלוריפוטנטיים, להתמיינותם ולדה-התמיינותם.

ביטוי הגן oct4 בתאי תאי...

בניסוי, לא ניתן להעביר תאי ESC לקו במהלך גידול בלסטומרים טוטיפוטנטיים בשלב החיתוך, כמו גם בשלב הגסטרולציה ובשלבים מאוחרים יותר של התפתחות העובר. תאי ESC של עכברים מבודדים בדרך כלל ביום ה-3.5-4.5 להריון, התואם לשלב השישי (בלסטוציסט חד-שכבתי) ולשלב השביעי (בלסטוציסט דו-שכבתי - גליל ביצה מוקדם) של אמבריוגנזה תקינה. ברור שרק בתקופה שלפני ההשרשה עוברי עכברים מכילים אוכלוסיות תאים המסוגלות להפוך לתאי ESC. כתוצאה מכך, בידוד קווי ESC אפשרי רק בשלבים מסוימים של האמבריוגנזה. הזיגוטה והבלסטומרים הנובעים במהלך החיתוך הם טוטיפוטנטיים, מנקודת מבט של האפשרות לפתח עובר בר-קיימא עם ממברנות עובר ושליה. אובדן העוצמה המלאה של תאי הנבט מתחיל בשלב המורולה המאוחר, כאשר מעבר נוסף של בלסטומרים תלוי במיקומם. בלסטומרים מורולים מוקדמים שומרים על טוטיפוטנטיות, שכן מניפולציות ניסיוניות עם שינויים בלוקליזציה שלהן, כגון היפוך מיקומן, אינן מונעות את התפתחותו של עובר מלא.

נקבע כי יעילות בידוד תאי גזע עובריים (ESCs) לתוך קו תאי גזע מושפעת ממצב הבלסטוציסטים בזמן הוצאתם מהמערכת. השימוש בבלסטוציסטים לאחר מידול דיאפאוזה של שבעה ימים במערכת הרבייה של עכברים שעברו כריתת שחלות ביום ה-3.5 להריון וקיבלו פרוגסטרון מאפשר בידוד מוצלח יותר של שורות תאי גזע עובריים. ההנחה היא שבתנאים כאלה מספר הבלסטומרים היוצרים את מסת התא הפנימית גדל. ייתכן גם שמחזור התא מתארך ורוב הבלסטומרים נכנסים לשלב G0.

בנוסף, יצירת קווי ESC פלוריפוטנטיים יציבים תלויה בגנוטיפ של העוברים: תאי ESC מבודדים בקלות יחסית מבלסוציסטים של קו עכברים 129, קשה הרבה יותר להשיג אותם באמצעות עכברי CS7BL/6, וכמעט בלתי אפשרי לבודד קו ESC מבלסוציסטים של עכברי CBA/Ca. ברור שלעוברים מוקדמים יש כמה מאפיינים גנטיים המשפיעים על התפתחות קו ESC פלוריפוטנטי. אף על פי כן, בעת גידול אפיבלסטים מבודדים, כמו גם על ידי ברירה סלקטיבית של תאים מתמיינים, קווי ESC בכל זאת בודדו מעוברים מוקדמים של עכברי CBA/Ca.

טכניקה סטנדרטית מוכחת להשגת קווי ESC מבלסטוציסטים ניתנת במדריכי מעבדה על טכניקת הניסויים עם עוברים מוקדמים. ניתן להשיג קווי ESC ניסיוניים גם על ידי תרבית אפיבלסט מבודד (אקטודרם ראשוני) של עוברי עכברים בני 4.5 ימים באמצעות טכניקה מיקרוכירורגית מורכבת למדי ותנאי תרבית שונה. עצימות העבודה של הליך זה מוצדקת, מכיוון שתדירות היווצרות קווי ESC במקרה זה התבררה כגבוהה משמעותית מאשר בעבודות עם מסת התא הפנימית של הבלסטוציסט.

כדי לבודד קווי ESC, כל שיבוט מועבר למיקרוגלה, מגדלים אגרגט של 40-60 תאים, ולאחר מכן מפזרים שוב. חזרות מרובות של הליך זה מאפשרות לנו להשיג קו ESC מונצח עם קצב התפשטות מקסימלי של תאים נורמוקריוטיפיים המחוברים לפלסטיק, אשר שומרים על טוטיפוטנטיות ופעילות טלומראז גבוהה לאחר 50-100 מעברים. בתהליך תחזוקת קווי ESC, הסכנה הגדולה ביותר היא זיהום המדיום או הסרום עם אנדוטוקסינים חיידקיים - אפילו ריכוזים זעירים של אנדוטוקסין במדיום התרבית גורמים למוות המוני של תאי נבט לא בשלים. עם ניטור קפדני של צמיחה ליניארית ופיזור בזמן, תאי ESC בתרבית מסוגלים לחלוקה סימטרית, שבה שני תאי הבת נשארים פלוריפוטנטיים ומסוגלים לבצע מספר בלתי מוגבל של מחזורי תאים, תוך שמירה על קריוטיפ דיפלואידי ועוצמה כוללת.

ניתן לבצע סלקציה של אוכלוסייה טהורה של תאי ESC אנושיים לאחר טרנספקציה של הגנום שלהם עם מולקולות DNA רקומביננטיות המכילות את הגן המקודד לסינתזה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). ביטוי GFP עולה כאשר תאי ESC גדלים בתנאים התומכים בהתפשטות שלהם, ואילו עם תחילת ההתמיינות רמת הביטוי של גן זה יורדת, מה שמאפשר סלקציה של שורות תאים פלוריפוטנטיות יציבות וטהורות על מצע סלקטיבי. בעת גידול תאי ESC מבודדים באמצעות סלקציה של GFP, תדירות היווצרות המושבות עולה פי כמה, מכיוון שההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית החזקה של תאים ממוינים מתבטלת בתנאי תרביות הסלקציה.

תרגום תאי גזע עובריים אנושיים לקו מתבצע באמצעות שיטת בידודם מעוברים טרום-השרשה (בשלב של 80-120 תאים), שנותרו לאחר הליך ההפריה חוץ גופית. למטרה זו, עוברים "עודפים" שהתקבלו באופן מלאכותי מפוזרים מכנית במדיום דלבקו-איגל. לאחר סימון התאים עם נוגדנים חד שבטיים סלקטיביים באמצעות תווית פלואורסצנטית, מבודדים את תאי האמברובלסט. האמברובלסט מפוזר לתאים בודדים באמצעות תערובת דיספאזה-קולגנאז. התאים המבודדים גדלים במדיום מיוחד (80% מדיום דלבקו + 20% סרום עגל עוברי בנוכחות 500 מיקרוגרם/מ"ל IL-6, LIF ו-SCF) מעל שכבת הזנה חד-תאית של פיברובלסטים עובריים של 3 המעברים הראשונים. במקרה זה, הישרדותם והתפשטותם של תאי גזע ותאי אב נשמרות הודות להשפעת IL-6, LIF ו-SCF. במצע כזה, תאי ESC גדלים כשיבוטים בתרחיף של תאים כדוריים לא מחוברים, אותם יש לנתק באמצעות פיפטה רכה וחוזרת על עצמה. שיבוטים חדשים מופיעים בתרבית התרחיפה ביום ה-5-7. קצב הגדילה המרבי של תאי ESC מושג על ידי דיסוציאציה חוזרת ונשנית של שיבוטים בשלב של 10-15 תאים. לאחר מכן, כל שיבוט מועבר למיקרוגלה וגודל למצב של 40-50 תאים. ההליך חוזר על עצמו פעמים רבות במעברים, תוך הגדלת נפח התרבית לצפיפות של 5-10 מיליון תאים לכל צלחת של 6 ס"מ. באמצעות מעבר כזה, תומסון בודד 10 שיבוטים אלמותיים של תאי ESC אנושיים, אשר לאחר 100 מעברים שמרו על פעילות טלומראז גבוהה, יכולת להתרבות במרץ, מאפיינים פנוטיפיים מינימליים ועוצמה כוללת עם היכולת להתמיין לכל אחת מ-350 שורות תאים מיוחדות שמקורן באקטו-, מזו- ואנדודרם. ההתמיינות של תאי ESC אנושיים החלה (עם החלפת מצע, הוספת סרום וסילוק LIF) עם הצמדות תאים למצע, דבר המצביע על התפתחות שלד התא וביטוי של קולטני הידבקות. חשוב לציין, עם התפשטות בלתי מוגבלת, תאי ESC אנושיים שמרו על קריוטיפ תקין.

השיטה השנייה לבידוד קווי ESC אנושיים מבוססת על שימוש בתאי נבט ראשוניים. מחקרים ניסויים הראו שניתן להשיג קווי תאי E מקפלי איברי המין של עוברי עכברים בני 12.5 ימים. עם זאת, במקרים אלה תדירות היווצרות קווי תאי אב הייתה נמוכה משמעותית מאשר בניסויים עם עוברים מוקדמים יותר. יחד עם זאת, תאי נבט ראשוניים מהגונדות של עוברי עכברים בגיל הריון של 13.5 ימים אינם מסוגלים להפוך לקווים כלל.

הקווים היציבים הראשונים של תאי EG אנושיים פלוריפוטנטיים התקבלו מגונוציטים ראשוניים שבודדו מגונדות של עוברים בני 5-9 שבועות. התאים המבודדים גודלו על מצע של פיברובלסטים עובריים עכברים מומתים במדיום DMEM עם סרום עוברי בתוספת מרקפטואתנול, פורסקולין וגורמי גדילה אנושיים רקומביננטיים (FGF ו-LIF). לאחר 7-12 ימים הופיעו מושבות רב-תאיות בתרבית, התואמות לתאי EG אנושיים על ידי מאפיינים מורפולוגיים וסמנים מולקולריים. לאחר הצטברות, תאים אלה יצרו גופי עובר, שעם התפתחותם הופיעו תאים מיוחדים האופייניים לנגזרות של שלוש שכבות הנבט. במהלך 10-20 מעברים, קווי תאי EG שמרו על קריוטיפ תקין ולא איבדו פלוריפוטנטיות.

כמו כן, הוכח כי הפעולה המשולבת של LIF, גורמי פלדה הקשורים לממברנה ומסיסים, ו-TGF-b משנה את תוכנית ההתפתחות של תאי נבט ראשוניים. במקום להפסיק את החלוקות המיטוטיות ולהתחיל להתמיין לקראת אואוגנזה או יצירת זרע, תאי נבט ראשוניים ממשיכים להתרבות. לאחר מספר מחזורי מיטוזה נוספים, הם הופכים דומים לתאי אפיבלסט, ומאבדים את תכונותיהם של תאי נבט קודמנים, והופכים לתאי גזע עובריים פלוריפוטנטיים.

כך, בשנת 1998, בודדו לראשונה שורות של תאי נבט ראשוניים מהחלק הגניטלי של רקמת נתיחה שלאחר המוות של עובר אנושי. באמבריוגנזה אנושית, תאי נבט ראשוניים מופיעים בשק החלמון בשבוע השלישי להתפתחות, ובשבועות הרביעי-חמישי, תאים אלה נודדים לאזור החצץ הגניטלי, שם הם יוצרים אוכלוסיות רדומות של גונוציטים ראשוניים. במצב לא פעיל, תאי נבט ראשוניים נשמרים בעובר עד הלידה. שורות של תאי נבט ראשוניים מבודדות מחצץ הגניטלי העוברי של עוברים בני 5-9 שבועות, כאשר הרקמה המופקת ממנה מטופלת באופן זמני בתערובת של קולגנאזות מסוג IV-V, היאלורונידאז ו-DNase כדי להגדיל את התפוקה הכמותית והאיכותית של תאים. תאי נבט ראשוניים ברקמת החצץ הגניטלי העוברי מוקפים בתאי סרטולי סטרומליים (מזנכימליים). המטרה הפונקציונלית של תאי סרטולי היא לייצר גורמים אנטי-אפופטוטיים (ליגנד Fas), מיטוגנים וחומרים מדכאי חיסון המגנים על תאי נבט מפני התקפות חיסוניות של הגוף. בנוסף, המיקרו-סביבה הסטרומלית של פקעת הגניטלית ממלאת תפקיד חשוב בהבשלת הגמטות. תאי הנבט הראשוניים המבודדים נשתלים בתרבית מעל שכבת סטרומלית מזינה המורכבת מפיברובלסטים עובריים של שלושת המעברים הראשונים. השילוב היעיל ביותר של מיטוגנים הוא קומפלקס המורכב מ-LIF, FGF ופורסקולין (ממריץ של יצירת cAMP). ריבוי תאי נבט ראשוניים במבחנה דורש הוספת סרום עוברי, שבנוכחותו רביית הגנוציטים הראשוניים בתרבית מלווה ביצירת שיבוטים של תאים כדוריים שאינם מחוברים למצע.

במכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב, בהתבסס על סיכום הנתונים הקיימים על שיטות לבידוד קווי תאי גזע אנושיים (ESC) מבלסטוציסטים, התקבלה מסקנה ראשונית כי בידוד מוצלח של תאי גזע סביר ביותר בעת תרבית בלסטוציסטים עם מסת תאים פנימית בנויה היטב (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). מנקודת מבט זו, המקור האופטימלי של תאי גזע ליצירת קווים הם בלסטוציסטים אנושיים ביום החמישי להתפתחות, מהם יש להסיר בזהירות את הטרופקטודרם בעת בידוד מסת התאים הפנימית. את מסת התאים הפנימית המבודדת, המורכבת מ-30-35 תאים בשלב זה, יש לגדל על מצע של פיברובלסטים עובריים של עכברים, שהוא תנאי מכריע להיווצרות מושבות תאי גזע בתרבית.

ניתוח מאפיינים פנוטיפיים של תאי גזע עובריים

מעניין במיוחד הניתוח ההשוואתי הבין-מיניאלי של המאפיינים הפנוטיפיים של תאי גזע עובריים (ESCs). נמצא כי מושבות תאי גזע עובריים אנושיים הן אשכולות צפופים של תאים שטוחים דמויי אפיתל, בעוד שגופי עובריים עכבריים מורכבים מקונגלומרט רופף של תאים מעוגלים. בתאי גזע עובריים אנושיים, מדד יחס הגרעין-פלזמה נמוך יותר מאשר בתאי גזע עובריים עכבריים. תאי גזע עובריים של קופים יוצרים מושבות שטוחות יותר של תאים עם קצוות לא אחידים. תאים בודדים נראים בקלות בשיבוטים מוקדמים של תאי גזע עובריים של פרימטים. תאי גזע עובריים מתרבים של כל מיני בעלי החיים שנחקרו אינם מבטאים מולקולות MHC מסוג I ו-II. יחד עם זאת, תאי גזע עובריים אנושיים נותנים תגובה חיובית לנוגדנים TERA 1-60 ו-GCTM-2, דבר המצביע על נוכחות של פרוטאוגליקנים של קרטין/כונדרואיטין סולפט על פני השטח שלהם, האופייניים לתאי גזע של קרצינומה עוברית (טרטו). ביטוי הגן oct4 בתאי ESC של כל מיני בעלי החיים מצביע על כך שלמרות הבדלים פנוטיפיים, אותה קבוצה של גנים האחראים לשמירה על פלוריפוטנטיות מופעלת ככל הנראה בתאי ESC של בני אדם ועכברים (Peru, 2001). בנוסף, קווי ESC שבודדו מעוברי חולדה, חזיר, ארנבת, פרימטים ובקר הם בעלי מאפיינים מורפולוגיים דומים, קבוצה דומה של סמני זיהוי מולקולריים ומנגנון מולקולרי כמעט זהה ליישום תוכניות אמבריוגנזה, מה שמאפשר לנו לבחון מחדש את בעיית השתלת קסנו.

בניגוד לאמבריוגנזה רגילה in vivo, ריבוי של תאי ESC במבחנה אינו מלווה ביצירת שכבות נבט ומתרחש על רקע חסימה של Hoxgenes הומאוטיים, כלומר, ללא אורגנוגנזה. מכיוון שגני הפילוח אינם מתפקדים, בלתי אפשרי לשחזר תקופות של אמבריוגנזה כמו הנחת סומיטים, פילוח עוברים, היווצרות שק החלמון, האלנטואיס ואיברים ורקמות זמניים אחרים בתרבית ESC. תאי ESC מתורבתים נראים כאילו קפאו בתחילת תהליך היווצרותם של 350 קווי הגבלה של תאים מיוחדים. לפיכך, שיבוט של תאי אב בת ותאי ESC מקומיים במרכז מייצגים רק מודל של עובר, שבמהלך התפתחותו נוצרות בו זמנית שורות שונות של תאים מיוחדים באזורי רקמה שונים, שמקורם, עם זאת, בתאי קדם משותפים. למרות הרמה המינימלית של קולטנים על פני השטח של תאי ESC, הם שומרים על היכולת לבצע תהליכים מורפוגנטיים פרימיטיביים, המחקים את המבנים הנפחיים של עובר מוקדם: תרחיף של תאי ESC באגרגטים של תרבית ויוצר מבנים הדומים לבלסטוציסטים או אפילו עוברים מאוחרים יותר (גלילי ביצים). אגרגטים תרחיף כאלה נקראים בהתאמה גופים עובריים פשוטים ומורכבים.

בהתמיינות מעורבת, גנים מוקדמים של האקטודרם (oct3, fgf-5, nodal), האנדודרם (gata-4), המזודרם (brachyury), המזודרם הקרדיוגני (pkh-2.5), הצינור העצבי (msx3) וההמטופויזה (elkf) באים לידי ביטוי בו זמנית בתאים שונים של גוף עוברי אחד. באמצעות שילובים שונים של גורמי גדילה וציטוקינים לפעולה ממוקדת על היווצרות תאי שכבת הנבט במבחנה, ניתן היה במספר מקרים להשיג גופים עובריים שבהם גנים של אקטודרם או מזודרם באו לידי ביטוי באופן מועדף, מה שפותח את הדרך למידול גסטרולציה ושלבי האורגנוגנזה הראשוניים.

גדילה שבטית של תאי ESC היא עדות לחלוקת תאים אסימטרית, שבה רק תא ESC אחד במרכז השיבוט שומר על פוטנציאל התפשטות בלתי מוגבל, בעוד שתא הבת השני מייצר דור של תאי אב שכבר עוברים התמיינות. לכן, קצב התפשטות השיבוט בפריפריה של הגוף העוברי גבוה יותר מאשר במרכז. התאים השוליים של השיבוט הגדל עוברים התמיינות ספונטנית לא מסודרת, נודדים או מתים על ידי מנגנונים אפופטוטיים. אירועים אלה קובעים את גורל השיבוט: אם קצב ההתפשטות עולה על קצב הנדידה ומוות התאים האפופטוטיים, השיבוט ממשיך לגדול בגודלו, התייצבות מתרחשת כאשר קצב האפופטוזיס וקצב היווצרות התאים החדשים שווים, ורגרסיה מתרחשת כאשר היחס בין תהליכים אלה הפוך. תאי אב מתחלקים באופן סימטרי, כלומר, שני תאי הבת מתמיינים לאחר מכן לקווי תאים בוגרים ומתמחים. היחס בין תאי ESC לתאי אב משתנה, אך מספר תאי ה-ESC הוא תמיד רק חלקיק של אחוז מאוכלוסיית תאי האב. לכן, רק פיפטה זהירה ופירוק בזמן של שיבוטים יכולים להגדיל את מספר תאי ה-ESC בתרבית. פירוק של שיבוטים בשלב של 10-12 תאים התגלה כיעיל ביותר להשגת התפוקה המקסימלית של תאי... לאחר מכן, מופיעים במבנים אלה אנגיובלסטים ותאי אנדותל של נימים הגדלים. בשלבים הסופיים של ההתמיינות הספונטנית, מתפתחים תאים שונים שהתמיינו באופן סופני מהתאים הפנימיים של הגוף העוברי, כולל נוירונים, אלמנטים גליאליים, קרדיומיוציטים, מקרופאגים ואדמוציטים. במידה מסוימת (בהתחשב בהיפוך המרחבי של היווצרות שכבות רקמת הנבט), באמצעות גופים עובריים, ניתן לחקור תהליכים מורפוגנטיים במבחנה ולנתח את המנגנונים המולקולריים של התקופות הראשוניות של ציטו-התמיינות עוברית,כמו גם לקבוע את תפקידם של גנים ספציפיים ביישום תהליכים אלה.

לפיכך, בתוך השיבוט ישנם תאים בהם התגלו תוכניות פיתוח גנטיות שונות - תאי ESC, תאי אב מוקדמים ואוכלוסיות אב מתמיינות. גידול תאי ESC בשיטת טיפה תלויה או תרבית המונית ללא שכבת הזנה וללא הוספת LIF למצע מוביל בהכרח להיווצרות גופי עובר. המורפולוגיה של תאי השכבות החיצוניות והפנימיות של גופי עובר שונה. השכבה החיצונית מורכבת מתאים גדולים ומסועפים. פני השטח שלהם הפונים לסביבה מכוסים במיקרוווילי רבים. השכבה החיצונית של התאים מופרדת מהשכבה הפנימית על ידי קרום בסיסי הדומה לקרום רייכרט, בעוד שתאי השכבה הפנימית של גופי עובר הם אפיתל עמודי. מבחינה מורפולוגית, השכבה הפנימית, למרות שהיא מכילה תאים רבים המתחלקים, דומה יותר למושבות לא ממוינות של תאי ESC.

מאפייני תאי גזע עובריים אנושיים

היעדר אינטראקציות איתות פרנכימטיות-מזנכימליות על רקע חסימת גנים של הומאוזיס מוביל לגדילה לא מסודרת של תאי ESC בתרבית, שכן הדבר משבש את היווצרותם והתפתחותם של התשתית של איברים זמניים. גדילה לא מאורגנת והתמיינות ספונטנית לא מסודרת של תאי ESC בתרבית נובעים מהיעדר סימון מזנכימלי של המסגרת הסטרומלית של איברים עתידיים: במבחנה, בהחלט ניתן ליצור מיליוני הפטוציטים, אך בלתי אפשרי להשיג אונת כבד אחת הכוללת אלמנטים מבניים ותפקודיים כמו סינוסים, חללי דיס ותאי קופפר.

ההערכה היא שהפלוריפוטנטיות של תאי ESC מתממשת אך ורק באמבריוגנזה עם היווצרות רקמות ואיברים של העובר, בעוד שהשליה וחבל הטבור הם נגזרות של הטרופובלסט. תאי ESC הכלואים בקרום הטרופקטודרמלי מייצרים ברצף שיבוטים של תאים זמניים המיישמים את תוכנית הפיתוח באמצעות mRNA קומבינטורית של המטריצה הטופוגרפית הנפחית של נוכטייב, אשר קובעים מראש את הסידור המרחבי, הצורה והגודל, את מספר התאים של האיברים הזמניים והסופיים, כמו גם את הרכבת הפרנכימה ליחידות מבניות ותפקודיות. יחד עם זאת, תאי ESC נותרים סוג התאים היחיד שבו המנגנון המולקולרי ליישום הפוטנטיות שלהם מנותק לחלוטין מתוכנית הפיתוח הגנטית, וה-ESC עצמם משולל היכולת לתקשר עם תאים אחרים עקב חסימה של תפיסת קולטנים ומערכות טרנס-איתות. עם זאת, הפעלה נאותה של תאי ESC מובילה להתפתחות שלב אחר שלב של תוכנית האמבריוגנזה, המסתיימת בלידתו של אורגניזם מלא, המורכב ממיליארדי תאים, מוכן לחיים מחוץ לרחם. במסלול קצר טווח אך בלתי נתפס ארוך טווח זה במרחב התאי, מתעוררות באופן בלתי נמנע טעויות הן במנגנונים המולקולריים המבטיחים את הפעילות החיונית של תאים והן בתוכניות השולטות בהתפשטות, התמיינות והתמחות שלהם. לכן, בפרמקוגנומיקה מודרנית, מחלות של המבנה המולקולרי ומחלות של תכנות תאים נחשבות בנפרד. יתר על כן, פעולתן של רוב התרופות החדשות מכוונת לתיקון תוכניות ההתמיינות, ההתפשטות והאורגנוגנזה, כמו גם התחדשות איברים ורקמות. באורגניזם בוגר, תאי גזע/תאי אב המושתלים למוח, לכבד, לטחול, למח העצם ולאיברים אנושיים אחרים כדי לשקם פרנכימה פגומה של איברי המקבל על ידי התמיינות והתמחות של תאי תורם על גבי המטריצה המזנכימלית המשומרת. במהותו, תוכנית הטוטיפוטנטיות מתחילה להתממש ברמת הגנום של הביציות, הזיגוטות והבלסטומרים; עם זאת, תאים אלה טרם שובטו ועברו מעבר בכמויות הדרושות לצורכי הרפואה הניסויית והמעשית. לכן, תאי ESC נותרים מקור ייחודי למידע גנטי המכיל קודים למפה תלת-ממדית של העובר וקודים להגבלה ליניארית של שורות תאים מיוחדות במהלך הגסטרולציה.

הפוטנציאל הרגנרטיבי הכמעט בלתי מוגבל של תאי... זאת בשל היעדר או ביטוי נמוך מאוד של גנים טרנס-איתות. במהלך תקופת ההתמיינות המושרה בגנום ESC, 18 גנים מתפקדים מפסיקים לפעול באופן סינכרוני על רקע הפעלתם של 61 גנים טרנס-איתות השולטים בסינתזה של קולטני הידבקות תאים, רכיבים של המטריצה החוץ-תאית, טרנסקריפטאזות הגבלה ואלמנטים שליחים של מערכת העברת האותות למנגנון הגרעיני מקולטני קרום התא. במקביל, נחסם הביטוי של גנים האחראים לסינתזה של חלבוני משתיק, כמו גם מעכבי ביטוי גנים המבטיחים את הטוטיפוטנטיות של גנום ESC.

סמני גנים נמצאו עבור תאים מכל שלוש שכבות הנבט. זיהוי שכבת התאים האקטודרמלית מתבצע על ידי ביטוי הגנים nodal, oct3 ו-fgf-5, תאי mesoderm - על ידי הגנים brachyury ו-zeta-globin, ואנדודרם - על ידי ביטוי הגן gata-4. באמבריוגנזה תקינה, במהלך תקופת הגסטרולציה, נצפית נדידה פעילה של אוכלוסיות לא בשלות של תאי גזע ותאי אב, המסמנות באופן מקומי את אזורי ההתפתחות של עצמות הפנים של הגולגולת, חלקים מסוימים במוח, מערכת העצבים ההיקפית, מערכת ההולכה הלבבית והתימוס, שרקמותיהם נוצרות משיבוטי תאים נודדים. סימון תאים על ידי גנים מוקדמים של שכבות הנבט מקל על משימת הניתוח הטופוגרפי של תהליכי נדידת תאי מבשר בעובר המתפתח. בפרט, נקבע כי באגרגטים של תאי אמברוקרצינומה P19, הביטוי של גן המזודרם הראשון, brachyury, מתחיל בתקופה של ירידה בביטוי של גנים של מפעיל פלסמינוגן רקמתי, α-fetoprotein, keratin 8 ו- keratin 19, שהם סמנים של אוכלוסיות מזודרם נודדות ראשונות. כתוצאה מכך, היווצרות רקמות ממקור מזודרמלי מתחילה רק לאחר השלמת תהליך הנדידה הנקודתית ופיזור של תאי אב מזודרמליים.

למרות מאפיינים פנוטיפיים מוגבלים ביותר והיעדר רוב יחידות האיתות הטרנס-תאיות, תאי ESC עדיין מבטאים כמה מולקולות קולטן בהן ניתן להשתמש לזיהוין. ראוי לציין כי אנטיגנים של סמן ESC בבני אדם ובפרימטים התגלו כנפוצים. לרוב, נוגדנים מסומנים לאנטיגנים הקשורים לממברנה SSEA-3, SSEA-4 (אנטיגנים ליפידים ייחודיים המייצגים קומפלקס של גליקוליפיד GL7 עם חומצה סיאלית), כמו גם גליקופרוטאינים עתירי פולימר TRA-1-81, TRA-1-60 משמשים לסימון ESC. בנוסף, תאי ESC מבטאים את האנטיגן העוברי הספציפי SSEA-1 ואת הפוספטאז האלקלי אנדוגני, כמו גם את גורם התעתוק הספציפי Oct4. האחרון נחוץ לשמירה על מנגנוני התפשטות ESC - גורם התעתוק הספציפי Oct4 מפעיל את הביטוי של גן גורם הגדילה של פיברובלסטים 4 ומייצב את הביטוי של קופסת הגנים האחראית לשכפול DNA בלתי מוגבל בתאים לא בשלים. חלבוני הסמן התוך-תאיים החשובים ביותר הם Oct3, Oct4, Tcf ו-Groucho, הקשורים לחלבוני משתיקי כרומטין.

כמעט מיד לאחר שנים רבות של ניסיונות לגדל תאי ESC מחוץ לגוף, שהצליחו והתרביות הראשונות של תאי גזע שבודדו מבלסטוציסטים של עכברים ותרביות של תאי נבט ראשוניים התקבלו, החל שלב במחקר על הפוטנציאל הפלוריפוטנטי של תאי ESC כאשר הם הוכנסו לעוברים בשלבי התפתחות מוקדמים. הוכח שבשלבי המורולה והבלסטוציסט, תאי ESC מסוגלים ליצור עוברים כימריים שבהם צאצאי תאי ESC של התורם מזוהים בכל הרקמות הסומטיות ואפילו בגמטות. לפיכך, בביולוגיה התפתחותית, באמצעות תאי ESC, נוצר "גשר" בין מחקרים ניסויים in vivo ו-in vitro, שהרחיב משמעותית את האפשרויות לחקר תהליכי הנחת רקמות ואיברים ראשוניים, התמיינותם ואורגנוגנזה עוברית.

ברור שבמהלך תהליך העובר, תאי גזע עובריים (ESCs) משולבים במסת התאים של העובר המוקדם in vivo, ונגזרותיהם נמצאות בכל האיברים והרקמות. תאי ESC מתיישבים בשורה של תאי נבט בעובר הכימרי, שצאצאיהם יוצרים ביציות וזרע מלאים. תאי גזע עובריים הם קלונוגניים - תא ESC יחיד מסוגל ליצור מושבה זהה גנטית של תאים עם סמנים מולקולריים, הכוללים ביטוי של הגן oct4 ופוספטאז אלקליין, פעילות טלומראז גבוהה וביטוי של אנטיגנים עובריים מסוימים.

כדי לחקור את מנגנוני האמבריוגנזה באמצעות תאי ESC, פותחה שיטה של כימריזציה של מורולה על ידי יצירת מבנה ביולוגי, שמחצוי לו יש שכבה של בלסטומרים טטרפלואידיים של המקבל, ובתוכו מוכנסים תאי ESC של התורם. לפיכך, הטרופובלסט נוצר מצאצאי הבלסטומרים הטטרפלואידיים של המקבל, מה שמבטיח השרשה ושליה, ותאי ESC של התורם משמשים כמסת תאים פנימית שממנה נוצרים גוף של עובר בר קיימא ושורת תאי נבט ראשוניים. ערך המחקר של תאי ESC טמון לא רק בעובדה שפלוריפוטנטיות נשמרת במהלך מניפולציות חוץ גופיות עם הגנום שלהם, אלא גם בעובדה שיכולתם של תאי ESC להשתתף ביצירת תאי נבט ראשוניים של עובר כימרי נשמרת. הוכח שצאצאיו של תא ESC מהונדס גנטית אחד בלבד מאכלסים את כל היסודות הראשוניים והרקמות המתפתחות של עובר כימרי המתקבל על ידי צבירה או גידול משותף של תא זה עם עובר בן 8 תאים. כאשר תאי ESC שעברו טרנספקציה עם גן החלבון הפלואורסצנטי הירוק הושתלו במורולה של עכברים, צאצאים פלואורסצנטיים של תא זה נמצאו בכל הרקמות הנחקרות של העובר המתפתח (Shimada, 1999). השתלת תאי ESC למורולה מאפשרת יצירת עכברים ברי קיימא שהאורגניזם שלהם מורכב רק מצאצאי תאי ה-ESC התורם, דבר הפותח אפשרויות שונות לשיבוט טיפולי. גישה מתודולוגית זו משמשת כיום בהצלחה לחקר בעיות של ביולוגיה התפתחותית, בפרט, היא משמשת לניתוח מנגנוני ההשבתה הגנטית של כרומוזום X או חוסר יציבות אפיגנטית של תאי ESC. השתלת תאי ESC לעובר מוקדם משמשת גם בביוטכנולוגיה חקלאית, כמו גם בניסויים בטיפול גנטי.

השתלת תאי ESC מהונדסים גנטית משמשת לבדיקת תאי מטרה של גנים מוטנטיים. תאי ESC בתרבית חוץ גופית משמשים בביוטכנולוגיה ליצירת עכברי נוקאאוט. למטרה זו, הגן הנחקר מוסר מה-ESC באמצעות רקומבינציה הומולוגית (נוקאאוט) ותאים חסרי גן זה מבודדים על מצע סלקטיבי. תאי ESC נוקאאוט מוכנסים לאחר מכן לבלסטוציסט או מצטברים עם מורולה בלסטומרים. העוברים הכימריים המוקדמים המתקבלים בדרך זו מושתלים לנקבות מקבלות, ואנשים עם גמטות שאינן זיגוטיות לגן נתון נבחרים מבין העכברים שזה עתה נולדו. טכנולוגיה זו שימשה ליצירת שורות רבות של עכברי נוקאאוט, הנמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה ניסויית וברפואה ניסויית. מודלים ביולוגיים כאלה משמשים לחקר המשמעות של גנים מסוימים בהתפתחות עוברית, כמו גם תפקידם במנגנונים של מחלות אנושיות ומצבים פתולוגיים. בנוסף, שורות של בעלי חיים נוקאאוט משמשות בבדיקות פרה-קליניות של שיטות גנטיות חדשות. לדוגמה, על ידי טרנספקציה של האלל הנורמלי של גן מוטנטי לתוך גנום ה-ESC, ניתן לתקן ביעילות מוטציה המשפיעה על המערכת ההמטופויאטית. החדרת גנים זרים לתוך תאי ESC מאפשרת יצירה מהירה של שורות של חיות מעבדה הומוזיגוטיות טרנסגניות. עם זאת, יש לציין כי הטכניקה של מחיקת גנים רקומבינציה ממוקדת פותחה עד כה באופן אמין רק ביחס לתאי ESC של עכברים. באמצעות תאי ESC של עכברים בעלי נוקאאוט כפול, נקבע התפקיד הפונקציונלי של אזור אשכול הגנים בכרומוזום 7 (עותק של האזור הגנומי בכרומוזום 19 אנושי) והאזור הפרוקסימלי של כרומוזום 11 (עותק של כרומוזום 5g אנושי) - מחיקת גנים אלה בתאי ESC של עכברים אפשרה להעריך את תפקוד האנלוגים שלהם בבני אדם.

האפשרויות לחקור את תפקודם של גנים של עוברי עצם אנושיים התרחבו, כאשר טרנספקציה שלהם לגנום של תאי עצם מסוג ESC של חיות מעבדה אפשרה, בפרט, להבהיר את תפקידו של הגן הקריפטו ביצירתו והתפתחותו של המזודרם הקרדיוגני, הגן pax-6 - באובריוגנזה של העין. מפות ראשונות של ביטוי גנים בתאי עצם מסוג ESC לא בשלים של טרטוקרצינומה ובלאסטוציסטים של עכברים נערכות כעת, ואושר דיכוי מדכא של גנים של טרנס-איתות בתאי עצם מסוג ESC. שילוב של 60-80 תאי עצם מסוג ESC מוטנטיים ו-20-30 תאים של עוברי עכברים טרום-השרשה תקינים מוביל להתפתחות עוברים כימריים שבהם פרימורדיה של האיברים מורכבת מתאי תורם ותאי מקבל, מה שמאפשר להבהיר את תפקידם של גנים לא ידועים בגסטרולציה ובאורגנוגנזה. המפה התפקודית של גנים של עוברי עכברים מתפתחים נוספה במידע על תפקיד הגן sf-1 ביצירת בלוטת יותרת הכליה והגונדות, הגן wt-1 ביצירת הכליה, גנים ממשפחת myoD ביצירת שרירי שלד, וגנים ממשפחת gata-1-4 בהבשלה מוגבלת של יסודות האריתרופויאזה והלימפופויאזה.

כיבוי מכוון של אללים אימהיים ואבהיים של גנים בתאי תאי... באמצעות טכניקה משופרת להשתלת תאי גזע תורם יחיד לעובר בן 8 תאים, הוכחה עובדת הכימריזציה ברמה התאית של איברים רבים בעובר המקבל. יש לציין כי נבטי תאים של רקמה אנושית נמצאו באיברי עכברי מקבל לאחר החדרת תאי גזע המטופויאטיים אנושיים לבלסטוציסט. נקבע כי תאי גזע פלוריפוטנטיים מסתובבים בדם של עוברי עכברים במהלך תקופת היווצרות האיברים. ייתכן שתפקידם הביולוגי טמון בארגון העוברי של מערכת החיסון העתידית. בעזרת תאי גזע, שוחזרו מודלים הולמים של פתולוגיה גנטית אנושית בתנאי מעבדה: נוקאאוט כפול של גן הדיסטרופין מודלים של ניוון שרירים דושן בעכברים, וכיבוי הגן atm (בקרה על סינתזת אות קינאז כרומטין) - אטקסיה-טלנגקטזיה. במחלה תורשתית קטלנית זו אצל ילדים, מתפתח ניוון של תאי פורקינג'ה במוח הקטן עקב פגמים בתיקון DNA, המלווה בפיתול של התימוס עקב מוות של תאים מתרבים. התמונה הקלינית, הפתופיזיולוגיה והפתומורפולוגיה של אטקסיה-טלנגקטזיה, המשוחזרות על ידי החדרת מידע גנטי פתולוגי לתוך תאי...

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

שימוש בציטוהיברידים של תאי גזע

תאים היברידיים המתקבלים על ידי מיזוג תאי ESC עם תאים סומטיים הם מודל הולם ומבטיח לחקר הפלוריפוטנטיות של תאי גזע ולתכנות מחדש של הכרומוזומים של תאים ממוינים. ציטוהיברידים המתקבלים על ידי מיזוג תאי ESC עם תאים ממוינים של בעל חיים בוגר מאפשרים לחקור את הקשרים בין גנומים מ"גילאים" שונים: מצב ייחודי נוצר כאשר כרומוזומים הומולוגיים שמקורם בתאים בשלבי התמיינות שונים ובדרגות בגרות שונות ממוקמים באותו גרעין, שם הם יכולים להחליף בקלות אותות רגולטוריים טרנס-אקטיביים. קשה לחזות כיצד המערכות האפיגנטיות הציס-רגולטוריות של כרומוזומים הומולוגיים, שנוצרו במהלך התפתחות האינדיבידואלים, יגיבו להשפעת אותות טרנס-אקטיביים שמקורם בגנומים קשורים עובריים. בנוסף, הפרדה של כרומוזומים הוריים מתרחשת בתאים היברידיים, מה שמאפשר לנו לחקור את האינטראקציה של גנומים ברמת הכרומוזומים האינדיבידואליים, כלומר, לזהות באופן פוטנציאלי את השתתפותם של כרומוזומים ספציפיים בשמירה על פלוריפוטנטיות או, להיפך, את היציאה להתמיינות.

ציטוהיברידים שהתקבלו על ידי מיזוג של תאי טרטוקרצינומה פלוריפוטנטיים ותאים סומטיים מובחנים שימשו כמודל הניסויי הראשון לחקר האינטראקציה של גנומים עם "היסטוריות התפתחותיות" שונות. במקרים מסוימים, תאים היברידיים כאלה שמרו על תכונות פלוריפוטנטיות ברמה גבוהה למדי. בפרט, תאים היברידיים טרטוקרצינומה-סומטיים in vivo גרמו להתפתחות של טרטומות אמיתיות המכילות נגזרות של כל שלוש שכבות הנבט, ובתרביות תרחיף in vitro הם יצרו גופים עובריים. אפילו בציטוהיברידים בין-ספציפיים מסוג זה, נצפתה נוכחות של אנטיגנים עובריים במקרים בהם השותפים הסומטיים במיזוג עם תאי טרטוקרצינומה היו לימפוציטים או תימוציטים. ראוי לציין שציטוהיברידים שנוצרו על ידי מיזוג של תאי טרטוקרצינומה עם פיברובלסטים תאמו לפיברובלסטים בפנוטיפ.

העובדה החשובה ביותר שנקבעה היא שבתאי היברידיים טרטוקרצינומה-סומטיים הופיעו סימנים של תכנות מחדש של גנום התאים הממוין, אשר התאפיין בהפעלה מחדש של גנים בודדים או של כרומוזום X לא פעיל של בן הזוג הסומטי. לפיכך, תוצאות מחקרים על ציטוהיברידים מסוג תאים טרטוקרצינומה-סומטיים מצביעות על כך שפלוריפוטנטיות נשמרת לעתים קרובות בתאים היברידיים ויש סימנים של תכנות מחדש של גנום בן הזוג הסומטי.

בניסויים להשגת תאי היברידיים עובריים תוך-ספציפיים על ידי מיזוג תאי ESC של עכברים עם ספלנוציטים בוגרים, נחקרו המאפיינים של ציטוהיברידים כאלה, נותחה הפרדה של כרומוזומים הוריים, והוערכה הפלוריפוטנטיות של הגנום ההיברידי. תאי היברידיים תוך-ספציפיים שהתקבלו על ידי מיזוג תאי טרטוקרצינומה עם תאים סומטיים מאופיינים בדרך כלל ברמה נמוכה של הפרדה כרומוזומלית עם קריוטיפ טטרפלואידי או כמעט טטרפלואידי. הרכב כרומוזומלי דומה נצפה בציטוהיברידים במהלך מיזוג של תאי נבט ראשוניים עם לימפוציטים. במקביל, תאי היברידיים בין-ספציפיים שהתקבלו על ידי מיזוג תאי טרטוקרצינומה של עכברים עם לימפוציטים של מינק הראו הפרדה אינטנסיבית של הכרומוזומים של בן הזוג הסומטי.

שלב חדש מבחינה איכותית בחקר הפרדת כרומוזומים הוריים בתאים היברידיים תוך-ספציפיים החל לאחר פיתוח שיטה לניתוח מיקרו-לוויינים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז, שבזכותה נמצאו כמה מאות סמנים עבור כל כרומוזום עכבר, מה שמאפשר הבחנה אמינה של כל זוג כרומוזומים הומולוגיים בתאים היברידיים.

על ידי מיזוג תאי ESC (תאי HM-1 חסרי פעילות של היפוקסנטין זרחוני-טרנספראז, 2n = 40, XY, שבודדו מבלסטוציסטים של עכברי 129/01a) עם ספלנוציטים של עכברי DD/c קונגניים, ניתן היה להשיג קבוצה של שיבוטים היברידיים הדומים מורפולוגית ל-ESC. כל השיבוטים בודדו על מצע סלקטיבי שבו רק תאים עם היפוקסנטין זרחוני-טרנספראז פעיל יכולים לגדול. ניתוח אלקטרופורטי הראה שלכל השיבוטים היה גרסה אללית של היפוקסנטין זרחוני-טרנספראז האופייני לעכברי DD/c. ניתוח ציטוגנטי הראה שלשלושה מתוך ארבעת השיבוטים ההיברידיים היה קבוצה כמעט דיפלואידית של כרומוזומים. שיבוט כמעט טטרפלואידי אחד הכיל שתי אוכלוסיות של תאים היברידיים, אחת מהן הייתה טטרפלואידית והשנייה, קטנה יותר, הייתה דיפלואידית.

ניתוח מיקרוסקוטלייט, המאפשר הבחנה בין כל זוג כרומוזומים הומולוגיים של עכברים 129/01a ו-DD/c, בשיבוטים היברידיים עם סט כמעט דיפלואידי, הראה שבשני שיבוטים הייתה אלימינציה מועדפת ברורה של אוטוזומים של בן הזוג הסומטי. לרוב האוטוזומים בשיבוטים HESS2 ו-HESS3 היו סמנים של קו 129/01a, כלומר, בן הזוג הפלוריפוטנטי. היוצא מן הכלל היו כרומוזומים 1 ו-I: בשיבוטים HESS2 ו-HESS3, יחד עם סמנים של תאי HM-1, סמנים של בן הזוג הסומטי היו נוכחים בכמויות קטנות. תוצאות כאלה עשויות לשקף הפרדה לא שלמה של כרומוזומים 1 ו-I של בן הזוג הסומטי ועולות בקנה אחד עם נתונים ציטוגנטיים לפיהם טריזומיה עבור כרומוזומים אלה נצפית ב-30-40% מהתאים של שיבוטים HESS2 ו-HESS3. שיבוט HESS4 היה שונה באופן משמעותי בהרכב הכרומוזומלי שלו: אוטוזומים רבים בשיבוט זה מקורם בגנום ESC (כרומוזומים 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 ו-17), אך כרומוזומים 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 ו-19 היו מיוצגים על ידי הומולוגים של שני ההורים. היחס הכמותי של מיקרו-לוויינים המסמנים כרומוזומים הומולוגיים אלה היה בערך 1:1. זה אפשר למחברים להניח שהומולוג אחד מקורו בגנום ESC, והשני מתאים ממוינים. בכמה תת-שיבוטים של שיבוט HESS4, נכחו רק סמנים של כרומוזומים 18 ו-19 של בן הזוג הסומטי. התוצאות שהתקבלו מצביעות על כך שבתאי השיבוט HESS4, בנוסף להפרדת הכרומוזומים של בן הזוג הסומטי, התרחשה הסרה של אחד או שני ההומולוגים של הכרומוזומים המפורטים לעיל של הגנום הפלוריפוטנטי, כלומר, הייתה הפרדה דו-צדדית של הכרומוזומים של שני ההורים - תופעה יוצאת דופן מאוד, שכן הפרדה של הכרומוזומים של אחד ההורים בלבד אופיינית לציטוהיברידים.

בנוסף, לאחר המעבר ה-20, כל השיבוטים של תאי היברידיים הכילו רק סמנים של כרומוזום X של בן הזוג הסומטי, כלומר, כרומוזום X של ESC הוחלף בכרומוזום X של בן הזוג הסומטי בשיבוטים. עובדה חשובה זו מאושרת על ידי נתוני הכלאה in situ באמצעות גלאי מסומן ב-FITC ספציפי לכרומוזום X של עכבר: זוהה אות חיובי רק על כרומוזום אחד. יש לציין שבשלבים מוקדמים יותר של הגידול (לפני המעבר ה-15), על פי נתונים ציטוגנטיים, תאים רבים הכילו שני כרומוזומי X. לכן, השימוש במדיה סלקטיבית מאפשר מניפולציה של הרכב הכרומוזומלי של תאי היברידיים ובחירה סלקטיבית של שיבוטים הנושאים כרומוזומים בודדים של בן הזוג הסומטי על רקע גנום ESC.

מאחר שתכונה ייחודית של הגנום הציטוהיברידי היא מיקום הגנומים ההוריים בגרעין אחד, עולה באופן טבעי השאלה לגבי שימור התכונות הפלוריפוטנטיות של הגנום העוברי בתאי כלאיים של תאי ESC-סומטיים בתנאים של מגע קרוב עם הגנום של תא ממוין. מבחינה מורפולוגית, הציטוהיברידים של תאי ESC ותאים סומטיים היו דומים לקו ה-ESC ההורי. הערכת הפלוריפוטנטיות הראתה שכל השיבוטים עם סט כרומוזומים כמעט דיפלואידי היו מסוגלים ליצור גופים עובריים בתרביות תרחיף, שבהן נגזרות של שלוש שכבות נבט נוכחו.

רוב התאים ההיברידיים הכילו את האנטיגן ECMA-7, סמן המאפיין עוברי עכברים מוקדמים, וגם היו בעלי פעילות גבוהה של פוספטאז אלקליין. הנתונים המשכנעים ביותר על התכונות הפלוריפוטנטיות הגבוהות של תאים היברידיים התקבלו בניסויים להשגת סדרה של כימרות הזרקה שכללו תאים היברידיים של שיבוט HESS2. ניתוח של סמנים ביוכימיים הראה כי צאצאי תאי התורם ההיברידיים היו נוכחים ברוב רקמות הכימרות. לכן, תאים היברידיים שהתקבלו על ידי מיזוג תאי ESC ותאים סומטיים מובחנים שומרים על פלוריפוטנטיות ברמה גבוהה, כולל היכולת ליצור כימרות כאשר מוזרקות לחלל הבלסטוציסט.

השיבוטים HESS2 ו-HESS4 נבדלו באופן משמעותי בהרכב הכרומוזומים ההוריים, אך היו בעלי תכונות פלוריפוטנטיות דומות. ניתן להניח שפלוריפוטנטיות בגנום ההיברידי מתבטאת כתכונה דומיננטית, אך ייתכן שלא כל הכרומוזומים של הגנום העוברי מעורבים בתהליך שמירת הפלוריפוטנטיות. אם הנחה זו נכונה, ניתן לצפות כי סילוקם של חלק מהכרומוזומים של בן הזוג הפלוריפוטנטי מגנום של תאי היברידיים לא ילווה בשינוי במצב הפלוריפוטנטי שלהם. במקרה זה, ניתוח הפרדת כרומוזומי ההורים בתאי היברידיים עובריים יאפשר לנו לגשת מקרוב לזיהוי הכרומוזומים האחראים על בקרת הפלוריפוטנטיות של תאים עובריים.

O. Serov ואחרים (2001) לא מצאו צאצאים בקרב 50 צאצאים שהתקבלו על ידי הכלאת כימרות עם עכברים תקינים בעלי גנוטיפ עכבר 129/01a ונשאו את כרומוזום ה-X של עכברי DD. המחברים סבורים כי הדבר נובע מירידה בפלוריפוטנטיות בתאים היברידיים תחת השפעת הגנום הסומטי. הסבר חלופי עשוי להיות ההשפעה השלילית של טריזומיה על חלק מהאוטוזומים וחוסר איזון בכרומוזומי המין (XXY נצפו בתאים עד המעבר ה-15) בתאים היברידיים במהלך מיוזה. ידוע שתאי XXY אינם מסוגלים לעבור מיוזה וליצור גמטות. טריזומיה יכולה גם לגרום לירידה בפעילות ההתרבות של תאים היברידיים, וכתוצאה מכך היתרון הסלקטיבי בהתפתחות כימרות עשוי להיות שייך לתאי העובר המקבל. מכאן נובע כי להערכה נאותה של הפוטנציאל הפלוריפוטנטי של תאים היברידיים, יש צורך להשיג שיבוטים היברידיים עם סט כרומוזומים דיפלואידי תקין.

בניסויים של או. סרוב ושותפיו למחקר (2001), הודגמה לראשונה האפשרות לתכנת מחדש את כרומוזום ה-X של תא סומטי בגנום של תאים היברידיים. מסקנה זו של המחברים נובעת מניתוח ביטוי הגן hprt (סמן כרומוזום X) בכימרות: נוכחות הגרסה האללית של hprt של עכברי DD/c זוהתה בכל הרקמות הכימריות שנותחו. ראוי להדגיש כי לאחר הכנסת תאים היברידיים לחלל הבלסטוציסט, הציטוהיברידים נופלים לתנאים לא סלקטיביים ושימור כרומוזום ה-X בגנום של תאים היברידיים פירושו שהוא הפך למרכיב המחייב שלו והגנום אינו מבדיל אותו מכרומוזום ה-Y של בן הזוג הפלוריפוטנטי.

בסיכום תוצאות ניתוח האינטראקציה בין הגנומים הסומטיים והפלוריפוטנטיים בתאים עובריים היברידיים, המחברים מסיקים כי בחלק מהציטוהיברידים, פלוריפוטנטיות מתבטאת כתכונה דומיננטית. הגנום ההיברידי מסוגל לתכנת מחדש כרומוזומים בודדים של תאים ממוינים, דבר שאינו שולל את האפשרות של השפעה הפוכה של הגנום הסומטי על הפלוריפוטנטיות של הגנום העוברי. בעת גידול תאים היברידיים, אינדוקציה של התמיינות מתרחשת בתדירות גבוהה משמעותית מאשר בקו ההורי המקורי של תאי ESC HM-1. השפעה דומה נצפית במהלך היווצרות מושבות ראשוניות: מושבות ראשוניות רבות של תאים היברידיים עובריים מתמיינות בשלבים מוקדמים של היווצרותן עם הפסדים גדולים של שיבוטים במהלך בחירתם ורבייתם.

לפיכך, ציטוהיברידים שנוצרו על ידי מיזוג של תאי ESC עם תאים סומטיים, למרות מגע קרוב עם הגנום של תאים ממוינים, שומרים על פלוריפוטנטיות כתכונה ייחודית של הגנום העוברי. יתר על כן, בתאים היברידיים כאלה, תכנות מחדש של כרומוזומים בודדים שמקורם מתאים ממוינים אפשרי. עדיין לא ברור באיזו מידה התכונות הפלוריפוטנטיות של הגנום העוברי נשמרות בתאים היברידיים, ובפרט, יכולתם להשתתף ביצירת קו הנבט בכימרות. זה דורש השגת תאי היברידיים עובריים בעלי קריוטיפ תקין. בכל מקרה, תאי היברידיים עובריים פלוריפוטנטיים יכולים להפוך למודל גנטי של ממש לזיהוי כרומוזומים המעורבים בשמירה על פלוריפוטנטיות או בשליטה בה, מכיוון שהפרדה דו-צדדית של כרומוזומים הוריים מספקת פוטנציאלית הזדמנות כזו.

לא פחות מושך הוא המחקר של התופעה ש-O. Serov ואחרים (2001) מגדירים כ"זיכרון כרומוזומלי". בגנום ההיברידי, כרומוזומים הומולוגיים נמצאים בשתי תצורות חלופיות: הומולוגים של בן הזוג הסומטי עברו פעם אחת התמיינות, ואילו בהומולוגים של בן הזוג הפלוריפוטנטי תהליך זה רק מתחיל. כתוצאה מכך, שימור תכונות פלוריפוטנטיות גבוהות על ידי תאים היברידיים מצביע על כך שהתצורה ה"פלוריפוטנטית" של הומולוגים של ESC יציבה מספיק בגנום ההיברידי, למרות השפעת גורמי טרנסאקציה הנובעים מבן הזוג הסומטי. הסימנים שתוארו לעיל לתכנות מחדש של כרומוזומים הומולוגיים של הגנום הממוין במהלך התפתחות הכימרות אינם שוללים את האפשרות שבשלבים הראשונים של היווצרות וטיפוח של ציטוהיברידים במבחנה הם שומרים על מעמדם שנרכש במהלך ההתמיינות in vivo. על פי נתונים שהתקבלו לאחרונה, כאשר תאי היברידיים עובריים מועברים לסביבה לא סלקטיבית, הם מראים חיסול אינטנסיבי של כרומוזומים של בן הזוג הסומטי בלבד, כלומר, הגנום של תאי היברידיים מפלה בקלות הומולוגים לאחר טיפוח במבחנה במשך 10-15 מעברים. לפיכך, תאים היברידיים עובריים מייצגים מודל ניסיוני מבטיח לחקר לא רק תכונה בסיסית כזו של הגנום העוברי כמו פלוריפוטנטיות, אלא גם האלטרנטיבה שלה - התמיינות עוברית.

יעילות טיפולית של השתלת תאי גזע עובריים

לפני ניתוח היעילות הטיפולית של השתלת תאי גזע מזנכימליים (ESCs) ונגזרותיהם, נסכם את החומר הנ"ל. יכולותיהם של תאי גזע מזנכימליים מבחינת יישום מלא של אמבריוגנזה במבחנה אינן מספיקות, מכיוון שפגמים התפתחותיים במקרה זה נובעים מהיעדר תאי גזע מזנכימליים, אשר נוצרים בגוף באופן אוטונומי וללא תלות בתאי גזע מזנכימליים. הפוטנציאל הגנטי של תאי גזע מזנכימליים נמוך מהפוטנציאל הגנטי של הזיגוטה, לכן תאי גזע מזנכימליים אינם משמשים ישירות לשיבוט עוברים. הפוטנציאל הביולוגי הייחודי של תאי גזע מזנכימליים, כתאים היחידים שבהם תוכניות פיתוח נפרסות במלואן ביישום עקבי, משמש במחקרים על תפקוד גנים. בעזרת תאי גזע מזנכימליים, מפוענחים השילובים הראשונים של אותות המפעילים את הביטוי של גנים מוקדמים ומאוחרים המקודדים את התפתחותן של שלוש שכבות נבט. שימור הפלוריפוטנטיות של גנום תאי גזע מזנכימליים במבחנה הופך אותם לכלי ייחודי להתחדשות תיקון, המסוגלים לחדש אוטומטית הפסדים תאיים במקרה של נזק לאיברים ולרקמות. בתרחיש היפותטי אידיאלי, ניתן להניח כי "... בעת השתלת תאי ESC של התורם, מועברים לגוף המקבל תוכניות ארוזות בצורה קומפקטית, אשר, בתנאים נוחים, מתממשות בבניית רקמה חדשה'7, המסוגלת "... להשתלב ביעילות בגוף המקבל הן ברמה המורפולוגית והן ברמה התפקודית".

באופן טבעי, בעקבות פיתוח שיטות למינודיפרנציאציה של תאי גזע עצביים (ESCs), החל מחקר in vivo של הפעילות התפקודית של תאים שהתקבלו במבחנה משיבוט מיוחד אחד. שיבוט ESC מתרבה מייצר אוכלוסיות של תאי אב נודדים המסוגלים באמת להשתלב באופן פעיל באזורים עם נזק לרקמות המקבל, דבר המשמש ברפואה רגנרטיבית-פלסטית. נקבע כי השתלת נוירונים של DOPA לתוך הסובסטנציה ניגרה מפחיתה את הביטויים הקליניים בהמיפרקינסוניזם ניסיוני. השתלות אזוריות של תאי גזע עצביים מתורמים מפחיתות את מידת ההפרעות המוטוריות הנגרמות על ידי טראומה או חבלה של חוט השדרה והמוח. התוצאות החיוביות הראשונות של השתלת תאי גזע במחלות דה-מיאלינציה התקבלו גם כן. נראה כי הפוטנציאל הרגנרטיבית-פלסטי של תאי גזע פותח אפשרויות בלתי מוגבלות לשימוש בהשתלת תאים ברפואה המעשית. עם זאת, כאשר מושתלים לאזורים אקטופיים, תאי גזע הופכים באופן בלתי נמנע לגידולים. טרטומות נוצרות כאשר תאי גזע מוזרקים תת עורית לעכברים עם לקות חיסונית. כאשר מושתלים תרחיפים של ESC מתחת לקפסולה של האשך בעכברים סינגניים, נוצרות גם טרטומות, המורכבות מרקמות שונות, שתאיהן נגזרות של כל שלוש שכבות הנבט. בטרטומות כאלה, תהליכים של יצירת אורגונים מופחתת הם נדירים ביותר.

מספר מחקרים מספקים מידע על התוצאות החיוביות של השתלת נגזרות ESC מוקדמות לבעלי חיים עם פתולוגיה ניסיונית. השתלת עצב תאית באמצעות נגזרות ESC מפותחת עוד יותר בניסויים ובניסויים הקליניים הראשונים לתיקון הפרעות תפקודיות בפגיעות מוחיות ועמוד שדרה, ולטיפול בסרינגומיאליה ובטרשת נפוצה (Repin, 2001). עם הופעת הטכניקה של נוירוגנזה חוץ גופית מתאי ESC, במקום להשתמש ברקמת מוח עוברית, מפותחות שיטות להשתלת נגזרות נוירוספרה המתקבלות מתרביות רקמת עצבים עוברית. תרחיפים להשתלה כאלה הם הומוגניים יותר באופן משמעותי ומכילים קודמנים ייעודיים של נוירונים ונוירוגליה.

עם תוספת קבועה של חומצה רטינואית במינון של 10 מיקרוגרם/מ"ל למצע הגידול למשך 6 שבועות, נוצרים יותר מ-80% מהנוירונים הפוסטמיטוטיים בקו NTERA-2 של קרצינומה עוברית (טרטו) אנושית. הומוגניות מלאה של אוכלוסיית הנוירונים מושגת על ידי מיון זרימה של נוירונים בוגרים המסומנים בסמנים אימונופנוטיפיים, המאפשר להיפטר משרידי טרטוקרצינומה ותאים לא בשלים. לאחר השתלה לאזורים שונים במוח של חיות ניסוי, נוירונים כאלה לא רק שורדים, אלא גם משתלבים ברשתות עצביות אזוריות. בבעלי חיים עם מודלים ניסיוניים של פגמים מקומיים במערכת העצבים המרכזית, השתלת עצב מפחיתה את הביטויים הקליניים של פתולוגיות אנושיות כגון השלכות של פגיעה מוחית טראומטית, שבץ מוחי, מחלות דה-מיאלינציה, פגמים תורשתיים בהתפתחות המוח הקטן, מחלות של שקיעת שומנים ופוליסכרידים.

כדי לייעל תהליכי התחדשות במחלות ניווניות של מערכת העצבים המרכזית, מפותחות טכנולוגיות להפקת אוליגודנדרוציטים המייצרים מיאלין מתאי תאי ESC. השלב הראשון כולל באופן מסורתי את ריבוי התאים עם שכפול מספר התאים הנדרש להשתלה. בשלב השני, מתבצעת התמיינות ממוקדת של תאים לאוכלוסייה של מבשרי אוליגודנדרוציטים המייצרים מיאלין, הנשלטת על ידי אנטיגנים סמנים סלקטיביים.

נפתחים סיכויים מסוימים לשימוש בנגזרות ESC לפיתוח שיטות לתיקון ליקויים חיסוניים הנגרמים מפגמים גנטיים בהבשלת בלוטת התימוס. במחקרים על עכברי נוקאאוט (rag 1) עם פגם גנטי מושרה - שיבוש מנגנון הרקומבינציה של לוקוסים V(D)J של גנים של TCR, המוביל לאובדן תפקוד לימפוציטים מסוג T, השתלת נגזרות ESC מוקדמות לבלוטת התימוס של בעלי חיים משיבה את ההבשלה של אוכלוסיות תקינות של שיבוטים חיסוניים האחראים לחסינות תאית. ניסויים קליניים של השתלת תאי ESC מוכנים במבחנה לטיפול באנמיות תורשתיות קטלניות בילדים נמצאים בעיצומם.

התנגדויות להכנסה מהירה של השתלת תאי גזע למרפאה מבוססות על המספר המוגבל של שורות יציבות של תאי גזע עובריים אנושיים והצורך בתקינה שלהם. כדי להגביר את טוהר קווי ESC סטנדרטיים, כמו גם תאי גזע אנושיים בוגרים, מוצע להשתמש בשיטה של בחירת שורות המבוססת על ניתוח גנטי מולקולרי של חזרות DNA קצרות. כמו כן, יש צורך לבדוק קווי ESC לנוכחות סידורים כרומוזומליים קטנים ומוטציות גנטיות, שהפוטנציאל להתרחשותם בתנאי תרבית תאים הוא גבוה למדי. מוצגת תזה לגבי בדיקה חובה של תכונותיהם של כל סוגי תאי ESC ותאי גזע פלוריפוטנטיים אזוריים, מכיוון שרבייתם במבחנה יכולה להוביל להופעת מאפיינים חדשים שאינם טבועים בתאי גזע עובריים או ברקמות סופיות. בפרט, ההנחה היא שגידול ארוך טווח במדיום עם ציטוקינים מקרב את קווי ESC לתאי הגידול, מכיוון שהם עוברים שינויים דומים במסלולי ויסות מחזור התא עם רכישת היכולת לבצע מספר בלתי מוגבל של חלוקות תאים. מחברים מסוימים, בהתבסס על הפוטנציאל להתפתחות גידול, רואים בהשתלת נגזרות של תאי גזע עובריים מוקדמים לבני אדם טענה פזיזה. לדעתם, הרבה יותר בטוח להשתמש בצאצאים מחויבים של תאי ESC, כלומר, שורות של אבות תאים ממוינים. עם זאת, נכון לעכשיו, עדיין לא פותחה טכניקה אמינה להשגת שורות תאים אנושיות יציבות שמתמיינות בכיוון הרצוי.

לפיכך, עוד ועוד נתונים על ההשפעה הטיפולית החיובית של השתלת נגזרות של תאי גזע עובריים אנושיים מופיעים בספרות. עם זאת, רבים ממחקרים אלה נבדקים וביקורת. ישנם חוקרים הסבורים כי תוצאות הניסויים הקליניים המוקדמים הן ראשוניות באופיין ורק מצביעות על כך שתאי גזע מסוגלים להפעיל השפעה חיובית על המהלך הקליני של מחלה מסוימת. לכן, יש צורך להשיג נתונים על תוצאות מרוחקות של השתלת תאים. שלבי ההתפתחות של נוירו-השתלות קליניות מצוטטים כטיעון. ואכן, בתחילה, פרסומים על היעילות הגבוהה של השתלת שברי מוח עובריים במחלת פרקינסון שלטו בספרות, אך לאחר מכן החלו להופיע דיווחים המכחישים את היעילות הטיפולית של רקמת עצב עוברית או עוברית המושתלת למוחם של חולים.

הניסויים הקליניים הראשונים נערכו כדי להעריך את בטיחות השתלת נוירובלסטים שמקורם בתאי טרטוקרצינומה מסוג NTERA-2, תאים לא בשלים מהם עברו התרבות בתרבית עד להצטברות של 100 מיליון מסת תאים. חלק מהתאים שהתקבלו בדרך זו שימשו לאפיון הפנוטיפ ולקביעת זיהומים תאיים, וכן לבדיקת זיהום אפשרי עם וירוסים וחיידקים. LIF ושכבת ההזנה של תאי סטרומה עובריים הוסרו ממדיום התרבית, ונוצרו תנאים להתמיינות ממוקדת של תאי טרטוקרצינומה לנוירובלסטים באמצעות שילוב של ציטוקינים וגורמי גדילה. לאחר מכן, הנוירובלסטים טוהרו מתאי טרטוקרצינומה לא בשלים באמצעות מיון תאי זרימה. לאחר טיהור משני ואפיון פנוטיפ של התאים המושתלים, הוזרק תרחיף של נוירובלסטים (10-12 מיליון) לגרעין הבסיסי של מוח החולים (בחודש השביעי לאחר שבץ מוחי דימומי) באמצעות מיקרוקנולה ומזרק מיוחדים תחת בקרה סטריאוטקסית וטומוגרפיה ממוחשבת. בדיקות סקר לאחר השתלה, שנמשכו שנה, לא גילו תופעות לוואי או תופעות לוואי לא רצויות. מחצית מהחולים הראו שיפור בתפקוד המוטורי בתקופה שבין 6 ל-12 חודשים לאחר ההשתלה. שינויים קליניים חיוביים לוו בעלייה באספקת הדם לאזור השבץ לאחר השתלת תאים: העלייה הממוצעת בספיגת 2-דאוקסיגלוקוז המסומן פלואורסצנטי, לפי טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים, הגיעה ל-18%, ובחלק מהחולים - ל-35%.

עם זאת, המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב ערכו מחקר עצמאי על היעילות הקלינית של נוירוטרנספלנטציה בחולים עם פרקינסון. חולים בקבוצה הראשונה הושתלו עם קטעים של רקמת עצב עוברית המייצרת דופמין, בעוד שקבוצת החולים השנייה עברה ניתוח דמה. התוצאות מצביעות על אפס יעילות קלינית של נוירוטרנספלנטציה כזו, למרות העובדה שנוירונים עובריים המייצרים דופמין שרדו במוחם של המקבלים. יתר על כן, שנתיים לאחר השתלת רקמת עצב עוברית, 15% מהחולים פיתחו דיסקינזיה מתמשכת, אשר נעדרה בחולים בקבוצת הפלצבו (תאי גזע: התקדמות מדעית וכיווני מחקר עתידיים. המכון הלאומי לבריאות, ארה"ב). תצפיות על התפתחות נוספת של המחלה בחולים אלה נמשכות.

חלק מהמחברים מקשרים את נתוני הספרות הסותרים בנוגע להערכת היעילות הקלינית של נוירוטרנספלנטציה עם גישות שונות לבחירת קבוצות חולים, בחירה לא מספקת של שיטות להערכה אובייקטיבית של מצבם, וחשוב מכל, תקופות שונות של התפתחות רקמת עצבים עוברית ואזורים שונים במוח שמהם הושגה רקמה זו, גדלי השתלות שונים ומאפיינים מתודולוגיים של התערבות כירורגית.

יש לציין כי ניסיונות להשתלה ישירה של תאי גזע עובריים פלוריפוטנטיים לאזור הסטריאטום של המוח של חולדות עם המיפרקינסון ניסיוני לוו בהתפשטות של תאי גזע עובריים (ESCs) והתמיינותם לנוירונים דופמינרגיים. יש להניח שנוירונים שזה עתה נוצרו שולבו ביעילות ברשתות עצביות, שכן לאחר השתלת תאי גזע עובריים (ESCs) נצפה תיקון של אנומליות התנהגותיות ואסימטריה מוטורית במבחן האפומורפין. במקביל, חלק מהחיות מתו עקב הפיכת תאי גזע עובריים מושתלים לגידולי מוח.

מומחים מהאקדמיות הלאומיות והרפואיות של ארה"ב, ומומחים מהמכון הלאומי לבריאות של ארה"ב, מאמינים כי הפוטנציאל הקליני של תאי גזע מסוג ESC ראוי לתשומת לב רצינית ביותר, אך מתעקשים על הצורך במחקר מפורט של תכונותיהם, הסבירות לסיבוכים וההשלכות ארוכות הטווח בניסויים על מודלים ביולוגיים הולמים של מחלות אנושיות (תאי גזע ורפואה רגנרטיבית עתידית, הוצאת האקדמיה הלאומית; תאי גזע וכיווני מחקר עתידיים. המכון הלאומי לבריאות ארה"ב).

מנקודת מבט זו, חשוב שניתוח היסטולוגי השוואתי של טרטומות ניסיוניות שהתקבלו על ידי השתלת תרחיף ESC לאשך עם טרטומות שנוצרו כתוצאה מהשתלת עובר מוקדם, המכיל גם ESC, הראה ש-ESC, ללא קשר למקור המקור שלהם או לאינטראקציה עם תאים מסוימים מסביב, מממשים את הפוטנציאל הטומוריגני שלהם באותו אופן. הוכח שלטרטומות כאלה יש מקור שבטי, מכיוון שגידולים המורכבים מנגזרות של כל שלוש שכבות הנבט יכולים לנבוע מ-ESC אחד (רגה, 2001). ראוי לציין שכאשר ESC משובטים בעלי קריוטיפ תקין הושתלו בעכברים חסרי חיסון, נוצרו גם טרטומות המורכבות מסוגים שונים של תאים סומטיים מובחנים. נתונים ניסיוניים אלה הם הוכחה ללא דופי למקור השבטי של טרטומות. מנקודת מבט של ביולוגיה התפתחותית, הם מצביעים על כך שלא מדובר בתאי אב מרובים, אלא בתא גזע פלוריפוטנטי יחיד משמש כמקור לנגזרות מובחנות של כל שלוש שכבות הנבט המרכיבות טרטומה. עם זאת, בדרך להשתלת תאים מעשית, תוצאות המחקרים הללו הן, אם לא מניעה, אזי סימן אזהרה לסכנה פוטנציאלית, שכן חיסון של תאי ESC או תאי נבט ראשוניים לרקמות שונות של עכברים בוגרים בעלי חיסון לקוי גורם בהכרח להתפתחות גידולים מתאי גזע מושתלים. ניוון ניאופלסטי של תאי ESC מושתלים מחוץ לרחם מלווה בהופעת אוכלוסיות לוויין של תאים ממוינים - עקב התמיינות חלקית של תאי ESC ושיבוטים של תאי אב לקווים מיוחדים. מעניין לציין, שכאשר תאי ESC מושתלים לשרירי שלד, נוירונים נוצרים לרוב ליד תאי טרטוקרצינומה. עם זאת, החדרת תאי ESC לביצית מתחלקת או לבלסטוציסט מלווה באינטגרציה מלאה של התאים בעובר ללא היווצרות אלמנטים ניאופלסטיים. במקרה זה, תאי ESC משולבים כמעט בכל האיברים והרקמות של העובר, כולל הפרימורדיום של גניטלי. בעלי חיים אלופניים כאלה הושגו לראשונה על ידי החדרת תאי טרטוקרצינומה 129 לעוברים מוקדמים בשלבי 8-100 תאים. בעכברים אלופניים, אוכלוסיות של תאים הטרוגניים שמקורם בתאי ESC של התורם משולבות ברקמות מח העצם, המעי, העור, הכבד ואיברי המין, מה שמאפשר ליצור אפילו כימרות תאים בין-מיניות בניסוי. ככל שתקופת ההתפתחות של העובר המוקדם קצרה יותר, כך אחוז הכימריזציה של התאים גבוה יותר, כאשר דרגת הכימריזציה הגבוהה ביותר נצפתה במערכת ההמטופויאטית, בעור, במערכת העצבים, בכבד ובמעי הדק של העובר האלופני. באורגניזם בוגר, רקמות המוגנות מפני מערכת החיסון של הנמען על ידי מחסומים היסטוהמטיים רגישות לכימריזציה:השתלת תאי נבט ראשוניים לתוך פרנכימת האשכים מלווה בשילוב תאי גזע תורם בשכבת רקמת הנבט של המקבל. עם זאת, בעת השתלת תאי גזע ראשוניים (ESCs) לתוך בלסטוציסט, לא מתרחשת היווצרות של יסודות כימריים של איברי המין עם יצירת תאי נבט ראשוניים של התורם. ניתן להשתמש בפלוריפוטנטיות של תאי ESC, כאשר נוצרים תנאים מיוחדים, גם לשיבוט: השתלת תאי ESC של עכבר לעובר עכבר בן 8-16 תאים, שבו מיטוזות תאיות חסומות על ידי ציטוקלסין, מקדמת את יישום האמבריוגנזה הרגילה עם התפתחות עובר מתאי ESC של התורם.

לכן, אלטרנטיבה להשתלת ESC אלוגנית היא שיבוט טיפולי המבוסס על השתלת גרעיני תאים סומטיים לביצית שעברה גרעין לא גרעיני ליצירת בלסטוציסט, שממסת התא הפנימית שלה מבודדים שורות של תאי ESC הזהים גנטית לתורם הגרעין הסומטי. מבחינה טכנית, רעיון זה אפשרי למדי, שכן האפשרות ליצור קווי ESC מבלסטוציסטים המתקבלים לאחר השתלת גרעינים סומטיים לביציות שעברו גרעין לא גרעיני הוכחה שוב ושוב בניסויים על חיות מעבדה (Nagy, 1990; Munsie, 2000). בפרט, בעכברים הומוזיגוטים למוטציה בגן rag2, פיברובלסטים שהתקבלו על ידי גידול תאי רקמה תת-אפידרמליים שימשו כתורמי גרעינים, אשר הושתלו לביציות שעברו גרעין לא גרעיני. לאחר הפעלת הביציות, גודלה ה"זיגוטה" עד להיווצרות בלסטוציסט, שממסת התא הפנימית שלה בודדו תאי ESC והועברו לשורת תאים שאינם גרעיניים לגן המוטנטי (rag2~/~). המוטציה של גן אללי אחד תוקנה בתאי תאי ESC כאלה באמצעות שיטת רקומבינציה הומולוגית. בסדרת הניסויים הראשונה, התקבלו גופי עובר מתאי תאי ESC עם גן משוחזר רקומביננטי, תאיהם עברו טרנספקציה עם רטרו-וירוס רקומביננטי (HoxB4i/GFP) ולאחר הרבייה הוזרקו לווריד של עכברי rag2~/~. בסדרה השנייה, בלסטומרים טטרפלואידיים אוגדו עם תאי ESC מהונדסים גנטית והושתלו בנקבות מקבלות. העכברים בעלי האימונו-קומפטנטיות שהתקבלו שימשו כתורמי מח עצם להשתלה בעכברי rag2~/~ מוטנטים. בשתי הסדרות התוצאה הייתה חיובית: לאחר 3-4 שבועות נמצאו תאים מיאלואידים ולימפואידים בוגרים, תקינים, המסוגלים לייצר אימונוגלובולינים, בכל העכברים. לפיכך, השתלת גרעיני תאים סומטיים לביציות יכולה לשמש לא רק להשגת קווי ESC, אלא גם לציטוגנותרפיה - תיקון אנומליות תורשתיות, תוך שימוש ב-ESC כווקטור להובלת מידע גנטי מתקן. אך לכיוון זה של השתלת תאים, בנוסף לבעיות ביו-אתיות, יש מגבלות. לא ברור עד כמה בטוחה השתלת תאים משובטים טיפולית בעלי גנוטיפ זהה לגנוטיפ של מטופל ספציפי, שכן תאים כאלה יכולים להכניס מוטציות היוצרות נטייה למחלות אחרות. ביציות אנושיות רגילות נותרות אובייקט קשה לגישה, בעוד שאפילו עם השתלת גרעינים סומטיים לביצי בעלי חיים שעברו גרעין, רק 15-25% מה"זיגוטות" שנבנו מתפתחות לשלב הבלסטוציסט. טרם נקבע כמה בלסטוציסטים נדרשים כדי להשיג שורה אחת של תאי ESC משובטים פלוריפוטנטיים. ראוי לציין גם את הרמה הגבוהה של עלויות כספיות הקשורות למורכבות מתודולוגיית השיבוט הטיפולית.

לסיכום, יש לציין כי בתאי ESC, הפלוריפוטנטיות של הגנום עם DNA היפומתילציה משולבת עם פעילות טלומראז גבוהה ושלב C^ קצר של מחזור התא, מה שמבטיח את רבייתם האינטנסיבית והאינסופית, שבמהלכה תאי ESC שומרים על סט כרומוזומים דיפלואידי וסט "צעירים" של מאפיינים פנוטיפיים. גידול שבטי של תאי ESC בתרבית אינו מפריע להתמיינותם לשורת תאים ייעודית כלשהי של האורגניזם כאשר הפריחה נעצרת ומתווספים אותות בקרה מתאימים. התמיינות מוגבלת של תאי ESC לקווי תאים סומטיים במבחנה מתממשת ללא השתתפות המזנכימה, תוך עקיפת הנוכטיי, מחוץ לאורגנוגנזה וללא היווצרות עובר. החדרת תאי ESC חוץ רחמיים in vivo מובילה בהכרח להיווצרות טרטוקרצינומות. השתלת תאי ESC לבלסטוציסט או לעובר מוקדם מלווה באינטגרציה שלהם עם רקמות העובר ובכימריזציה יציבה של איבריהם.

טכנולוגיות רגנרטיביות-פלסטיות המבוססות על השתלת תאים הן נקודת מפגש בין תחומי עניין של נציגי ביולוגיה של התא, ביולוגיה התפתחותית, גנטיקה ניסויית, אימונולוגיה, נוירולוגיה, קרדיולוגיה, המטולוגיה וענפים רבים אחרים של רפואה ניסויית ומעשית. התוצאות החשובות ביותר של מחקרים ניסויים מוכיחות את האפשרות לתכנות מחדש של תאי גזע עם שינוי ממוקד בתכונותיהם, מה שפותח סיכויים לשליטה בתהליכי הציטודיפרנציאציה באמצעות גורמי גדילה - לצורך התחדשות שריר הלב, שיקום נגעים במערכת העצבים המרכזית ונורמליזציה של תפקוד מנגנון האיים בלבלב. עם זאת, לצורך החדרה נרחבת של השתלת נגזרות ESC לרפואה המעשית, יש צורך ללמוד את תכונותיהם של תאי גזע אנושיים ביתר פירוט ולהמשיך בניסויים עם ESCs על מודלים של מחלות ניסיוניות.

סוגיות ביו-אתיות ובעיית הדחייה של השתלת תאים אלוגניים יכולות להיפתר על ידי הפלסטיות שהתגלתה של הגנום של תאי גזע אזוריים של אורגניזם בוגר. עם זאת, המידע הראשוני לפיו בעת השתלת תאים אוטולוגיים המטופויאטיים מבודדים ומאופיינים בקפידה לכבד, מהם נגזרים הפטוציטים חדשים, המשתלבים באונות הכבד, עובר כעת מתוקן וביקורת. אף על פי כן, פורסמו נתונים לפיהם השתלת תאי גזע עצביים לבלוטת התימוס גורמת להיווצרות נבטי לימפוציטים חדשים של T ו-B מתורמים, והשתלת תאי גזע עצביים במוח למח העצם מובילה להיווצרות נבטים המטופויאטיים עם מיאלו- ואריתרופויזה ארוכת טווח של התורם. כתוצאה מכך, תאי גזע פלוריפוטנטיים המסוגלים לתכנת מחדש את הגנום לפוטנציאל של תאי ESC יכולים להתקיים באיברים של אורגניזם בוגר.

מקור השגת ESC למטרות רפואיות נותר העובר האנושי, מה שקובע מראש את הבלתי נמנעות של צומת חדש של סוגיות מוסריות, אתיות, משפטיות ודתיות בנקודת מוצא חיי האדם. גילוי ה-ESC נתן תנופה חזקה לחידוש הדיונים הקשים על היכן עובר הגבול בין תאים חיים לחומר, להוויה ולאישיות. יחד עם זאת, אין נורמות, כללים וחוקים אוניברסליים בנוגע לשימוש ב-ESC ברפואה, למרות ניסיונות חוזרים ונשנים ליצור ולאמץ אותם. כל מדינה, במסגרת החקיקה שלה, פותרת בעיה זו באופן עצמאי. מצדם, רופאים ברחבי העולם ממשיכים לנסות להוציא את הרפואה הפלסטית-רגנרטיבית מעבר לתחום הדיונים הללו, בעיקר באמצעות שימוש בעתודות תאי גזע בוגרים ולא בתאי גזע עובריים.

קצת היסטוריה של בידוד תאי גזע עובריים

תאי טרטו(קרצינומה) עובריים בודדו מטרטומות אשכים שהופיעו באופן ספונטני בעכברי 129/ter-Sv, טרטומות שחלתיות ספונטניות בעכברי Lt/Sv, ומטרטומות שמקורן מתאים או רקמות עובריים שהושתלו מחוץ לרחם. מבין שורות תאי טרטו(קרצינומה) עובריים יציבות של עכברים שהתקבלו בדרך זו, חלקן היו פלוריפוטנטיות, אחרות התמיינו רק לסוג תא ספציפי אחד, וחלקן לא היו מסוגלות לחלוטין להתמיינות.

בעבר, התמקדו מחקרים שתוצאותיהם הצביעו על האפשרות להחזיר תאי טרטו(עובר)-קרצינומה לפנוטיפ תקין לאחר החדרתם לרקמות של עובר מתפתח, כמו גם עבודה על יצירה חוץ גופית של תאי טרטו(עובר)-קרצינומה מהונדסים גנטית, בעזרתם הושגו עכברים מוטנטים לצורך מידול ביולוגי של פתולוגיה תורשתית אנושית.

גידול בתרחיף מותנה שימש לבידוד שורות תאים של טרטו(עובר)-קרצינומה. בתרבית, תאי טרטו(עובר)-קרצינומה, כמו תאי ESC, גדלים ליצירת גופי עובר ודורשים דיסוציאציה חובה להעברת שורות, תוך שמירה על פלוריפוטנטיות בשכבת הזנה של פיברובלסטים עובריים או במהלך גידול בתרחיף במצע מותנה. תאים של שורות טרטו(עובר)-קרצינומה פלוריפוטנטיות הם גדולים, כדוריים, מאופיינים בפעילות פוספטאז אלקליין גבוהה, יוצרים אגרגטים ומסוגלים להתמיינות רב כיוונית. כאשר הם מוחדרים לבלסטוציסט, הם מצטברים עם המורולה, מה שמוביל להיווצרות עוברים כימריים, בהרכב של איברים ורקמות שונים שמהם נמצאות נגזרות של תאי טרטו(עובר)-קרצינומה. עם זאת, הרוב המכריע של עוברים כימריים כאלה מתים ברחם, ובאיברים של כימרות שזה עתה נולדו ששרדו, תאים זרים מתגלים לעיתים רחוקות ובצפיפות נמוכה. במקביל, שכיחות הגידולים (פיברוסרקומה, רבדומיוסרקומה, סוגים אחרים של גידולים ממאירים ואדנומה של הלבלב) עולה בחדות, וניוון הגידול מתרחש לעיתים קרובות בתקופת ההתפתחות התוך רחמית של עוברים כימריים.

רוב תאי טרטו-(עובר)-קרצינומה בסביבה הסביבתית של תאים עובריים תקינים רוכשים כמעט באופן טבעי מאפיינים גידוליים ממאירים. ההנחה היא שממאירות בלתי הפיכה נובעת מהפעלת פרוטו-אונקוגנים בתהליך של סידורים מבניים. אחד היוצאים מן הכלל הם תאים מקו העובר-קרצינומה SST3, המתקבלים מטרטומות אשכים של עכברים (קו 129/Sv-ter), אשר מפגינים יכולת גבוהה להשתלב ברקמות ובאיברים של העובר ללא היווצרות גידול לאחר מכן בעכברים כימריים. נגזרות של קווי תאי טרטו-(עובר)-קרצינומה בעכברים כימריים כמעט ואינן משתתפות ביצירת גונוציטים ראשוניים. ככל הנראה, הדבר נובע מהתדירות הגבוהה של סטיות כרומוזומליות האופייניות לרוב קווי טרטו-(עובר)-קרצינומה, בתאים שבהם נצפות גם אנאופלואידיות וגם אנומליות כרומוזומליות.

בתנאי מעבדה הושגו מספר שורות יציבות של תאי טרטו(עובר)-קרצינומה אנושיים המאופיינים בפלוריפוטנטיות, פעילות פרוליפרטיבית גבוהה ויכולת להתמיין במהלך גידול בתרביות. בפרט, קו תאי טרטו(עובר)-קרצינומה אנושיים NTERA-2 שימש לחקר מנגנוני הציטודיפרנציאציה העצבית. לאחר השתלת תאים מקו זה לאזור התת-חדרי של המוח הקדמי של חולדות שזה עתה נולדו, נצפתה נדידה ונוירוגנזה שלהם. אף נעשו ניסיונות להשתיל נוירונים שהתקבלו על ידי תרבית תאים מקו טרטו(עובר)-קרצינומה NTERA-2 לחולים עם שבץ מוחי, מה שהוביל, לדברי המחברים, לשיפור במהלך הקליני של המחלה. יחד עם זאת, לא היו מקרים של ממאירות של תאים מושתלים מקו טרטו(עובר)-קרצינומה NTERA-2 בחולים עם שבץ מוחי.

השורות הראשונות של תאי גזע עובריים פלוריפוטנטיים בלתי ממוינים של עכברים הושגו בתחילת שנות ה-80 על ידי אוונס ומרטין, שבודדו אותם ממסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט - האמברובלסט. שורות תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המבודדות שמרו על פלוריפוטנטיות ויכולת התמיינות לסוגי תאים שונים תחת השפעת גורמים במצע תרבית מיוחד למשך זמן רב.

המונח "תא גזע עוברי פלוריפוטנטי" עצמו שייך ללרוי סטיבנס, אשר, תוך כדי חקירת השפעת זפת הטבק על שכיחות התפתחות הגידול, הפנה את תשומת הלב להופעה הספונטנית של טרטוקרצינומה באשכים בעכברים ליניאריים (129/v) מקבוצת הביקורת. תאי הטרטוקרצינומה באשכים התאפיינו בקצב התפשטות גבוה, ובנוכחות נוזל מחלל הבטן הם התמיינו באופן ספונטני עם היווצרות נוירונים, קרטינוציטים, כונדרוציטים, קרדיומיוציטים, כמו גם שברי שיער ועצם, אך ללא כל סימנים לציטוארכיטקטורה מסודרת של הרקמה המתאימה. כאשר הוכנסו לתרבית, תאי הטרטוקרצינומה גדלו כשיבוטים פלוריפוטנטיים שאינם מחוברים למצע ויצרו גופים עובריים, ולאחר מכן הם הפסיקו להתחלק ועברו התמיינות ספונטנית לא מסודרת לנוירונים, גליה, תאי שריר וקרדיומיוציטים. סטיבנס גילה כי טרטוקרצינומה של עכבר מסוג 129/v מכילה פחות מ-1% תאים המסוגלים להתמיין למגוון של קווים סומטיים מיוחדים, וההתמיינות עצמה תלויה בגורמים המשפיעים עליהם (הרכב הנוזל הצפקי, תוצרים של תאים בוגרים או רקמות שנוספו לתרבית). ההשערה של לירוי סטיבנסון לגבי נוכחותם של תאי אב עובריים של קו הנבט בקרב תאי טרטוקרצינומה אושרה: תרחיף של תאי אמברובלסט מעוברים טרום-השרשה ברקמות של עכברים בוגרים יצר טרטוקרצינומות, וקווי תאים טהורים שבודדו מהם לאחר מתן תוך-צפקי לבעלי חיים מקבלים התמיינו לנוירונים, קרדיומיוציטים ותאים סומטיים אחרים שמקורם בכל שלוש שכבות הנבט. בניסויים in vivo, השתלת תאי ESC (שהתקבלו מהאמברובלסט, אך לא מהטרופובלסט) לעוברי עכברים משושלת אחרת בשלבי בלסטומרים 8-32 הביאה ללידת בעלי חיים כימריים (ללא התפתחות גידולים), שבאיבריהם נמצאו נבטי רקמת תורם. כימריזם נצפתה אפילו בקו תאי הנבט.

תאי נבט ראשוניים שבודדו מהאיבר הגניטלי של עובר עכבר תאמו במורפולוגיה, פנוטיפ אימונולוגי ומאפיינים תפקודיים לתאי נבט ראשוניים שהתקבלו על ידי סטיבנסון מטרטוקרצינומה ואמברובלסט. בכימרות שנולדו לאחר החדרת תאי נבט ראשוניים לבלסטוציסט, מורפוגנזה אלופנית של איברים אופיינה בחילופי פסיפס של יחידות מבניות ותפקודיות של תורם ומקבל - הכבד, הריאות והכליות. במקרים מסוימים, נצפתה היווצרות של קריפטות מעיים או אונות כבד המורכבות מתאי מקבל ותורם כאחד. עם זאת, מורפוגנזה תמיד התממשה בהתאם לתוכנית הגנטית של המין שאליו השתייך המקבל, והכימריזם הוגבל אך ורק לרמה התאית.

לאחר מכן נקבע כי התפשטות של תאי גזע עובריים ללא ציטודיפרנציאציה על שכבת הזנה של תאים שמקורם במזנכימה (פיברובלסטים עובריים) מתרחשת עם נוכחות חובה של LIF במדיה מזינה סלקטיבית, אשר מבטיחה באופן סלקטיבי את הישרדותם של תאי גזע ותאי אב בלבד, בעוד שרובם המכריע של היסודות התאיים הייעודיים מתים. באמצעות שיטות כאלה, בשנת 1998 ג'יימס תומסון בודד חמש שורות מונצחות של תאי גזע עובריים ממסת התאים הפנימית של בלסטוציסט אנושי. באותה שנה, ג'ון גרהארט פיתח שיטה לבידוד קווי ESC בני אלמות מגוששת איברי המין של עוברים אנושיים בני ארבעה עד חמישה שבועות. בשל תכונותיהם הייחודיות, שנתיים לאחר מכן, החלו להשתמש בתאי גזע עובריים ותאי גזע של רקמות סופיות ברפואה רגנרטיבית ובריפוי גנטי.