תאי גזע מזנכימליים

בין תאי גזע אזוריים, מקום מיוחד תופסים תאי גזע מזנכימליים (MSCs), אשר נגזרותיהם מהוות את המטריצה הסטרומלית של כל האיברים והרקמות בגוף האדם. עדיפות במחקר MSC נתונה לנציגי המדע הביולוגי הרוסי.

באמצע המאה הקודמת, בודדה לראשונה תרבית הומוגנית של תאי גזע סטרומה רב-פוטנציאליים של מח עצם במעבדתו של א. פרידנשטיין. תאי גזע מזנכימליים המחוברים למצע שמרו על עוצמת התפשטות גבוהה במשך זמן רב, ובתרבויות עם צפיפות זריעה נמוכה לאחר קיבוע על המצע הם יצרו שיבוטים של תאים דמויי פיברובלסטים שלא הייתה להם פעילות פגוציטית. הפסקת התפשטות ה-MSC הסתיימה בהתמיינותם הספונטנית במבחנה לתאי עצם, שומן, סחוס, שריר או רקמת חיבור. מחקרים נוספים אפשרו לקבוע את הפוטנציאל האוסטאוגני של תאים דמויי פיברובלסטים של סטרומה של מח עצם של מיני יונקים שונים, כמו גם את פעילות יצירת המושבות שלהם. ניסויים in vivo הראו כי השתלה הטרוטופית והן השתלה אורתוטופית של תאים דמויי פיברובלסטים יוצרי מושבות גורמת להיווצרות של רקמת עצם, סחוס, רקמת סיבי ושומן. מכיוון שתאי גזע סטרומה של מח עצם מאופיינים ביכולת גבוהה להתחדשות עצמית והתמיינות רב-גונית בתוך קו תאים יחיד, הם נקראים תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים.

יש לציין כי במשך 45 שנות מחקר בסיסי בתאי גזע מזנכימליים, נוצרו תנאים ממשיים לשימוש בנגזרותיהם בפועל קליני.

כיום אין ספק שכל רקמות גוף האדם נוצרות מתאי גזע מקווי תאים שונים כתוצאה מתהליכי ריבוי, נדידה, התמיינות והתבגרות. עם זאת, עד לאחרונה האמינו שתאי גזע באורגניזם בוגר הם ספציפיים לרקמה, כלומר, מסוגלים לייצר שורות של תאים מיוחדים רק מאותן רקמות בהן הם נמצאים. עמדה מושגית זו הופרכה על ידי עובדות הטרנספורמציה של תאי גזע המטופויאטיים לא רק לאלמנטים תאיים של דם היקפי, אלא גם לתאים סגלגלים של הכבד. בנוסף, תאי גזע עצביים התבררו כמסוגלים להוליד הן נוירונים והן אלמנטים גליה, כמו גם שורות מוקדמות של תאי אב המטופויאטיים. בתורם, תאי גזע מזנכימליים, שבדרך כלל מייצרים אלמנטים תאיים של עצם, סחוס ורקמת שומן, מסוגלים להפוך לתאי גזע עצביים. ההנחה היא שבתהליך הגדילה, התחדשות רקמות פיזיולוגית ותיקון, נוצרים תאי אב לא מחויבים ממאגרי גזע לא ספציפיים לרקמות. לדוגמה, תיקון רקמת שריר יכול להתבצע עקב נדידת תאי גזע מזנכימליים ממח העצם לשרירי השלד.

למרות שהחלפה צולבת כזו של תאי גזע אינה מוכרת על ידי כל החוקרים, האפשרות לשימוש קליני בתאי גזע מזנכימליים כמקור להשתלת תאים וכווקטור תאי של מידע גנטי אינה מוטלת עוד בספק על ידי איש, כמו גם ריבוי הפוטנציה של תאי גזע סטרומה ממח העצם, שניתן לבודד ולהרחיב אותם בקלות יחסית בתרבית חוץ גופית. במקביל, דיווחים על הפוטנציאל הפלוריפוטנטי של תאי גזע סטרומה ממח העצם ממשיכים להופיע בספרות המדעית. כראיה, מצוטטים פרוטוקולי מחקר שבהם, תחת השפעת מעוררי טרנסדיפרנציאציה ספציפיים, תאי MSC הופכים לתאי עצב, קרדיומיוציטים והפטוציטים. עם זאת, לחלק מהמדענים יש ספקות כבדים לגבי האפשרות של הפעלה וביטוי חוזרים ונשנים של גנים מתקופת העובר המוקדמת. יחד עם זאת, כולם מבינים שאם יימצאו תנאים להרחבת ריבוי הפוטנציה של תאי גזע מזנכימליים לפלוריפוטנציה של תאי ESC, בעיות אתיות, מוסריות, דתיות ומשפטיות רבות ברפואה פלסטית רגנרטיבית ייפתרו אוטומטית. בנוסף, מכיוון שבמקרה זה מקור הפוטנציאל לרגנרציה של תאי גזע הופך לתאי הסטרומה האוטולוגיים של המטופל, נפתרת גם בעיית הדחייה החיסונית של התא המושתל. העתיד הקרוב יראה עד כמה סיכויים אלה מציאותיים.

[ 1 ], [ 2 ]

שימוש בתאי גזע מזנכימליים ברפואה

בקליניקה, השימוש בנגזרות של תאי גזע מזנכימליים קשור בעיקר לשיקום פגמי רקמה המתרחשים בנגעי עור תרמיים נרחבים ועמוקים. בשלב הפרה-קליני, בוצעה הערכה ניסיונית של היתכנות השימוש בתאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים אלוגניים לטיפול בכוויות עמוקות. הוכח שתאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים של מח עצם יוצרים שכבה חד-שכבתית בתרבית, המאפשרת להשתיל אותם כדי לייעל את תהליכי ההתחדשות של פצעי כוויות עמוקים. המחברים מציינים כי לפיברובלסטים עובריים יש תכונה דומה, אך השימוש הקליני שלהם מוגבל על ידי בעיות אתיות ומשפטיות קיימות. כוויה תרמית עמוקה עם נזק לכל שכבות העור עוצבה על חולדות ויסטאר. שטח הכוויה היה 18-20% משטח העור הכולל. קבוצת הניסוי הראשונה כללה חולדות עם כוויה תרמית עמוקה והשתלת תאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים אלוגניים. הקבוצה השנייה כללה בעלי חיים עם כוויה תרמית עמוקה והשתלת פיברובלסטים עובריים אלוגניים. הקבוצה השלישית יוצגה על ידי חולדות ביקורת עם כוויה תרמית עמוקה שלא עברו טיפול תאי. תרחיף של תאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים ופיברובלסטים עובריים יושם על פני פצע הכוויה באמצעות פיפטה בכמות של 2 x 104 ^.תאים ביום השני לאחר דוגמנות הכוויה וכריתת הגלד הנמקי שנוצר. לאחר השתלת התאים, משטח הכוויה כוסה במפית גזה רטובה בתמיסת נתרן כלורי איזוטונית עם גנטמיצין. תאי מח עצם נאספו כדי להשיג תאי גזע מזנכימליים (MSCs) ולאחר מכן הוכנסו לקו של תאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים מחולדות ויסטאר בוגרות מירך. פיברובלסטים עובריים התקבלו מריאות של עוברים בני 14-17 יום. פיברובלסטים עובריים ותאי מח עצם לקבלת תאי MSC גודלו ראשוני בצלחות פטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO2, באווירה עם 5% CO2 בלחות של 95%. פיברובלסטים עובריים גודלו במשך 4-6 ימים, בעוד שיצירת שכבה חד-שכבתית של MSCs נדרשה בין 14 ל-17 ימים. לאחר מכן, תאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים (MSCs) עברו שימור בהקפאה כחומר המקור לתאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים, אשר התקבלו על ידי הפשרה וגידול של MSCs במשך 4 ימים. מספר תאי הגזע המזנכימליים דמויי הפיברובלסטים שנוצרו היה גבוה פי 3 יותר ממספר הפיברובלסטים העובריים שנוצרו במהלך אותה תקופת גידול. כדי לזהות את התאים המושתלים בפצעי כוויות בשלב הגידול, הגנום שלהם סומן באמצעות וקטור מעבורת ויראלי המבוסס על אדנווירוס רקומביננטי מסוג V הנושא את הגן 1ac-2 המקודד ל-β-galactosidase של E. coli. תאים חיים בזמנים שונים לאחר ההשתלה זוהו אימונוהיסטוכימית בחתכים בהקפאה עם תוספת של מצע X-Gal, המעניק צביעה כחולה-ירוק אופיינית. כתוצאה מהערכה ויזואלית, פלנימטרית והיסטולוגית דינמית של מצב פצע הכוויה, נקבע שכבר ביום השלישי לאחר השתלת התאים, מופיעים הבדלים משמעותיים במהלך תהליך הפצע בקבוצות שנבחרו. הבדל זה התבלט במיוחד ביום השביעי לאחר השתלת התאים. בבעלי החיים של הקבוצה הראשונה, אליהן הושתלו תאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים, הפצע קיבל צבע ורוד עז אחיד, רקמת גרנולציה גדלה על פני כל שטחו עד לגובה האפידרמיס, ומשטח הכוויה ירד משמעותית בגודלו. סרט הקולגן שנוצר על פני הפצע הפך דק יותר במקצת, אך המשיך לכסות את כל אזור הכוויה. בבעלי החיים של הקבוצה השנייה, אליהן הושתלו פיברובלסטים עובריים, רקמת הגרנולציה עלתה עד לגובה האפידרמיס של קצוות הפצע, אך רק במקומות מסוימים, בעוד שהפלסמוריאה מהפצע הייתה עזה יותר מאשר בקבוצה הראשונה, וסרט הקולגן שנוצר בתחילה כמעט נעלם. בבעלי חיים שלא קיבלו טיפול תאי, ביום השביעי פצע הכוויה היה חיוור, מחורר ונמק מכוסה בפיברין. פלסמוריאה נצפתה על פני כל שטח הכוויה. מבחינה היסטולוגית, בעלי החיים של הקבוצות הראשונה והשנייה הראו ירידה בחדירה תאית ובהתפתחות רשת כלי הדם.וסימנים אלה של תהליך התחדשות ראשוני היו בולטים יותר בחולדות של הקבוצה הראשונה. בקבוצת הביקורת נצפו סימנים של חדירת תאים לפצע, דפוס היסטולוגי של כלי דם חדשים נעדר. ביום ה-15-30 של התצפית, שטח פני השטח של הכוויה בבעלי החיים של הקבוצה הראשונה היה קטן משמעותית מאשר בחולדות של הקבוצות האחרות, והמשטח הגרנולי היה מפותח יותר. בבעלי החיים של הקבוצה השנייה, שטח פני השטח של הכוויה גם ירד בהשוואה לגודל פצעי הכוויה בחולדות של קבוצת הביקורת, שהתרחשו עקב אפיתליזציה שולית. בקבוצת הביקורת, פני השטח של הכוויה נותר חיוור במקומות עם גרנולות נדירות, כוכביות כלי דם הופיעו עליו, היו איי פלאק פיבריניים, פלסמוריאה מתונה נמשכה על פני כל פני השטח של הכוויה, וגלד שהיה קשה להפרדה נותר במקומות מסוימים. באופן כללי, בבעלי חיים של הקבוצה השלישית, גם גודל הפצע ירד, אך קצוות הפצע נותרו מעורערים.

כך, במהלך מחקר השוואתי של קצב ריפוי הפצע באמצעות תאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים ופיברובלסטים עובריים, כמו גם ללא שימוש בטיפול תאי, נצפתה האצה בקצב הריפוי של משטח הכוויה כתוצאה מהשתלת תאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים ופיברובלסטים עובריים. עם זאת, במקרה של שימוש בתאי גזע מזנכימליים אלוגניים דמויי פיברובלסטים, קצב ריפוי הפצע היה גבוה יותר מאשר בהשתלת פיברובלסטים עובריים. הדבר התבטא בהאצת שינוי השלבים של תהליך הריפוי - תנאי חדירת התאים פחתו, קצב צמיחת רשת כלי הדם גדל, כמו גם היווצרות רקמת גרנולציה.

תוצאות הפלנימטריה הדינמית מצביעות על כך שקצב הריפוי הספונטני של פצע הכוויה (ללא שימוש בטיפול תאי) היה הנמוך ביותר. בימים ה-15 וה-30 לאחר השתלת תאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים אלוגניים, קצב ריפוי הפצע היה גבוה יותר מאשר עם השתלת פיברובלסטים עובריים. שיטה היסטוכימית לגילוי בטא-גלקטוזידאז הראתה שלאחר השתלת תאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים ופיברובלסטים עובריים, התאים המושתלים נשארים ברי-קיימא על פני השטח ובעומק הפצעים המתחדשים לאורך כל תקופת התצפית. המחברים סבורים כי קצב הריפוי הגבוה יותר של פצע הכוויה בשימוש בתאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים נובע משחרור של גורמים פעילים ביולוגית המעוררים גדילה על ידי תאים אלה במהלך תהליך ההבשלה.

השתלת קרטינוציטים אוטו-או אלוגניים ופיברובלסטים אלוגניים לטיפול בפצעי כוויות נמצאת בשימוש גם בפרקטיקה הקלינית. יש לציין כי טיפול כירורגי בילדים עם כוויות עמוקות נרחבות הוא משימה מורכבת בשל האופי הטראומטי הגבוה וההתערבויות הכירורגיות המרובות, אובדן דם משמעותי ותגובות שונות למדיה העירוי בה נעשה שימוש. הקשיים העיקריים בביצוע ניתוחי עור פלסטיים לכוויות עמוקות נרחבות, בשטח העולה על 40% משטח הגוף, נובעים מחומרת מצבם של הקורבנות ומחוסר במשאבי עור תורם. השימוש בהשתלות רשת בעלות מקדם ניקוב גבוה אינו פותר את הבעיה, מכיוון שהתאים שנוצרו לאחר הניקוב מתפתחים לאט מאוד, וכיסויי העור עצמם מתפרקים או מתייבשים לעתים קרובות. כיסויים של פצעי כוויות כמו קסנוסקין, אלוגרפטים של גופות, כיסויי סרט סינתטיים אינם תמיד יעילים מספיק, ולכן מפותחות שיטות חדשות לכיסוי משטחי כוויות בשכבות של קרטינוציטים ופיברובלסטים בתרבית. בפרט, הוצעה שיטה לכיסוי משטחי כוויות בעזרת אלופיברובלסטים בתרבית, אשר לאחר השתלה יש להם השפעה מגרה בולטת על התפשטות האפידרמוציטים שנשמרו בפצע בכוויות גבוליות, כמו גם קרטינוציטים במחיצות של השתלות רשת. עבודתם של ל. בודקביץ' ושותפיו (2000) מציגה את תוצאות השימוש בשיטה זו לטיפול בכוויות בילדים. המחקר כלל 31 ילדים עם טראומה תרמית בגילאי שנה עד 14 שנים. בשלושה ילדים, השטח הכולל של פצעי כוויות בדרגות IIIA-B - IV היה 40%, ב-25 - 50-70%, ובשלושה נוספים - 71-85% משטח הגוף. כריתת נמק כירורגית מוקדמת שולבה עם השתלת אלופיברובלסטים בתרבית ואוטודרמופלסטיה. השלב הראשון של הטיפול כלל כריתה של רקמות נמקיות, השלב השני כלל השתלת אלופיברובלסטים בתרבית על גבי סרטי נשא, והשלב השלישי (48 שעות לאחר השתלת אלופיברובלסטים בתרבית) כלל הסרת המטריצה ואוטודרמופלסטיה עם מתלי עור ביחס ניקוב של 1:4. שלושה חולים שאושפזו במרפאה עם מחלת כוויות קשה עברו השתלת אלופיברובלסטים בתרבית על פצעים גרנולטיביים. השתלת אלופיברובלסטים בתרבית בוצעה פעם אחת ב-18 ילדים, פעמיים ב-11 ילדים ושלוש פעמים בשני חולים. שטח פני הפצע המכוסה בתרבית תאים נע בין 30 ל-3500 סמ"ר. יעילותם של אלופיברובלסטים בתרבית הוערכה על פי האחוז הכולל של השתלת עור, זמני ריפוי כוויות ומספר מקרי המוות מטראומה תרמית קשה. השתלת השתל הושלמה ב-86% מהחולים. אי השתלה חלקית של שתלי עור נצפתה ב-14% מהמקרים. למרות הטיפול, שישה ילדים (19.3%) מתו. השטח הכולל של נזק העור בהם נע בין 40 ל-70% משטח הגוף.השתלת אלופיברובלסטים בתרבית לא נמצאה קשורה לתמותה מכוויות באף מטופל.

בניתוח תוצאות הטיפול, מציינים המחברים כי נזק עור תרמי עמוק שכיסה 35-40% משטח הגוף נחשב כבלתי תואם את החיים (עבור ילדים צעירים יותר - עד גיל 3 - כוויות עמוקות המכסות 30% משטח הגוף הן קריטיות, עבור ילדים גדולים יותר - מעל 40% משטח הגוף). בעת ביצוע כריתת נמק כירורגית עם השתלת אלופיברובלסטים בתרבית ולאחר מכן אוטודרמופלסטיה עם מתלים בעור בעלי מקדם ניקוב גבוה, כוויות בדרגה IIIB-IV נותרות קריטיות, אך כיום ישנם סיכויים להצלת חייהם של אפילו קורבנות כאלה במקרים רבים. כריתת נמק כירורגית בשילוב עם השתלת אלופיברובלסטים בתרבית ואוטודרמופלסטיה בילדים עם כוויות עמוקות הוכחה כיעילה במיוחד בחולים עם נגעי עור נרחבים עם מחסור באתרי תורמים. טקטיקות כירורגיות אקטיביות והשתלת אלופיברובלסטים בתרבית תורמות לייצוב מהיר של המצב הכללי של חולים אלה, ירידה במספר הסיבוכים הזיהומיים של מחלת כוויות, יצירת תנאים נוחים להשתלת השתלות, צמצום זמן שיקום העור האבוד ומשך הטיפול באשפוז, ירידה בשכיחות התוצאות הקטלניות בקרב קורבנות עם כוויות נרחבות. לפיכך, השתלת אלופיברובלסטים בתרבית עם אוטודרמופלסטיה לאחר מכן עם מתלים עוריים מאפשרת החלמה אצל ילדים עם כוויות קשות, שנחשבו בעבר נידונים לאובדן.

מקובל באופן כללי כי המטרה העיקרית של טיפול בכוויות היא שיקום מלא ומהיר ביותר של עור פגום כדי למנוע השפעות רעילות, סיבוכים זיהומיים והתייבשות. תוצאות השימוש בתאים בתרבית תלויות במידה רבה במוכנות פצע הכוויה עצמו להשתלה. במקרים של השתלת קרטינוציטים בתרבית על פני הפצע לאחר כריתת נמק כירורגית, בממוצע 55% (לפי שטח) מהתאים המושתלים משתלבים, בעוד שבפצעים גרנולטוריים שיעור ההשתלה יורד ל-15%. לכן, טיפול מוצלח בכוויות עור עמוקות ומקיפות דורש, קודם כל, טקטיקות כירורגיות אקטיביות. בנוכחות פצעי כוויה בדרגה IIIB-IV, פני הכוויה משוחררים מיד מרקמה נמקית על מנת להפחית את הרעלה ולהפחית את מספר הסיבוכים של מחלת הכוויה. השימוש בטקטיקות כאלה הוא המפתח להפחתת הזמן מרגע קבלת הכוויה ועד לסגירת הפצעים ואת משך האשפוז של חולים עם כוויות נרחבות בבית החולים, וגם מפחית משמעותית את מספר התוצאות הקטלניות.

הדיווחים הראשונים על שימוש מוצלח בקרטינוציטים בתרבית לכיסוי משטחי כוויות הופיעו בתחילת שנות ה-80. לאחר מכן, מניפולציה זו בוצעה באמצעות שכבות של קרטינוציטים בתרבית, שהתקבלו לרוב מאוטו-תאים, ופחות מאלוקרטינוציטים. עם זאת, טכנולוגיית האוטוקרטינוציטופלסטיה אינה מאפשרת יצירת בנק תאים, בעוד שהזמן הנדרש להשתלת קרטינוציטים בשטח מספיק הוא ארוך ומסתכם ב-3-4 שבועות. במהלך תקופה זו, הסיכון לפתח סיבוכים זיהומיים וסיבוכים אחרים של מחלת כוויות עולה בחדות, מה שמאריך משמעותית את משך הזמן הכולל של שהות המטופלים בבית החולים. בנוסף, אוטוקרטינוציטים כמעט ולא משתרשים כאשר מושתלים על פצעי כוויות גרגיריים, והעלות הגבוהה של מצע גדילה מיוחד וממריצים פעילים ביולוגית של גדילת קרטינוציטים מגבילה משמעותית את השימוש הקליני בהם. שיטות ביוטכנולוגיות אחרות, כגון קולגןפלסטיה, השתלת קסנוסקין קריוגני ושימוש בציפויים ביו-פולימרים שונים, מגבירות את יעילות הטיפול בכוויות שטחיות נרחבות, אך לא עמוקות. שיטת כיסוי פני הפצע בפיברובלסטים בתרבית שונה באופן מהותי בכך שפיברובלסטים, ולא קרטינוציטים, משמשים כמרכיב העיקרי של שכבת התאים בתרבית.

התנאי המוקדם לפיתוח השיטה היה הנתונים שפריציטים המקיפים כלי דם קטנים הם תאי מזנכימה אב המסוגלים להפוך לפיברובלסטים המייצרים גורמי גדילה רבים ומבטיחים ריפוי פצעים הודות להשפעה מגרה חזקה על התפשטות והידבקות של קרטינוציטים. השימוש בפיברובלסטים בתרבית לסגירת משטחי פצעים גילה מיד מספר יתרונות משמעותיים של שיטה זו בהשוואה לשימוש בקרטינוציטים בתרבית. בפרט, השגת פיברובלסטים בתרבית אינה דורשת שימוש במצעי הזנה מיוחדים ובממריצי גדילה, מה שמפחית את עלות ההשתלה ביותר מפי 10 בהשוואה לעלות השגת קרטינוציטים. פיברובלסטים עוברים פסיבציה בקלות, שבמהלכה הם מאבדים חלקית אנטיגנים היסטו-תאימות פני השטח, מה שבתורו פותח את האפשרות להשתמש בתאים אלוגניים לייצור שתלים וליצירת הבנקים שלהם. הזמן הנדרש להשגת שתלים מוכנים לשימוש במרפאה מצטמצם מ-3 שבועות (עבור קרטינוציטים) ל-1-2 ימים (עבור פיברובלסטים). ניתן להשיג תרבית פיברובלסטים ראשונית על ידי תרבית תאים משברי עור שנלקחו במהלך אוטודרמופלסטיה, וצפיפות זריעת התאים להשגת תת-תרבויות פיברובלסטים אנושיות היא רק 20 x 103 ^לכל 1 ^סמ"ר.

על מנת לחקור את השפעת הפיברובלסטים והחלבונים הרגולטוריים שלהם על התפשטות והתמיינות של קרטינוציטים, בוצע ניתוח השוואתי של המורפולוגיה והתפשטות הקרטינוציטים על מצעים של קולגן מסוג I ו-III, כמו גם פיברונקטין בתרבית משותפת עם פיברובלסטים אנושיים. קרטינוציטים אנושיים בודדו משברי עור של חולים עם כוויות, שנלקחו במהלך אוטודרמופלסטיה. צפיפות זריעת הקרטינוציטים הייתה 50 x 103 תאים לכל 1 סמ"ר. היעילות הקלינית של השתלת פיברובלסטים בתרבית הוערכה ב-517 חולים. כל החולים חולקו לשתי קבוצות: קבוצה 1 - מבוגרים עם כוויות בדרגה IIA, B - IV; קבוצה 2 - ילדים עם כוויות עמוקות בדרגה IIIB - IV. הערכת הדינמיקה של הארגון המבני והתפקודי של פיברובלסטים בתרבית חד-שכבתית תוך התחשבות בתפקידם של גליקוזאמינוגליקנים, פיברונקטין וקולגן בתהליכי התחדשות אפשרה למחברים לקבוע את היום השלישי כתקופה המועדפת ביותר לשימוש בתרביות פיברובלסטים לביצוע השתלות. מחקר על השפעת פיברובלסטים על התפשטות והתמיינות של קרטינוציטים הראה כי לפיברובלסטים במבחנה יש השפעה מגרה בולטת, בעיקר על תהליכי הידבקות קרטינוציטים, תוך הגדלת מספר התאים המחוברים וקצב קיבועם ביותר מפי 2. גירוי תהליכי ההידבקות מלווה בעלייה בעוצמת סינתזת ה-DNA וברמת התפשטות הקרטינוציטים. בנוסף, התברר כי נוכחותם של פיברובלסטים והמטריצה החוץ-תאית הנוצרת על ידם היא תנאי הכרחי להיווצרות המנגנון הטונופיברילי של קרטינוציטים, קשרים בין-תאיים ובסופו של דבר, להתמיינות של קרטינוציטים ויצירת קרום הבסיס. בטיפול בילדים עם כוויות עמוקות, נקבעה יעילות קלינית גבוהה של השתלת תרבית אלופיברובלסטים, במיוחד בקבוצת החולים עם נגעי עור נרחבים במצבים של חוסר באתר התורם. מחקר מורפופונקציונלי מקיף הראה כי פיברובלסטים מושתלים מאופיינים בסינתזה פעילה של DNA, כמו גם קולגן, פיברונקטין וגליקוזאמינוגליקנים, שהם חלק מהמטריצה החוץ-תאית שנוצרת על ידי תאים. המחברים מצביעים על אחוז גבוה של השתלת פיברובלסטים מושתלים (עד 96%), הפחתה חדה בזמן קבלתם (בתוך 24-48 שעות במקום 2-3 שבועות במקרה של שימוש בקרטינוציטים), האצה משמעותית של אפיתליזציה של פני השטח של הכוויה, כמו גם הפחתה משמעותית בעלות (פי 10) של הטכנולוגיה לגידול השתלה מפיברובלסטים בהשוואה להשתלת קרטינוציטים. השימוש בהשתלת אלופיברובלסטים בתרבית מאפשר להציל את חייהם של ילדים עם כוויות קריטיות - נזק תרמי ליותר מ-50% משטח הגוף.אשר נחשב בעבר כבלתי תואם את החיים. יש לציין כי עם השתלת פיברובלסטים עובריים אלוגניים, הוכחו באופן משכנע לא רק התחדשות פצעים מהירה יותר והחלמה של חולים עם דרגות ואזורים שונים של כוויות, אלא גם הפחתה משמעותית בתמותתם.

פיברובלסטים אוטולוגיים משמשים גם בתחום מורכב של כירורגיה פלסטית כמו תיקון שחזור של פגיעות במיתרי הקול. קולגן בקר משמש בדרך כלל למטרה זו, שמשך הפעולה שלו מוגבל על ידי האימונוגניות שלו. בהיותו חלבון זר, קולגן בקר רגיש לקולגנאז של המקבל ויכול לגרום לתגובות חיסוניות, וכדי להפחית את הסיכון לכך פותחו טכנולוגיות להשגת תכשירי קולגן המקושרים עם גלוטראלדהיד. יתרונם טמון ביציבות רבה יותר ובאימונוגניות נמוכה יותר, אשר מצאו יישום מעשי בסילוק פגמים ואטרופיה של מיתרי הקול. הזרקות של קולגן אוטולוגי שימשו לראשונה בשנת 1995. הטכניקה הבטיחה את שימור המבנה הראשוני של סיבי קולגן אוטולוגיים, כולל קשרי צולבות תוך-מולקולריים המזורזים אנזימטית. העובדה היא שסיבי קולגן טבעיים עמידים יותר להרס על ידי פרוטאזות מאשר קולגן משוחזר, שבו הטלופפטידים נחתכים. שלמות הטלופפטידים חשובה למבנה הרבעוני של סיבי קולגן וליצירת קשרי צולבות בין מולקולות קולגן סמוכות. שלא כמו תכשירי קולגן בקר, קולגן אוטולוגי אינו גורם לתגובות חיסוניות אצל המקבל, אך הוא אינו יעיל מספיק כחומר חידוש. ניתן להשיג תיקון יציב באמצעות ייצור קולגן מקומי על ידי השתלת פיברובלסטים אוטולוגיים. עם זאת, זוהו קשיים מסוימים במהלך מחקר יעילות השתלת פיברובלסטים אוטולוגיים בקליניקה. בתקופה המוקדמת לאחר השתלת פיברובלסטים, ההשפעה הקלינית הייתה חלשה יותר בהשוואה לזו לאחר החדרת קולגן בקר. בעת גידול פיברובלסטים אוטולוגיים, לא ניתן לשלול את האפשרות של טרנספורמציה של פיברובלסטים נורמליים לפיברובלסטים פתולוגיים, המכונים מיופיברובלסטים, האחראים להתפתחות פיברוזיס ויצירת צלקות, כפי שמעידה התכווצות ג'ל הקולגן הנגרמת על ידי האינטראקציה הספציפית של פיברובלסטים וסיבורי קולגן. בנוסף, לאחר מעבר סדרתי במבחנה, פיברובלסטים מאבדים את היכולת לסנתז חלבוני מטריצה חוץ-תאית.

עם זאת, פותחה כעת באופן ניסיוני שיטה לגידול פיברובלסטים אנושיים אוטולוגיים אשר מבטלת את החסרונות שהוזכרו לעיל ואינה גורמת לטרנספורמציה אונקוגנית של פיברובלסטים תקינים. פיברובלסטים אוטולוגיים שהתקבלו בשיטה זו משמשים לשיקום פגמים ברקמות פנים רכות. במחקר של ג'. קלר ואחרים (2000), טופלו 20 חולים בגילאי 37 עד 61 עם קמטים וצלקות ניווניות. ביופסיות עור (4 מ"מ) מהאזור הרטרו-אוריקולרי הועברו למעבדה במבחנות סטריליות המכילות 10 מ"ל של מצע תרבית (מצע איגל עם אנטיביוטיקה, מיקוספטיקה, פירובט וסרום עגל עוברי). החומר הוכנס לתוך 3-5 צלחות תרבית בקוטר 60 מ"מ והודגרו בתרמוסטט עם אטמוספרה המכילה 5% CO2. לאחר שבוע, התאים הוצאו מהצלחות באמצעות טריפסיניזציה והוכנסו לבקבוקונים של 25 סמ"ר. התאים הוזרקו לחולים בכמות של 4 x 107. השפעה קלינית משמעותית ומתמשכת נצפתה בחולים במהלך תיקון קפלי האף, כמו גם בחולים עם צלקות 7 ו-12 חודשים לאחר ההשתלה השלישית של פיברובלסטים אוטולוגיים. על פי ציטומטריית זרימה, הפיברובלסטים בתרבית ייצרו כמות גדולה של קולגן מסוג I. מחקרים במבחנה הראו התכווצות תקינה של הפיברובלסטים שהוזרקו. חודשיים לאחר מתן תת עורי של פיברובלסטים בתרבית במינון של 4 x 107 תאים, לא זוהו גידולים בעכברים עירומים. הפיברובלסטים שהוזרקו לא גרמו לצלקות או לפיברוזיס מפושט בחולים. לדברי המחבר, הפיברובלסטים האוטולוגיים המושתלים מסוגלים לייצר קולגן באופן קבוע, מה שיספק אפקט התחדשות קוסמטי. יחד עם זאת, מכיוון שתוחלת החיים של תאים ממוינים מוגבלת, פיברובלסטים שנלקחו מחולה צעיר יעילים יותר מאלה שהתקבלו מקשישים. בעתיד, ההנחה היא שניתן יהיה לשמר בהקפאה תרבית של פיברובלסטים שנלקחה מתורם צעיר על מנת להשתיל מאוחר יותר את תאיו הצעירים לחולה קשיש. לסיכום, אין זה נכון לחלוטין להסיק שפיברובלסטים אוטולוגיים, בתנאי שהם נשמרים פונקציונלית, הם אמצעי אידיאלי לתיקון פגמים ברקמות רכות של הפנים. יחד עם זאת, המחבר עצמו מציין כי במהלך המחקר התעוררו כמה מצבים בעייתיים הקשורים לשימוש במערכת פיברובלסט-קולגן אוטולוגית. ההשפעה הקלינית הייתה לעתים קרובות חלשה יותר מאשר בעת שימוש בקולגן בקר, מה שגרם לאכזבה בקרב החולים.

באופן כללי, נתוני הספרות על סיכויי השימוש הקליני בתאי גזע מזנכימליים נראים אופטימיים למדי. נעשים ניסיונות להשתמש בתאי אב מזנכימליים רב-פוטנטיים של מח עצם אוטולוגי לטיפול בנגעים ניווניים במפרקים. נערכים ניסויים קליניים ראשונים לשימוש בתאי אב מזנכימליים בתרבית לטיפול בשברים מורכבים בעצמות. תאי סטרומה של מח עצם מזנכימליים אוטו-ואלוגניים ואלוגניים משמשים ליצירת רקמת סחוס להשתלה בתיקון פגמי סחוס מפרקי עקב טראומה או נגעים אוטואימוניים. מפותחות שיטות לשימוש קליני בתאי אב מזנכימליים רב-פוטנטיים כדי לחסל פגמי עצם בילדים עם צורה חמורה של אוסטאוגנזה לא שלמה הנגרמת על ידי מוטציות בגן קולגן מסוג I. לאחר מיאלואבלציה, ילדים מקבלי תאים מושתלים עם מח עצם מתורמים בריאים תואמי HLA, מכיוון שמח עצם לא מפוצל יכול להכיל מספר מספיק של תאי גזע מזנכימליים כדי לפצות על פגם עצם חמור. לאחר השתלת מח עצם אלוגני, ילדים כאלה הראו שינויים היסטולוגיים חיוביים בעצמות הטרבקולריות, עלייה בקצב הגדילה וירידה בשכיחות שברי העצם. במקרים מסוימים, מושגת תוצאה קלינית חיובית על ידי השתלת מח עצם אלוגני ואוסטאובלסטים קרובים זה לזה. השתלת MSC משמשת גם לטיפול בשבריריות עצם מולדת הנגרמת מחוסר איזון של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים ברקמת העצם. במקרה זה, שיקום היווצרות העצם מושג באמצעות כימריזציה של מאגר תאי הגזע והתאי הסטרומליים ברקמת העצם של החולים.

שיפור שיטות לשינוי גנטי של תאי גזע מזנכימליים מתורמים לצורך תיקון פגמים גנטיים ברקמות סטרומה נמשך. ההנחה היא שבעתיד הקרוב תאי גזע מזנכימליים ישמשו בנוירולוגיה לצורך כימריזציה ממוקדת של תאי מוח וליצירת מאגר תאים בריא המסוגל לייצר אנזים או גורם חסר האחראי לביטויים קליניים של המחלה. השתלת תאי גזע מזנכימליים יכולה לשמש לשיקום סטרומה של מח עצם בחולי סרטן לאחר טיפולי הקרנות וכימותרפיה, ובשילוב עם תאי מח עצם - לשיקום מערכת הדם. פיתוח טיפול חלופי שמטרתו לחסל פגמים במערכת השרירים והשלד בעזרת תאי גזע מזנכימליים מקודם על ידי פיתוחים הנדסיים בתחום תכנון ביו-חומרים מטריצה או ביומימטיקה היוצרים מסגרות המאוכלסות בצאצאים של תאי גזע מזנכימליים.

מקורות של תאי גזע מזנכימליים

המקור העיקרי לתאי גזע מזנכימליים הוא מח עצם, שתאי הגזע ההמטופויאטיים שלו בגוף היונקים מתמיינים כל הזמן לתאי דם ומערכת חיסון, בעוד שתאי גזע מזנכימליים מיוצגים על ידי אוכלוסייה קטנה של תאים דמויי פיברובלסטים של סטרומה של מח העצם ותורמים לשימור המצב הלא-מובחן של תאי גזע המטופויאטיים. בתנאים מסוימים, תאי גזע מזנכימליים מתמיינים לתאי סחוס ורקמת עצם. כאשר נזרעים על מצע תרבית בתנאי שתילה בצפיפות נמוכה, תאי סטרומה חד-גרעיניים של מח העצם יוצרים מושבות של תאים דביקים, שהם למעשה תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים דמויי פיברובלסטים. ישנם מחברים הסבורים שתאי גזע מזנכימליים לא מחויבים מופקדים במח העצם, אשר, בשל יכולתם להתחדשות עצמית ופוטנציאל התמיינות גבוה, מספקים לכל רקמות הגוף מבשרי מזנכימליים של יסודות סטרומה לאורך חיי האורגניזם היונקי.

במח העצם, אלמנטים תאיים סטרומליים יוצרים רשת הממלאת את החלל שבין הסינוסואידים לרקמת העצם. תכולת תאי ה-MSC הרדומים במח העצם של אדם מבוגר דומה לכמות תאי הגזע ההמטופויאטיים ואינה עולה על 0.01-0.001%. תאי גזע מזנכימליים שבודדו ממח העצם ולא עברו גידול נטולי מולקולות הידבקות. תאי MSC כאלה אינם מבטאים CD34, ICAM, VCAM, קולגן מסוג I ו-III, CD44 ו-CD29. כתוצאה מכך, במבחנה, לא תאי גזע מזנכימליים מקובעים על מצע התרבית, אלא נגזרות אב מתקדמות יותר של תאי גזע מזנכימליים שכבר יצרו את מרכיבי השלד התאי ואת מנגנון הקולטן של מולקולות הידבקות התאים. תאי סטרומליים עם פנוטיפ CD34 נמצאים אפילו בדם פריפרי, אם כי במח העצם יש פחות מהם באופן משמעותי מאשר תאים חד-גרעיניים חיוביים ל-CD34. תאי CD34 שבודדו מהדם ומועברים לתרבית נצמדים למצע ויוצרים מושבות של תאים דמויי פיברובלסטים.

ידוע שבתקופת העובר, הבסיס הסטרומלי של כל האיברים והרקמות של יונקים ובני אדם נובע ממאגר משותף של תאי גזע מזנכימליים לפני ובשלב האורגנוגנזה. לכן, מאמינים שבאורגניזם בוגר, רוב תאי הגזע המזנכימליים צריכים להימצא ברקמת החיבור והעצם. נקבע כי החלק העיקרי של האלמנטים התאיים של הסטרומה של רקמת חיבור ועצם רופפת מיוצג על ידי תאי אב מחויבים, אשר, עם זאת, שומרים על היכולת להתרבות וליצור שיבוטים במבחנה. כאשר תאים כאלה מוחדרים לזרם הדם הכללי, יותר מ-20% מתאי האב המזנכימליים מושתלים בין האלמנטים הסטרומליים של הרקמה ההמטופויאטית והאיברים הפרנכימטיים.

מקור פוטנציאלי לתאי גזע מזנכימליים הוא רקמת שומן, שבין תאי הגזע שלה זוהו תאי שומן קודמנים בדרגות שונות. היסודות הפחות בוגרים של רקמת השומן הם תאי סטרומה-וסקולריים, אשר, בדומה לתאי מזנכימליים קודמנים רב-פוטנציאליים של מח עצם, מסוגלים להתמיין לאדיפוציטים תחת השפעת גלוקוקורטיקואידים, גורם גדילה דמוי אינסולין ואינסולין. בתרבית, תאי סטרומה-וסקולריים מתמיינים לאדיפוציטים וכונדרוציטים, וברקמת שומן שמקורה במח עצם ישנם תאים היוצרים אדיפוציטים ואוסטאובלסטים.

תאי גזע סטרומה נמצאו גם בשרירים. בתרבית הראשונית של תאים שבודדו משרירי שלד אנושיים, מתגלים תאי כוכביים ותאי מיו רב-גרעיניים. בנוכחות סרום סוסים, תאי כוכביים מתרבים במבחנה ללא סימני ציטודיפרנציאציה, ולאחר הוספת דקסמתזון למצע התזונתי, ההתמיינות שלהם מאופיינת בהופעת אלמנטים תאיים בעלי פנוטיפ של תאי שריר שלד ושריר חלק, עצם, סחוס ורקמת שומן. לכן, גם תאי אב מזנכימליים רב-פוטנטים מחויבים וגם תאים לא מחויבים נמצאים ברקמת שריר אנושית. הוכח שאוכלוסיית תאי האב הקיימת בשרירי שלד מקורה בתאי אב מזנכימליים רב-פוטנטים לא מחויבים של מח העצם ושונה מתאי לוויין מיוגניים.

תאי כוכביים דביקים המתאימים לתאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים בפוטנציאל התמיינות נמצאו גם בשריר הלב של חולדות שזה עתה נולדו, מכיוון שתחת השפעת דקסמתזון הם מתמיינים לאדיפוציטים, אוסטאובלסטים, כונדרוציטים, תאי שריר חלק, מיוטובות שרירי שלד וקרדיומיוציטים. הוכח שתאי שריר חלק בכלי הדם (פריציטים) הם נגזרות של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים פרי-וסקולריים לא ממוינים. בתרבית, תאי גזע מזנכימליים פרי-וסקולריים מבטאים α-אקטין של שריר חלק וקולטני גורם גדילה שמקורם בטסיות דם, והם מסוגלים להתמיין לפחות לתאי שריר חלק.

מקום מיוחד, מנקודת מבט של עתודות גזע, תופסת רקמת סחוס, אשר פוטנציאל התיקון הנמוך ביותר שלה, ככל הנראה, נובע ממחסור בתאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים או גורמי התמיינות וגדילה. ההנחה היא שתאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים, המחויבים מראש לכונדרוגנזה ואוסטאוגנזה, נכנסים לרקמת סחוס ממקורות רקמה אחרים.

מקור הרקמה ותנאי ההתקשרות של תאי אב מזנכימליים בגידים גם הם לא נקבעו. תצפיות ניסיוניות מצביעות על כך שבתקופה המוקדמת שלאחר הלידה, תאי גיד אכילס של ארנבת בתרביות ראשוניות ובמעבר הראשון שומרים על ביטוי של קולגן מסוג I ודקורין, אך עם טיפוח נוסף הם מאבדים את סמני ההתמיינות של הטנוציטים.

יש לציין כי טרם התקבלה התשובה לשאלה האם תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים הממוקמים ברקמות שונות אכן נוכחים באופן קבוע בסטרומה שלהם, או שמא מאגר הרקמות של תאי גזע מזנכימליים מתמלא על ידי נדידת תאי גזע סטרומה ממח העצם.

בנוסף למח עצם ואזורי רקמה מזנכימליים אחרים של אורגניזם בוגר, דם טבורי יכול להיות מקור נוסף לתאי MSC. הוכח כי דם מוריד חבל הטבור מכיל תאים בעלי מאפיינים מורפולוגיים ואנטיגניים דומים עם תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים, בעלי יכולת הידבקות ואינם נחותים מתאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים ממקור מח עצם בפוטנציאל התמיינות. בתרביות של תאי גזע מזנכימליים מדם טבורי, נמצאו 5 עד 10% של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים לא מחויבים. התברר שמספרם בדם טבורי עומד ביחס הפוך לגיל ההריון, דבר המצביע בעקיפין על נדידת תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים לרקמות שונות במהלך התפתחות העובר. הופיעו המידע הראשון על השימוש הקליני בתאי גזע מזנכימליים המבודדים מדם טבורי, כמו גם כאלה שהתקבלו מחומר ביולוגי עוברי, המבוסס על היכולת הידועה של תאי גזע עובריים להשתלב, להשתיל ולתפקד באיברים ובמערכות הרקמות של מקבלי תאים בוגרים.

חיפוש אחר מקורות חדשים לתאי גזע מזנכימליים

השימוש בתאי גזע מזנכימליים ממקור עוברי, כמו גם תאים עובריים אחרים, יוצר מספר בעיות אתיות, משפטיות, שיפוטיות וחקיקתיות. לכן, החיפוש אחר חומר תאי תורמים חוץ-עובריים נמשך. ניסיון לשימוש קליני בפיברובלסטים של עור אנושי לא צלח, דבר שנקבע מראש לא רק בשל היכולת הפיננסית הגבוהה של הטכנולוגיה, אלא גם בשל ההתמיינות המהירה של פיברובלסטים לפיברוציטים, בעלי פוטנציאל התפשטות נמוך משמעותית והם מייצרים מספר מוגבל של גורמי גדילה. התקדמות נוספת בחקר הביולוגיה של תאי גזע מזנכימליים רב-פוטנציאליים ותאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים של מח עצם אפשרה לנו לפתח אסטרטגיה לשימוש קליני בתאי גזע מזנכימליים אוטולוגיים. טכנולוגיית בידודם, טיפוחם, רבייתם מחוץ לגוף (ex vivo) והתמיינותם הממוקדת דרשה, קודם כל, מחקר של ספקטרום הסמנים המולקולריים של תאי גזע מזנכימליים. הניתוח שלהם הראה שתרביות ראשוניות של רקמת עצם אנושית מכילות מספר סוגים של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים. הפנוטיפ הפרו-אוסטאובלסטי זוהה בתאים המבטאים את הסמן של תאי אב סטרומה STRO-1, אך אינם נושאים את סמן האוסטאובלסט - פוספטאז אלקליין. תאים כאלה מאופיינים ביכולת נמוכה ליצור מטריצת עצם מינרלית, כמו גם בהיעדר ביטוי של אוסטאופונטין וקולטני הורמון פרתירואיד. נגזרות של תאים חיוביים ל-STRO-1 שאינן מבטאות פוספטאז אלקליין מיוצגות על ידי אוסטאובלסטים שהתמיינו באופן בינוני ומלא. נמצא כי אלמנטים תאיים של שורות משובטות של תאי עצם טרבקולריים אנושיים חיוביים ל-STRO-1 מסוגלים להתמיין לאוסטאוציטים ואדיפוציטים בוגרים. כיוון ההתמיינות של תאים אלה תלוי בהשפעת חומצות שומן רב בלתי רוויות, ציטוקינים מעודדי דלקת - IL-1b וגורם נמק הגידול a (TNF-a), כמו גם TGF-b נוגד דלקת ומדכא חיסון.

מאוחר יותר התגלה כי תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים חסרים פנוטיפ ספציפי הטבוע רק בהם, אך מבטאים קומפלקס של סמנים האופייניים לתאי מזנכימה, אנדותל, אפיתל ושריר בהיעדר ביטוי של אנטיגנים אימונופנוטיפיים של תאים המטופויאטיים - CD45, CD34 ו-CD14. בנוסף, תאי גזע מזנכימליים מייצרים באופן קונסטיטוטיבי ומושרה גורמי גדילה המטופויאטיים ולא המטופויאטיים, אינטרלוקינים וכימוקינים, וקולטנים לציטוקינים וגורמי גדילה מסוימים באים לידי ביטוי בתאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים. תאים רדומים, או נחים, עם אימונופנוטיפ כמעט זהה לפרופיל האנטיגן של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים שלא טופלו ב-5-פלואורורציל נמצאו בין תאי המטריצה הסטרומלית של גוף האדם - שני התאים מבטאים CD117, המסמן תאי גזע "בוגרים".

לפיכך, טרם זוהה סמן תאים ייחודי לתאי גזע מזנכימליים. ההנחה היא שתאים רדומים מייצגים אוכלוסייה של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים שאינם מחויבים, מכיוון שהם אינם מבטאים סמנים של תאים המחויבים לאוסטאו- (Cbfa-1) או לאדיפוגנזה (PPAR-y-2). חשיפה ממושכת של תאים רדומים המתרבים באיטיות לסרום בקר עוברי מובילה להיווצרות של תאי אב מחויבים מתמיינים באופן סופני המאופיינים בגדילה מהירה. התפשטות שבטית של תאי גזע מזנכימליים כאלה נתמכת על ידי FGF2. נראה כי הגנום של תאי גזע סטרומליים "סגור" למדי. ישנם דיווחים על היעדר התמיינות ספונטנית בתאי MSC - ללא תנאים מיוחדים למחויבות, הם אינם הופכים אפילו לתאים משושלת המזנכימלית.

כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה של נגזרות תאי גזע מזנכימליים, מתבצע חיפוש אחר חלבוני סמן התמיינות על שורות תאים סטרומה ובתרבית ראשונית. ניתוח שבטי חוץ גופי של תאי מושבה יוצרי מח עצם הראה כי EGF מגדיל את גודל המושבה הממוצע ומקטין את הביטוי השבטי של פוספטאז אלקליין כאשר הוא מוחל על תרביות ראשוניות, בעוד שתוספת הידרוקורטיזון מפעילה את הביטוי של פוספטאז אלקליין, שהוא סמן לכיוון האוסטאוגני של התמיינות MSC. נוגדנים חד שבטיים ל-STRO-1 אפשרו להפריד ולחקור את אוכלוסיית התאים ההדבקתיים החיוביים ל-STRO-1 במערכת הטרוגנית של תרביות דקסטר. נקבע ספקטרום של ציטוקינים המווסתים לא רק את התפשטות והתמיינות של תאים המטופויאטיים ותאים לימפואידיים, אלא גם משתתפים ביצירה, יצירה וספיגה של רקמות שלד באמצעות מנגנונים פארא-, אוטו- ואנדוקריניים. שחרור בתיווך קולטנים של שליחים משניים כגון cAMP, דיאצילגליצרול, אינוזיטול טריפוספט ו-Ca2+ משמש גם לניתוח סמנים של קטגוריות שונות של תאי רקמה סטרומליים המבטאים את הקולטנים המתאימים. השימוש בנוגדנים חד שבטיים כסמנים אפשר לקבוע את שייכותם של תאים רשתיים של סטרומה של איברי הלימפה לאזורים התלויים ב-T וב-B.

במשך זמן מה נמשכו ויכוחים מדעיים סביב שאלת האפשרות שמקור תאי MSC מתא גזע המטופויאטי. ואכן, כאשר תרחיפים של תאי מח עצם מושתלים לתרביות חד-שכבתיות, גדלים בהם מושבות נפרדות של פיברובלסטים. עם זאת, הוכח כי נוכחותם של קודמנים של מושבות פיברובלסטים ונבטים שונים של התמיינות רקמה המטופויאטית במח העצם אינה מהווה עדות למקורם המשותף מתא גזע המטופויאטי. באמצעות ניתוח דיסקרימיננטי של תאי גזע מח עצם, נקבע כי המיקרו-סביבה במהלך השתלת מח עצם הטרוטופית אינה מועברת על ידי תאים המטופויאטיים, דבר המוכיח את קיומה של אוכלוסייה של תאי MSC במח העצם שאינה תלויה היסטגנטית בתאים המטופויאטיים.

בנוסף, שיטת השיבוט הסלקטיבי אפשרה לזהות קטגוריה חדשה של תאי אב סטרומליים בתרביות חד-שכבתיות של תאי מח עצם, לקבוע את מספרם ולחקור את תכונותיהם, את פוטנציאל ההתרבות וההתמיינות שלהם. התברר שתאים דמויי פיברובלסטים סטרומליים מתרבים במבחנה ויוצרים מושבות דיפלואידיות, אשר כאשר מושתלים בחזרה לגוף, מספקים היווצרות של איברים המטופויאטיים חדשים. תוצאות המחקר של שיבוטים בודדים מצביעות על כך שבין תאי האב הסטרומליים קיימת אוכלוסייה של תאים אשר, על ידי פוטנציאל ההתרבות וההתמיינות שלהם, יכולים לתבוע את התפקיד של תאי גזע של רקמת סטרומלית, ללא תלות היסטוגנית בתאי גזע המטופויאטיים. תאי אוכלוסייה זו מאופיינים בגדילה עצמית ומתמיינים לאלמנטים של תאי אב של עצם, סחוס ורקמה רשתית של מח העצם.

מעניינים מאוד הם תוצאות המחקרים של ר. צ'אילאקיאן ושותפיו (1997-2001), שגידלו תאי אב סטרומה של מח עצם מארנבות, שרקנים ועכברים על מצע תזונתי a-MEM בתוספת סרום עוברי של עגל. המחברים ביצעו אקספלנטציה בצפיפות התחלתית של 2-4 x 103 תאי מח עצם לכל 1 סמ"ר. תאי מח עצם הומולוגיים או הטרולוגיים שלא מופעלים על ידי קרינה שימשו כחומר הזנה במינון ששמר על אפקט ההזנה אך חסם לחלוטין את התפשטותם. מושבות ראשוניות נפרדות בנות שבועיים של פיברובלסטים עברו טריפסין כדי להשיג זנים חד שבטיים. עדויות למקור השבטי של המושבות הושגו באמצעות סמן כרומוזומלי בתרביות מח עצם מעורבות של שרקנים זכרים ונקבות, צילום בהילוך מהיר של תרביות חיות, ובתרביות מעורבות של מח עצם סינגני של עכברי CBA ו-CBAT6T6. השתלת תרחיף של תאי מח עצם טריים מבודדים או פיברובלסטים סטרומליים שגודלו במבחנה מתחת לקפסולת הכליה בוצעה בפיגומים נקבוביים של איבלון או ג'לטין, כמו גם במטריצת עצם ספוגית ארנבת מומתת. לצורך השתלת שיבוטים במעטפת עצם, נוקו עצם הירך של שרקנים מרקמות רכות ופריאוסטאום, האפיפיזות נחתכו ומח העצם נשטף היטב. העצם נחתכה לרסיסים (3-5 מ"מ), יובשה והוקרנה במינון של 60 Gy. מושבות בודדות של פיברובלסטים הוכנסו למעטפות עצם והושתלו תוך שריריות. לצורך השתלה תוך-צפקית של פיברובלסטים סטרומליים שגודלו במבחנה, נעשה שימוש בתאי דיפוזיה מסוגים A (V=0.015 cm3, h=0.1 מ"מ) ו-O (V=0.15 cm3, h=2 מ"מ).

כאשר חקרו את דינמיקת הגדילה של זנים שבטיים, ר. צ'אילאקיאן ואחרים (2001) מצאו כי לתאים בודדים היוצרים מושבות פיברובלסטים, כמו גם לצאצאיהם, יש פוטנציאל התרבות עצום. עד למעבר העשירי, מספר הפיברובלסטים בזנים מסוימים היה 1.2-7.2 x 10 ⁹ תאים. במהלך התפתחותם, הם ביצעו עד 31-34 הכפלות תאים. במקרה זה, השתלה הטרוטופית של זנים שמקורם במח עצם שנוצרו על ידי קודמרי סטרומה של כמה עשרות שיבוטים הביאה להעברת מיקרו-סביבת מח העצם ולהיווצרות איבר המטופויאטי חדש באזור ההשתלה. המחברים העלו את השאלה האם שיבוטים בודדים מסוגלים להעביר את מיקרו-סביבת מח העצם של תאי סטרומה או שמא נדרש שיתוף פעולה של מספר קודמרי סטרומה קלונוגניים שונים לשם כך? ואם שיבוטים בודדים מסוגלים להעביר את המיקרו-סביבה, האם היא תהיה שלמה עבור כל שלושת הנבטים ההמטופויאטיים, או שמא שיבוטים שונים מספקים את היווצרות המיקרו-סביבה עבור נבטים המטופויאטיים שונים? כדי לפתור בעיות אלו, פותחה טכנולוגיה לגידול תאי אב סטרומליים על ג'ל קולגן, המאפשרת להסיר את מושבות הפיברובלסטים שגודלו מפני השטח לצורך השתלה הטרוטופית לאחר מכן. שיבוטים בודדים של פיברובלסטים סטרומליים שגודלו מתאי מח עצם של עכברי CBA ושרקנים נכרתו יחד עם שבר מציפוי הג'ל והושתלו באופן הטרוטופי - מתחת לקפסולת הכליה של עכברים סינגניים או לתוך שריר הבטן של שרקנים עצמיים. כאשר הושתלו לשריר, המושבות על הג'ל הונחו בנדני עצם.

המחברים מצאו כי 50-90 יום לאחר השתלת מושבות פיברובלסטים של מח עצם, נצפתה התפתחות של עצם או עצם ורקמה המטופויאטית באזור ההשתלה ב-20% מהמקרים. ב-5% מבעלי החיים שעברו השתלה, מוקדי רקמת העצם שנוצרו הכילו חלל מלא במח עצם. בתוך גלילי העצם, למוקדים אלו הייתה צורה מעוגלת וקפסולה שנבנתה מרקמת עצם עם אוסטאוציטים ושכבה אוסטאובלסטית מפותחת היטב. חלל מח העצם הכיל רקמה רשתית עם תאים מיאלואידים ותאי אריתרואיד, שיחסם הפרופורציונלי לא היה שונה מזה שבמח עצם רגיל. בכליה, המושתל היה איבר מח עצם טיפוסי שנוצר במהלך השתלת מח עצם טבעי, כאשר קפסולת העצם מכסה את חלל מח העצם רק מצד קפסולת הכליה. הרקמה ההמטופויאטית כללה אלמנטים מיאלואידים, אריתרואידים ומגה-קריוציטיים. לסטרומה של חלל מח העצם הייתה מערכת סינוסים מפותחת היטב והכילה תאי שומן אופייניים. במקביל, נמצאה רקמת עצם ללא סימני המטופויזה באזור ההשתלה של כמה מושבות מתחת לקפסולת הכליה. מחקר פוטנציאלי ההתרבות וההתמיינות של שיבוטים בודדים נמשך על זני מח עצם חד שבטיים של ארנבות, שתאיהן הושעו מחדש במדיום מזין ובספוג איבלון נפרד עם מסה של 1-2 מ"ג הושתלו מתחת לקפסולת הכליה של תורם מח עצם ארנבת. תאים של 21 זנים חד שבטיים עברו השתלה עצמית כזו. התוצאות נלקחו בחשבון לאחר 2-3 חודשים. המחברים מצאו שב-14% מהמקרים, הזנים החד שבטיים המושתלים יצרו איבר מח עצם המורכב מרקמת עצם וחלל מח עצם מלא בתאים המטופויאטיים. ב-33% מהמקרים, הזנים המושתלים יצרו עצם קומפקטית בגדלים משתנים עם אוסטאוציטים שקועים בחללים ושכבה אוסטאובלסטית מפותחת. במקרים מסוימים, רקמה רשתית ללא עצם או אלמנטים המטופויאטיים התפתחה בספוגים עם השיבוטים המושתלים. לעיתים, נוצרה סטרומה רטיקולרית עם רשת מפותחת היטב של סינוסואידים, אך לא הייתה מאוכלסת בתאים המטופויאטיים. לפיכך, התוצאות שהתקבלו היו דומות לנתונים שהתקבלו במהלך השתלת שיבוטים על ג'ל קולגן. עם זאת, אם השתלת שיבוטים שגודלו על מצע הביאה להיווצרות רקמת מח עצם ב-5% מהמקרים, רקמת עצם ב-15% ורקמה רטיקולרית ב-80% מהמקרים, אז עם השתלת זנים חד שבטיים, נצפתה היווצרות של אלמנטים של מח עצם ב-14% מהמקרים, רקמת עצם ב-53% ורקמה רטיקולרית ב-53% מהמקרים. לדברי המחברים, הדבר מצביע על כך שהתנאים למימוש פוטנציאל ההתרבות וההתמיינות של פיברובלסטים סטרומליים במהלך השתלה על פיגומים נקבוביים היו אופטימליים יותר מאשר במהלך השתלתם במעטפות עצם ועל מצע קולגן.ייתכן כי השימוש בשיטות מתקדמות יותר של גידול והשתלה הפוכה של שיבוטים יכול לשפר את התנאים למימוש פוטנציאל ההתמיינות שלהם על ידי שיבוטים ולשנות יחסים אלה. כך או אחרת, אך המשמעות העיקרית של המחקרים שנערכו היא שכמה שיבוטים של תאי סטרומה מסוגלים ליצור רקמת עצם ובו זמנית לספק סביבה המטופויטית סטרומלית לשלושה נבטים של המטופויזה של מח עצם בו זמנית: אריתרואיד, מיאלואידי ומגה-קריוציט, ויוצרים פלטפורמות גדולות למדי של רקמה המטופויטית ומסת עצם מסוימת.

לאחר מכן, התייחסו המחברים לסוגיית יכולתם של תאי אב סטרומה קלונוגניים בודדים לעבור סוגים אלה של התמיינות תאים במערכת סגורה של תאי דיפוזיה. בנוסף, היה צורך לקבוע האם לשבטים בודדים יש פוליפוטנטיות או שמא ביטוי פוטנציאל ההתמיינות דורש אינטראקציה שיתופית של מספר שיבוטים בעלי תכונת ציטו-התמיינות קבועה, אשר היחסים השונים ביניהם קובעים את היווצרות העדיפה של רקמת עצם, רשתית או סחוס. על ידי שילוב של שתי גישות מתודולוגיות - השגת זנים חד שבטיים של תאי אב סטרומה ממח עצם והשתלתם לתאי דיפוזיה - ר. צ'אילאקיאן ושותפיו למחברים (2001) השיגו תוצאות שאפשרו להם להתקרב להבנת הארגון המבני של סטרומה ממח עצם. השתלת זנים חד שבטיים של תאי אב סטרומה לתאים מסוג O הביאה להיווצרות של רקמת עצם וסחוס כאחד, דבר המצביע על יכולתם של צאצאי תא יוצר מושבות סטרומה יחיד ליצור בו זמנית רקמת עצם וסחוס. ההנחה שרקמת עצם וסחוס מקורה בתא אב סטרומה משותף הועלתה שוב ושוב. עם זאת, להשערה זו לא היה אישור ניסיוני מדויק. היווצרות עצם וסחוס בתאי דיפוזיה הייתה ההוכחה ההכרחית לקיומו של תא אב משותף לשני סוגי רקמות אלה בקרב תאי גזע סטרומה של מח עצם.

לאחר מכן, 29 זנים שבטיים של המעברים השני-שלישי שהתקבלו מתרביות ראשוניות של מח עצם ארנבת הוכנסו לתאי דיפוזיה והושתלו תוך-צפקית בבעלי חיים הומולוגיים. המחקרים הראו כי 45% מהזנים החד-שבטיים של מח עצם הם בעלי פוטנציאל אוסטאוגני. תשעה תאים הכילו אך ורק רקמה רשתית, אך היא הייתה קיימת יחד עם רקמת עצם וסחוס ב-13 תאים נוספים, שהיוו 76% מכלל הזנים. בתאים מסוג O, שבהם התמיינות של רקמת עצם וסחוס הייתה אפשרית, נחקרו 16 זנים. בארבעה תאים (25%) נוצרה גם רקמת עצם וגם רקמת סחוס. יש לציין שוב כי במחקרים של ר. צ'אילאקיאן ואחרים (2001), תאי אב בודדים עברו 31 עד 34 כפילות בתוך זן תאים, וצאצאיהם כללו 0.9-2.0 x 109 ^תאים. מספר המיטוזה שעברו תאי אב של זנים רב-שבטיים היה זהה כמעט לחלוטין לזה של זנים חד-שבטיים. קצב ההתפתחות של זנים פוליקלונאליים, במיוחד בשלב הראשון של היווצרותם, היה תלוי במידה רבה במספר המושבות ששימשו ליזום הזנים. זנים דיפלואידיים של פיברובלסטים עובריים אנושיים (WI-38), כאשר שובטו מחדש ברמות הכפלה 12-15, יצרו גם מושבות שונות בקוטר ובתכולת התאים. מושבות גדולות המכילות יותר מ-103 תאים היוו רק 5-10%. עם עלייה במספר החלוקות, אחוז המושבות הגדולות ירד. זנים חד-שבטיים ופוליקלונאליים של פיברובלסטים סטרומאליים של מח עצם שמרו על סט דיפלואידי של כרומוזומים לאחר 20 הכפלות או יותר, ונטיית התפתחותם הייתה דומה לדינמיקה של התפתחות זנים דיפלואידיים של פיברובלסטים עובריים. ניתוח פוטנציאל ההתמיינות של תאי אב סטרומאליים של מח עצם בודדים, שבוצע על ידי השתלת זנים חד-שבטיים לתאי דיפוזיה, הראה שמחציתם היו אוסטאוגניים. מושבות גדולות היוו 10% ממספרן הכולל. כתוצאה מכך, מספר התאים היוצרים מושבות אוסטאוגניות התאים לכ-5% מכלל אוכלוסייתם. המסה הכוללת של תאי אב אוסטאוגניים שזוהו על ידי המחברים כללה תאים המסוגלים ליצור בו זמנית רקמת עצם וסחוס. יתר על כן, נקבע לראשונה כי לשני סוגי רקמות אלה באורגניזם בוגר יש תא אב משותף: 25% מהשיבוטים שנבדקו נוצרו על ידי תאים כאלה, ומספרם באוכלוסיית תאי האב הכוללת היה לפחות 2.5%.

לפיכך, השתלה הטרוטופית של שיבוטים בודדים של פיברובלסטים במח עצם חשפה היבטים חדשים של הארגון המבני של אוכלוסיית תאי האב המזנכימליים. נמצאו תאי אב סטרומליים המסוגלים להעביר מיקרו-סביבה ספציפית עבור כל הנבטים ההמטופויאטיים בו זמנית, שמספרם בקרב השיבוטים הגדולים שנחקרו במודלים שונים נע בין 5 ל-15% (0.5-1.5% מכלל תאי האב שזוהו). יחד עם שיבוטים המעבירים את המיקרו-סביבה המלאה של מח העצם, ישנם תאי אב שנקבעו רק לאוסטאוגנזה, אשר כאשר מועברים במערכת פתוחה, יוצרים רקמת עצם שאינה תומכת בהתפתחות המטופויזה. מספרם מתוך המספר הכולל של תאי האב הוא 1.5-3%. חלק מתאים אלה מסוגלים ליצור רקמת עצם עם תקופת תחזוקה עצמית מוגבלת. כתוצאה מכך, אוכלוסיית תאי האב הסטרומליים היא הטרוגנית בפוטנציאל ההתמיינות שלה. ביניהם, ישנה קטגוריה של תאים הטוענים להיות תאי גזע סטרומליים, המסוגלים להתמיין בכל שלושת הכיוונים האופייניים לרקמת סטרומלית של מח עצם, וליצור עצם, סחוס ורקמה רשתית. הנתונים המוצגים מאפשרים לנו לקוות שבאמצעות סמני תאים שונים, ניתן יהיה לקבוע את תרומתם של כל סוג של תאי סטרומליים לארגון מיקרו-סביבה ספציפית ולתמיכה בהמטופויאזה בתרביות דקסטר.

מאפיינים של תאי גזע מזנכימליים

בשנים האחרונות נקבע כי בתרביות מח עצם נייחות, תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים מיוצגים על ידי אוכלוסייה מוגבלת של תאים אגרנולריים קטנים (תאי RS-1) המאופיינים ביכולת יצירת מושבות נמוכה והיעדר ביטוי של האנטיגן Ki-67 הספציפי לתאים מתרבים. הפרמטרים האנטיגניים של תאי RS-1 רדומים שונים מספקטרום האנטיגנים של תאי אב סטרומליים מחויבים המתרבים במהירות. נקבע כי קצב התפשטות גבוה של תאי אב מחויבים נצפה רק בנוכחות תאי RS-1. בתורם, תאי RS-1 מגבירים את קצב הגדילה שלהם תחת השפעת גורמים המופרשים על ידי הנגזרות הבוגרות ביותר של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים. נראה כי תאי RS-1 הם תת-מחלקה של תאי MSC לא מחויבים המסוגלים למחזור. במבחנה, תאי אב סטרומליים של מח עצם עמידים ל-5-פלואורורציל מאופיינים בתכולת RNA נמוכה וביטוי גבוה של הגן אורניתין דקרבוקסילאז, סמן של תאים שאינם מתרבים.

ריבוי אינטנסיבי של תאי אב סטרומליים מתחיל לאחר קיבועם על המצע. במקרה זה, פרופיל הסמנים של תאים בעלי התמיינות נמוכה מתבטא: SH2 (קולטן TGF-(3)), SH3 (תחום חלבון איתות), קולגן מסוג I ו-III, פיברונקטין, קולטני הידבקות VCAM-1 (CD106) ו-ICAM (CD54), קדהרין-11, CD44, CD71 (קולטן טרנספרין), CD90, CD120a ו-CD124, אך ללא ביטוי של סמנים אופייניים לתאי גזע המטופויאטיים (CD34, CD14, CD45). גידול שבטי מאפשר מעבר חוזר ונשנה של תאי גזע מזנכימליים עם היווצרות של תאי אב סטרומליים הומוגניים גנטית רבים בתרבית. לאחר 2-3 מעברים, מספרם מגיע ל-50-300 מיליון. בתרבית בעלת צפיפות מספקת, לאחר הפסקת ההתפשטות, תאי אב סטרומליים, בניגוד לפיברובלסטים של רקמה המטופויאטית, מתמיינים לתאי אדיפוציטים, מיוציטים, סחוס ותאי עצם. שילוב של שלושה אותות בידול רגולטוריים, כולל 1-מתיל-איזובוטילקסנטין (גורם ליצירת cAMP תוך תאי), דקסמתזון (מעכב של פוספוליפאזות A ו-C) ואינדומטצין (מעכב של ציקלואוקסיגנאז, אשר גם מפחית את פעילות התרומבוקסאן סינתאז), ממיר עד 95% מתאי האב המזנכימליים לאדיפוציטים. היווצרות אדיפוציטים מיסודות סטרומליים לא בשלים מאושרת על ידי ביטוי של גן ליפופרוטאין ליפאז, זיהוי היסטוכימי של אפוליפופרוטאינים וקולטנים פראוקסיסומלים. תאים מאותו שיבוט תחת השפעת TGF-b במדיום נטול סרום יוצרים אוכלוסייה הומוגנית של כונדרוציטים. תרבית התאים הרב-שכבתית של רקמת סחוס זו מאופיינת במטריצה בין-תאית מפותחת המורכבת מפרוטאוגליקן וקולגן מסוג II. במצע מזין עם 10% השפעת קומפלקס אותות התמיינות המורכב מ-β-גליצרוֹפְסְפָּטַז (תורם פוספט אנאורגני), חומצה אסקורבית ודקסמתזון באותה תרבית של תאי אב סטרומליים מובילה להיווצרות של אגרגטים תאיים. בתאים כאלה נצפית עלייה הדרגתית בפעילות פוספטאז אלקליין וברמות אוסטאופונטין, דבר המצביע על היווצרות רקמת עצם, אשר מינרליזציה של התאים שלה מאושרת על ידי עלייה הדרגתית בתכולת הסידן התוך-תאית.

על פי נתונים מסוימים, יכולתם של תאי גזע מזנכימליים לחלוקה ורבייה בלתי מוגבלים של סוגים שונים של תאים מקו ההתמיינות המזנכימלית משולבת עם רמה גבוהה של פלסטיות. כאשר הם מוחדרים לחדרים או לחומר הלבן של המוח, תאי גזע מזנכימליים נודדים לפרנכימה של רקמת העצבים ומתמיינים לנגזרות של קו התאים הגליה או הנוירונים. בנוסף, קיים מידע על התמיינות טרנס-דיפרנציאציה של תאי MSC לתאי גזע המטופויאטיים הן במבחנה והן בגוף חי. ניתוח מעמיק יותר בכמה מחקרים קבע פלסטיות גבוהה במיוחד של תאי MSC, המתבטאת ביכולתם להתמיין לאסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים, נוירונים, קרדיומיוציטים, תאי שריר חלק ותאי שריר שלד. מספר מחקרים על פוטנציאל ההתמיינות של תאי MSC במבחנה ובגוף חי קבעו שתאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים ממקור מח עצם מתמיינים באופן סופני לקווי תאים היוצרים רקמת עצם, סחוס, שריר, עצב ושומן, כמו גם גידים וסטרומה התומכים בהמטופויזה.

עם זאת, מחקרים אחרים לא הצליחו לחשוף סימנים כלשהם להגבלת הפלוריפוטנטיות של גנום תאי הגזע המזנכימליים ואוכלוסיות האב של תאי סטרומה, למרות שנחקרו יותר מ-200 שיבוטים של תאי MSC שבודדו מתרבית ראשונית אחת כדי לבחון את הפלוריפוטנטיות האפשרית של תאי סטרומה. הרוב המכריע של השיבוטים במבחנה שמרו על היכולת להתמיין בכיוונים אוסטאוגניים, כונדרוגניים ואדיופוגניים. כאשר נשללת ההסתברות לנדידת תאי מקבל על ידי השתלת תאי גזע מזנכימליים מתחת לקפסולת הכליה או בתאי דיפוזיה, התברר שתאי אב סטרומה in situ שומרים על פנוטיפ הטרוגני, דבר המצביע על היעדר גורמי הגבלה באזור ההשתלה או על היעדר פלוריפוטנטיות של תאי MSC כשלעצמם. יחד עם זאת, קיומם של סוג נדיר של תאי גזע פלוריפוטנטיים סומטיים, שהם מבשרי תאים נפוצים של כל תאי הגזע הבוגרים, מותר.

הרב-פוטנטיות, אך לא הפלוריפוטנטיות, של תאי גזע מזנכימליים אמיתיים, המהווים חלק קטן מאוד מתאי מח העצם ומסוגלים להתרבות בתנאים מסוימים במהלך גידול חוץ גופי מבלי להתמיין, מתבטאת בהיצמדותם המושרת לתאי עצם, סחוס, שומן ורקמת שריר, כמו גם לטנוציטים ולאלמנטים סטרומליים התומכים בהמטופויאזה. ככלל, חשיפה ממושכת למדיום תרבית עם סרום עגל עוברי מעוררת את שחרור תאי MSC לתאי אב סטרומליים מחויבים, שצאצאיהם עוברים התמיינות סופית ספונטנית. חוץ גופית, ניתן להשיג היווצרות ממוקדת של אוסטאובלסטים על ידי הוספת דקסמתזון, β-גליצרפוספט וחומצה אסקורבית למדיום ההתניה, בעוד ששילוב של אותות התמיינות של דקסמתזון ואינסולין גורם להיווצרות של אדיפוציטים.

נקבע כי לפני הכניסה לשלב ההתמיינות הסופית, תאי גזע מזנכימליים (MSC) של מח עצם מתמיינים בתחילה לתאי גזע מזנכימליים דמויי פיברובלסטים בתנאי גידול מסוימים. נגזרות של תאים אלה in vivo משתתפות ביצירת עצמות, סחוס, גידים, רקמת שומן ושריר, כמו גם הסטרומה התומכת בהמטופויזה. מחברים רבים מבינים את המונח "תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים" כמשמעותם הן של ה-MSC עצמם והן של תאי אב סטרומליים מחויבים של מח עצם ורקמות מזנכימליות. ניתוח שבטי של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים ממקור מח עצם הראה כי קצת יותר משליש מכלל השיבוטים מתמיינים לאוסטאוציטים, כונדרואידואידואידים ואדיפוציטים, בעוד שתאי השיבוטים הנותרים בעלי פוטנציאל אוסטאוגני בלבד ויוצרים רק כונדרואידואידים ואוסטאוציטים. שיבוט של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים כמו BMC-9, בתנאים מיקרו-סביבתיים מתאימים, מתמיין לתאים בעלי פנוטיפ ומאפיינים פונקציונליים לא רק של אוסטאובלסטים, כונדרוציטים ואדיפוציטים, אלא גם של תאי סטרומה התומכים בהמטופויזה. שיבוט של תאי RCJ3.1 שבודדו ממח עצם עוברי חולדה מתמיין לתאים מזנכימליים מפנוטיפים שונים. תחת הפעולה המשולבת של חומצה אסקורבית, β-גליצרופספט ודקסמתזון, האלמנטים התאיים של שיבוט זה יוצרים תחילה מיוציטים רב-גרעיניים, ולאחר מכן, ברצף, אדיפוציטים, כונדרוציטים ואיי שריר חלק. אוכלוסיית התאים הגרנולאריים מהפריאוסטאום של עוברי חולדה מתאימה לתאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים לא מחויבים, מכיוון שהוא מאופיין בקצב התפשטות נמוך, אינו מבטא סמני התמיינות, ובתנאי תרבית מתמיין ליצירת כונדרו-, אוסטאו- ואדיפוציטים, כמו גם תאי שריר חלק.

לפיכך, יש להכיר בכך ששאלת הפלוריפוטנטיות או המולטיפוטנטיות של הגנום של תאי גזע מזנכימליים נותרה פתוחה, מה שמשפיע, בהתאם, גם על הרעיונות לגבי פוטנציאל ההתמיינות של תאי אב סטרומליים, שגם הוא לא נקבע באופן סופי.

מאפיין חשוב ומוכח ניסיוני של תאי גזע מזנכימליים הוא יכולתם לעזוב את גומחת הרקמה ולהסתובב בזרם הדם הכללי. כדי להפעיל את תוכנית ההתמיינות הגנטית, תאי גזע כאלה במחזור הדם חייבים להיכנס למיקרו-סביבה המתאימה. הוכח כי עם החדרה שיטתית של תאי גזע מזנכימליים לזרם הדם של בעלי חיים מקבלים, תאים לא בשלים מושתלים באיברים ורקמות שונים, ולאחר מכן מתמיינים לתאי דם, מיוציטים, אדיפוציטים, כונדרוציטים ופיברובלסטים. כתוצאה מכך, באזורי רקמה מקומיים, מתרחשות אינטראקציות של ויסות אותות בין תאי אב סטרומליים לא מחויבים ותאי אב מחויבים, כמו גם בינם לבין התאים הבוגרים הסובבים אותם. ההנחה היא שההתמיינות נגרמת על ידי גורמי בקרה פאראקריניים ממקור מזנכימלי ולא מזנכימלי (גורמי גדילה, איקוסנואידים, מולקולות מטריצה חוץ-תאית), המספקים קשרים מרחביים וזמניים במיקרו-סביבה של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים. לכן, נזק מקומי לרקמה מזנכימטית אמור להוביל להיווצרות אזורים במיקרו-סביבה של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים, השונים מבחינה איכותית ממכלול האותות הרגולטוריים של רקמות שלמות, שבהם מתרחשים תהליכי התחדשות פיזיולוגיים ולא תהליכי תיקון. הבדל זה חשוב ביותר מבחינת ההתמחות של הפנוטיפ התאי במיקרו-סביבה הנורמלית והנגרמת על ידי נזק.

על פי המושגים, כאן טמונים המנגנונים של ההבדל הבסיסי בין שני התהליכים הידועים - התחדשות פיזיולוגית והתפשטות דלקתית. הראשון שבהם מסתיים בשיקום ההרכב התאי הייעודי של הרקמה ותפקודה, בעוד שתוצאת יישום תהליך ההתפשטות היא היווצרות של יסודות רקמת חיבור בוגרת ואובדן תפקוד של אזור הרקמה הפגוע. לפיכך, כדי לפתח תוכניות אופטימליות לשימוש בתאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית-פלסטית, יש צורך במחקר מעמיק של מאפייני ההשפעה של גורמים מיקרו-סביבתיים על התמיינות תאי MSC.

תלות מבנה תאי הגזע בווסתים פארא-אוטוקריניים תאיים, שביטוים מווסת על ידי אותות חיצוניים, אינה מוטלת בספק. בין תפקידי הגורמים הרגולטוריים, החשובים ביותר הם שליטה על חלוקה אסימטרית של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) וביטוי של גנים הקובעים את שלבי ההתחייבות ומספר חלוקות התאים. אותות חיצוניים, שעליהם תלויה התפתחות נוספת של תאי גזע מזנכימליים, מסופקים על ידי המיקרו-סביבה שלהם. במצב לא בשל, תאי גזע מזנכימליים מתרבים במשך זמן רב, תוך שמירה על היכולת להתמיין לשורות של אדיפוציטים, מיופיברובלסטים, סטרומה של רקמה המטוגנית, תאי סחוס ותאי עצם. נקבע כי אוכלוסייה מוגבלת של אלמנטים תאיים סטרומאליים שליליים ל-CD34 המסתובבים בדם חוזרת מזרם הדם הכללי לסטרומה של מח העצם, שם היא הופכת לשורות של תאי גזע המטופויאטיים חיוביים ל-CD34. תצפיות אלו מצביעות על כך שמחזור מחדש של תאי מזנכימה אב בזרם הדם שומר על איזון רקמות של תאי גזע סטרומאליים באיברים שונים על ידי גיוס מאגר משותף של אלמנטים סטרומאליים לא בשלים של מח העצם. התמיינות של תאי MSC לתאים בעלי פנוטיפים מזנכימליים מרובים והשתתפותם ברגנרציה או תיקון של עצם, סחוס, רקמת שומן וגידים in vivo הוכחה באמצעות מודלים של העברה אדופטיבית בבעלי חיים ניסיוניים. לדברי מחברים אחרים, נדידה מרחוק של תאי MSC לאורך מיטת כלי הדם משולבת עם תנועה למרחקים קצרים או מקומית של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים בתוך הרקמה במהלך תיקון סחוס, רגנרציה של שרירים ותהליכי שיקום אחרים.

עתודות גזע מקומיות של בסיס רקמת הסטרומה משמשות כמקור לתאים בתהליכי התחדשות רקמות פיזיולוגיות ומתחדשות על ידי הובלה מרחוק של תאי MSC כאשר משאבי גזע רקמת הסטרומה נצרכים. עם זאת, במצבים של צורך בגיוס חירום של פוטנציאל תאי מתקן, למשל, במקרה של טראומה פוליאוריתנית, כל שכבת ה-MSC משתתפת בתהליכי ההתחדשות המתקן, ותאי אב מזנכימליים של מח העצם מגויסים לפריפריה דרך זרימת הדם הכללית.

השתלת תאי גזע מזנכימליים

ניתן למצוא קווי דמיון מסוימים בין תהליכי התחדשות הרקמות הפיזיולוגיות לבין היווצרותם במהלך ההתפתחות התוך-רחמית. באמבריוגנזה של בני אדם ויונקים, היווצרותם של סוגים שונים של תאים מיוחדים מתרחשת ממאגר שכבות הנבט האקטו-, המזו- והאנדודרמליות, אך בהשתתפות חובה של המזנכימה. רשת תאים רופפת של רקמת מזנכימה עוברית מבצעת פונקציות רגולטוריות, מטבוליות, מסגרתיות ומורפוגנטיות רבות. הנחת האיברים הזמניים מתרחשת רק לאחר עיבוי המזנכימה עקב צמיחה קלונוגנית של תאי אב, המייצרים את האותות המורפוגנטיים הראשוניים של אורגנוגנזה. נגזרות סטרומליות של המזנכימה העוברית יוצרות את המסגרת התאית של האיברים הזמניים ויוצרות את הבסיס לאספקת האנרגיה-פלסטית העתידית שלהם עקב גדילת כלי הדם והלימפה הראשוניים. במילים אחרות, האלמנטים הסטרומליים של יחידת המיקרו-מחזור הדם של איברי העובר נוצרים לפני היווצרות היחידות המבניות והתפקודיות שלהם. בנוסף, נדידה פעילה של תאים מזנכימליים במהלך אורגנוגנזה מספקת התמצאות מרחבית של איברים מתפתחים על ידי סימון גבולות הנפח שלהם באמצעות הגבלת סוגי Hox הומאוטיים. המסגרת הסטרומלית משמשת גם כבסיס להרכבת יחידות מבניות ותפקודיות של איברים פרנכימטיים, אשר לעתים קרובות כוללים תאים שונים לחלוטין מבחינה מורפוגנטית ותפקודית. כתוצאה מכך, במהלך אמבריוגנזה, תפקידי המזנכימה הם ראשוניים ומתממשים באמצעות יצירת אותות רגולטוריים המפעילים ריבוי והתמיינות אזוריים של תאי אפיתל אב. תאי מזנכימה עובריים מייצרים גורמי גדילה כגון HGF-b, HGF-b, CSF, עבורם לתאי אב פרנכימליים יש קולטנים תואמים. ברקמה בוגרת ממוינת של אורגניזם בוגר, רשת התאים הסטרומלית מייצרת גם אותות לשמירה על הכדאיות וההתמיינות של תאי אב ממקור שאינו מזנכימלי. עם זאת, ספקטרום האותות הרגולטוריים הסטרומליים באונטוגנזה לאחר לידה שונה (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF וכו') ומטרתו להבטיח התחדשות פיזיולוגית או תיקון של אזורי רקמה פגומים. יתר על כן, המאפיינים הספקטרליים של גורמי הרגולציה הסטרומליים בכל סוג רקמה ואפילו בתוך איבר אחד שונים. בפרט, המטופויזה ולימפופואזה עם התפשטות והתמיינות של תאים המטופויאטיים ואימונולוגיים מתרחשים רק באיברים מסוימים, שבגבולותיהם פועלת המיקרו-סביבה הסטרומלית, המספקת תנאים להבשלת תאים המטופויאטיים ותאי לימפואידים. יכולתם של תאים המטופויאטיים ותאי לימפואידים לאכלס מחדש איבר נתון, להתרבות ולהתבגר בנישות המיקרו-מבניות שלו תלויה בגורמי הרגולציה של המיקרו-סביבה.

בין מרכיבי המטריצה החוץ-תאית שתאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים מייצרים, יש לציין פיברונקטין, למינין, קולגן ופרוטאוגליקנים, כמו גם CD44 (קולטן היאלורונן ואוסטאופונטין), אשר ממלאים תפקיד מרכזי בארגון אינטראקציות בין-תאיות וביצירת המטריצה החוץ-תאית במח העצם וברקמת העצם. הוכח שתאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים במח העצם יוצרים סביבה סטרומלית המספקת אותות אינדוקטיביים ורגולטוריים לא רק לתאי MSC, אלא גם לתאי אב המטופויאטיים ולתאי גזע אחרים שאינם מזנכימליים של מח העצם. ידוע כי השתתפותם של תאי MSC בהמטופויזה נקבעת על ידי יכולתם להתמיין לתאי סטרומה התומכים בהמטופויזה, ואות אינפורמטיבי זה מתקבל על ידי תאי MSC ישירות מתאי גזע המטופויאטיים. זו הסיבה שבתרבית רשת תאי האב הסטרומליים משמשת כבסיס הזנה לפיתוח כל השיבוטים של תאים המטופויאטיים.

באורגניזם בוגר, עוצמת ההמו- והלימפופויאזה נמצאת במצב של שיווי משקל דינמי עם "ההוצאות" של תאי דם בוגרים ותאי מערכת החיסון בפריפריה. מכיוון שתאי סטרומה של מח העצם ואיברי הלימפה מתחדשים לעתים רחוקות ביותר, לא מתרחש רה-ארגון משמעותי של מבנים סטרומליים בהם. המערכת יכולה לצאת משיווי משקל דינמי על ידי נזק מכני לכל אחד מאיברי ההמו- או הלימפופויאזה, מה שמוביל לשינויים אחידים עוקבים הנוגעים לא רק ולא כל כך לאלמנטים ההמטופויאטיים או הלימפהאידים כמו למבנים הסטרומליים של האיבר הפגוע. בתהליך ההתחדשות המתקנת, נוצר תחילה בסיס הסטרומה, אשר לאחר מכן מאוכלס מחדש על ידי תאים המטופויאטיים או אימונוקומפטנטיים. עובדה ידועה זו הופכת התחדשות פוסט-טראומטית למודל נוח לחקר המיקרו-סביבה הסטרומלית של איברים המטופויאטיים. בפרט, ריקון מכני של חלל המדולרי של עצמות צינוריות משמש לחקר התחדשות תיקון של מח עצם - גרידה, המאפשרת הסרה מהירה ויעילה של רקמה המטופויאטית ממצב של שיווי משקל דינמי. במחקר תהליכי ההתחדשות התיקון של הרכיבים ההמטופויאטיים והסטרומליים של מח עצם לאחר ריקון מכני של חלל המדולרי של עצם השוקה של שרקנים, נמצא כי אין מתאם ישיר בין מדדי ההתחדשות של תאים המטופויאטיים ותאים סטרומליים (מספר התאים ההמטופויאטיים, ריכוז ומספר תאי האב הסטרומליים). בנוסף, התברר כי עלייה באוכלוסיית תאי האב הסטרומליים מתרחשת מוקדם יותר לאחר הגרידה, והפיברובלסטים הסטרומליים עצמם הופכים חיוביים לפוספטאז, דבר אופייני לרקמה אוסטאוגנית. כמו כן, נקבע כי גרידה של 3-5 עצמות צינוריות מובילה לגדילת אוכלוסיית תאים זו במח העצם של עצמות שלא נותחו ואפילו בטחול, אשר אצל שרקנים הוא איבר לימפופויאטי בלבד.

התמונה המורפולוגית של תהליכי תיקון במח העצם של שוקיים שעברו גרידה של שרקנים תואמת בדרך כלל את הנתונים המתוארים בספרות שהתקבלו בניסויים על בעלי חיים ממינים אחרים, והדינמיקה של השינויים המתרחשים לאחר הסרת רקמה המטופויאטית זהה עבור כל מיני בעלי החיים וההבדל נוגע רק לפרמטרי זמן. מבחינה מורפולוגית, סדר השלבים של שיקום ההמטופויאזה בחלל המדולרי המרוקן מורכב מתהליכים עוקבים של ארגון קריש דם, היווצרות רקמת עצם סיבית גסה, ספיגתה, התפתחות סינוסואידים ויצירת סטרומה רשתית, אשר לאחר מכן מאוכלסת מחדש על ידי אלמנטים המטופויאטיים. במקרה זה, מספר תאי ההמטופויאטיים האב בתהליך התחדשות רקמת מח העצם עולה במקביל לעלייה בתכולת תאי הגזע ההמטופויאטיים.

יו. גרסימוב ושותפיו למחקר (2001) השוו שינויים במספר התאים ההמטופויאטיים ובמספר תאי האב הסטרומליים בשלבים בודדים של תהליך ההתחדשות. התברר ששינויים כמותיים בתאי מח עצם בעצם שעברה גרידה תואמים את הדינמיקה של המאפיינים המורפולוגיים של ההתחדשות. המחברים מקשרים את הירידה בתכולת התאים בעצם המתחדשת במהלך שלושת הימים הראשונים עם מוות של תאים המטופויאטיים עקב ההשפעה השלילית של המיקרו-סביבה שנוצרה על ידי הרקמה הרשתית המתרבה במוח העצם המשומר באזור האפיפיזה, כמו גם עם היווצרות מוקדי רקמת אוסטאואידים במוח העצם המשומר ונזק וסקולרי במהלך הגרידה. ביום ה-7-12, עלייה ברמת התאים הגרעיניים חופפת להופעת מוקדים בודדים של המטופויזה מיאלואידית באזורי התפשטות היסודות הסטרומליים. ביום ה-20 מופיעים אזורים משמעותיים של מח עצם מתחדש וסינוסים מפותחים היטב, המלווים בעלייה משמעותית במספר התאים הכולל. עם זאת, מספר האלמנטים ההמטופויאטיים בתקופה זו הוא 68% מרמת הביקורת. ממצא זה עולה בקנה אחד עם נתונים שפורסמו בעבר לפיהם מספר התאים ההמטופויאטיים לאחר גרידה מגיע לנורמה רק ביום ה-35-40 לאחר הניתוח.

בתקופה הפוסט-טראומטית המוקדמת, המקור העיקרי לשיקום ההמטופויאזה הם אלמנטים תאיים מקומיים שנשמרו במהלך הגרידה. בשלבים מאוחרים יותר, המקור העיקרי להתחדשות רקמת ההמטופויאטית של מח העצם הם תאי גזע המאכלסים מחדש אזורים סטרומה חופשיים. באשר לקטגוריות בודדות של תאי סטרומה (אנדותל, רשתית ואוסטאוגנית), המקורות המבטיחים את היווצרותם במהלך ארגון מחדש של חלל מח העצם נותרים לא ברורים. תוצאות המחקר של יו. ו. גרסימוב ושותפיו (2001) מצביעים על כך שבמח העצם שנשמר לאחר הגרידה, ריכוז התאים היוצרים מושבות של פיברובלסטים גבוה משמעותית מאשר במח עצם רגיל. המחברים סבורים שגרידה מביאה לשטיפה סלקטיבית אינטנסיבית יותר של תאים המטופויאטיים בהשוואה לתאי סטרומה יוצרי מושבות, המשתתפים ביצירת הסטרומה וקשורים חזק יותר לחומר העיקרי שלה מאשר תאים המטופויאטיים.

הדינמיקה של השינוי במספר התאים היוצרים מושבות פיברובלסטים מתואמת עם עוצמת תהליכי האוסטאוגנזה, ספיגה לאחר מכן של טרבקולות עצם ויצירת סטרומה רטיקולרית, המאוכלסת בתאים המטופויאטיים. רוב תאי האב הסטרומליים, במונחים שצוינו של התחדשות, יוצרים רקמת עצם סיבית גסה וסטרומה רטיקולרית. במקרה של שברים מורמליים בתנאים של אוסטאוסינתזה ממושכת, ביום החמישי באזור ההתחדשות ריכוז ומספר התאים היוצרים מושבות פיברובלסטים עולים, ובמהלך תקופת היווצרות העצם האינטנסיבית מספרם עולה פי 6. ידוע שתאי מח עצם היוצרים מושבות פיברובלסטים הם בעלי תכונות אוסטאוגניות. מספר תאי האב הסטרומליים עולה לפני התיישבות שטח מח העצם המגורר על ידי תאים המטופויאטיים. ממצא זה תואם היטב את הנתונים שתאי סטרומה מספקים את היווצרותה של מיקרו-סביבה המטופויאטית. ככל הנראה, יצירת מיקרו-סביבה המטופויאטית תואמת רמה מסוימת של התחדשות רקמות סטרומליות, ומספר התאים ההמטופויאטיים עולה עם הרחבת הפלטפורמה הסטרומלית המתאימה להמטופואזה.

מעניינים ביותר הם נתוני המחברים לפיהם מיד לאחר הגרידה מספר תאי האב הסטרומליים בחלקים המרוחקים של השלד עולה. החל מהשעה השישית ועד היום העשרים כולל, נצפית עלייה של יותר מפי שניים הן בריכוז והן במספר התאים היוצרים מושבות פיברובלסטים בטיביה הנגדית. המנגנון של תופעה זו קשור כנראה לעובדה שפגיעה מסיבית במח העצם מובילה להיווצרות מספר רב של קרישי דם עם הרס סימולטני של מספר משמעותי של טסיות דם ושחרור של גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF) לדם, הידוע כגורם להתרבות של תאים היוצרים מושבות פיברובלסטים הממוקמים בגוף מחוץ למאגר השגשוג. בניסויים על ארנבות, מתן מקומי של תאי גזע מזנכימליים מקדם את שיקום רקמת הסחוס של מפרק הברך שניזוק בניתוח, דבר שיכול להיות קשור להיווצרות כונדרוציטים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים שהוזרקו. עם זאת, התחדשות תיקון של פגמי עצם בחולדות מעבדה משופרת משמעותית על ידי שימוש בתאי גזע מזנכימליים הסגורים במסגרת קרמית. לכן, ניתן להניח שאם לא RBOC, אז גורם אחר שמקורו בתאי סטרומה פגומים מפעיל השפעה מגרה מרחוק על התפשטות תאי אב מזנכימליים באזורי מח עצם שלמים ומגרה את נדידתם לאזור הפגם במח העצם. בתורו, נתון זה סותר נתוני ספרות משנים קודמות המצביעים על כך שתאי סטרומה האחראים על המיקרו-סביבה, בניגוד לתאים המטופויאטיים, אינם מסוגלים לנדוד ומקורם במקורות מקומיים.

אף על פי כן, תוצאות המחקר של יו. גרסימוב ושותפיו (2001) מצביעות על כך שטראומה מכנית גורמת לא רק לשינויים חדים ברקמת הסטרומה בעצם הקורטציה, אלא גם לשינויים משמעותיים בסטרומה בעצמות שלמות מרוחקות, כלומר, יש תגובה מערכתית של רקמת הסטרומה לטראומה מקומית. יתר על כן, כאשר נגרמת פוליטראומה - גרידה מרובה - תגובה זו מתחזקת ונצפית לא רק בעצם המנותחת ובחלקים מרוחקים של השלד, אלא גם באיברי הלימפה, ובפרט בטחול. המנגנון של תגובה מערכתית כזו של רקמת הסטרומה של מח העצם והטחול לטראומה מקומית ופוליטראומה נותר לא ידוע. ההנחה היא שתהליך זה קשור לפעולתו של גורם הומורלי המופרש על ידי הסטרומה המזנכימלית של חלל המדולרי של מח העצם. האפשרות לייצור על ידי תאי סטרומה של מח העצם והטחול של גורם הומורלי לא ספציפי לאיברים האחראי על התפשטות תאים היוצרים מושבות פיברובלסטים, מעידה נתונים על פעילותם המגרה מושבות בתרביות חד-שכבתיות של מח עצם.

בהקשר זה, ראוי לציין כי במתן סיסטמי של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים, נגזרותיהם מאכלסות מחדש לא רק את מח העצם, אלא גם את הרקמות האחרות, דבר המשמש, בפרט, לריפוי גנטי. הוכח כי במתן תוך ורידי של כמויות גדולות של תאי MSC עם גנום מסוג בר לעכברים עם מוטציה בגן קולגן I, תאי תורם מחליפים עד 30% מהתאים ברקמת העצם והסחוס של הנמענים, ותאי גזע מזנכימליים של עכברים שעברו טרנספקציה המפרישים IL-3 אנושי תומכים ביעילות בהמטופויאזה במשך 9 חודשים במקרה של מתן סימולטני שלהם עם תאי גזע המטופויאטיים אנושיים לעכברים בעלי לקות חיסונית.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

שינוי גנטי של תאי גזע מזנכימליים

בין ההצלחות של השינוי הגנטי הניסיוני של תאי MSC, ראוי לציין את טרנספקציה של גן פקטור IX לתוך תאי MSC אנושיים ולאחר מכן העברה של תאים טרנספקטיביים לעכברים בעלי מערכת חיסונית לקוי, מה שמוביל להופעת פקטור B אנטי-המופילי בדם במשך 8 שבועות לאחר ההשתלה. בניסוי זה, בוצעה שינוי פוסט-טרנסלציוני של פקטור IX על ידי y-גלוטמיל קרבוקסילאז בתאים שעברו טרנספקציה. טרנסדוקציה של תאי MSC עם וקטור רטרו-ויראלי המקודד לפקטור IX אנושי הייתה פחות מוצלחת - מתן לאחר מכן של תאים אלה לכלב עם המופיליה B סיפק רמה טיפולית של פקטור IX, תוך שמירה על עוצמת המוסטאזיס התקינה של קרישת דם, למשך 12 ימים בלבד.

השתלת תאי גזע מזנכימליים לפרנכימה של מוח בעלי חיים הראתה שתאים לא בשלים של תורמים הופכים לאוכלוסיות נוירונים וגליאליות כאחד. השתלת נגזרות נוירונים של רקמה מזנכימלית בריאה של התורם מאפשרת תיאורטית לתקן אנומליות גנטיות בחילוף החומרים של המוח בחולים עם מחלת גושה והפרעות אחרות של חילוף חומרים של שומנים, גנגליוזידים או פחמימות.

החיפוש הניסיוני אחר תנאים להתמיינות טרנס של תאי גזע סטרומה ממח עצם לתאי אב ברקמת עצב וכבד נמשך. תשומת הלב של החוקרים מתמקדת בשילובים של מעוררי התמיינות ותמיסות מיוחדות. בפרט, כדי לבודד את התרבית הראשונית של תאי סטרומה, תאי מח עצם שנשטפו והושעו מחדש במדיום תרבית DMEM/F12 (1/1) עם 10% סרום עגל עוברי נזרעים בצפיפות של 200,000/cm2. לאחר 24 שעות, תאים שאינם דבוקים מוסרים, ותאים דמויי פיברובלסטים המחוברים לפלסטיק עוברים תרבית במשך שבוע. לצורך התמיינות של תאי סטרומה ממח עצם לנוירובלסטים, משתמשים במדיום מותנה המתקבל על ידי גידול של שלושה ימים של התרבית הראשונית של פיברובלסטים עובריים של עכברים, כמו גם במדיום DMEM/F12 (1/1) עם 2% סרום עגל עוברי ותוספת של 20 ng/ml NF או 10-6 M חומצה רטינואית (נוירו-משרנים המשמשים להתמיינות עצבית של תאי גזע עובריים של עכברים ואנושיים). התמיינות של תאי סטרומה ממח עצם לתאי קדם הפטוציטים מושרת במדיום מותנה שנוצר כתוצאה מגידול של שלושה ימים של התרבית הראשונית של תאי כבד עובריים של עכברים במדיום DMEM/F12 (1/1) עם תוספת של 10% סרום עגל עוברי.

כאן יש לציין שוב כי תאי המושבה של סטרומה של מח העצם הם הטרומורפיים וניתן לחלקם לשני סוגים. הסוג הראשון כולל תאים דמויי פיברובלסטים היוצרים פילופודיה עם גרעינים גדולים וגרעין אחד או שניים. הסוג השני מיוצג על ידי תאים קטנים בצורת כישור. כאשר מתרבים תאים משני הסוגים במצע מותנה המתקבל על שכבת הזנה של פיברובלסטים עובריים ראשוניים של עכברים, תאים הדומים לנוירובלסטים מופיעים בתרבית ביום השלישי עד הרביעי. בשלב זה, לרוב יש להם צורה בצורת כישור עם שלב אחד או שניים המסתיימים בפילופודיה. פחות נפוצים הם תאים פירמידליים או כוכביים עם דנדריטים קצרים. לדנדריטים של חלק מהנוירובלסטים יש התרחבות אופיינית (ניצני צמיחה) וענפים בחלקם הדיסטלי, בעוד שלאחרים יש קונוסים ברורים של צמיחה עם פילופודיה, שדרכם הדנדריטים גדלים. מאפיינים מורפולוגיים דומים (ניצנים ואצטרובלי צמיחה עם פילופודיה) הטבועים בנוירובלסטים המתמיינים לנוירונים תוארו בפירוט במחקרים על נוירוגנזה. בהתבסס על כך, חלק מהמחברים מסיקים שהתאים שמצאו בתרבית הם נוירובלסטים. בפרט, א. שצ'גלסקיה ושותפיה (2002) לאחר גידול תרבית ראשונית של תאי סטרומה במשך שבועיים במצע מותנה שהוחלף כל 3 עד 4 ימים מצאו שחלק מהתאים התרבו תוך שמירה על מצב לא ממוין. כלפי חוץ, תאים כאלה דמו לפיברובלסטים וזוהו בתרבית יחד עם נוירובלסטים מתמיינים. רוב התאים (כ-80%) היו בשלבי התמיינות שונים לתאי רקמת העצבים, בעיקר לנוירונים. הזחלים הדנדריטיים של תאים אלה היו במגע הדוק זה עם זה, כך שהתאים יצרו בהדרגה מקטעים של רשת העצבים על המצע בצורת גדילים רב-תאיים ארוכים. התהליכים הדנדריטיים של הנוירובלסטים התארכו משמעותית, חלקם עלו על אורך גוף הנוירון עצמו פי 8-10. שיעור התאים הפירמידליים והכוכביים גדל בהדרגה. הדנדריטים של תאי הכוכבים הסתעפו. לדברי המחברים, ההתמיינות המאוחרת יותר של תאים פירמידליים ותאי כוכביים בהשוואה לתאים בצורת כישור תואמת את רצף השלבים של נוירוגנזה תקינה בבעלי חיים. כתוצאה מכך, המחברים מסיקים שתאי גזע סטרומה של מח עצם עוברים נוירוגנזה מושרה, שבמהלכה כל שלושת סוגי הנוירונים העיקריים נוצרים מנוירובלסטים במבחנה. קודמי תאי עצב זוהו גם במהלך גידול תאי סטרומה של מח עצם במשך 3-4 ימים במדיום עם 2% סרום עוברי ו-20 ננוגרם/מ"ל LIF. אך במקרה זה, תאי הגזע התחלקו לאט מאוד, התמיינות נוירובלסטים התרחשה רק ב-30% מהמקרים והם לא יצרו רשתות נוירונים. באמצעות חומצה רטינואית כאחד המעוררים של התמיינות תאי עצב, המחברים השיגו עד 25-30% מתאי העצב בתרבית,עם אלמנטים גליאליים בעיקר - אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים. נוירונים היוו רק שליש מכלל תאי העצב, למרות שהם היו מיוצגים על ידי שלושת הסוגים: תאים בצורת ציר, תאים פירמידליים ותאים כוכביים. ביום השישי של גידול תאי סטרומה במדיום עם חומצה רטינואית, תאי העצב התמיינו יותר, ואקסונים נמצאו בנוירונים פירמידליים בודדים, אשר בנוירואונטוגנזה רגילה מופיעים מאוחר יותר מהיווצרות תהליכים דנדריטים. לדברי המחברים, למרות התשואה הנמוכה של תאי עצב, לשיטת האינדוקציה של חומצה רטינואית יש יתרונות: אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים מבצעים פונקציות מיאלינציה ותזונתיות במהלך גדילת הדנדריטים והאקסונים והם נחוצים להיווצרות תקינה של רקמת עצב. לכן, לתיקון אזורים פגומים in vivo, עדיף להשתמש בתרחיף של נוירונים מועשר בתאי גליה.

בסדרת הניסויים השנייה, ניסו המחברים לגרום להתמיינות של תאי סטרומה ממח העצם לתאי כבד. לאחר שלושה ימים של גידול תאי גזע סטרומה ממח העצם במדיום מותנה שהושג על ידי דגירת תאי כבד עובריים של עכברים, נמצאו תאים גדולים וכדוריים, לרוב דו-גרעיניים, עם תכלילים ציטופלזמיים בגדלים שונים. תאים אלה היו בשלבי התמיינות שונים ונבדלו בגודלם, מספר הגרעינים ותכלילים בציטופלזמה. גליקוגן זוהה ברוב התאים הללו, ועל סמך זה זיהו אותם המחברים כתאי קדם-כבד. מכיוון שלא נמצאו תאים הדומים לנוירובלסטים בתרבית, הסיקו שהמדיום המותנה שהתקבל כתוצאה מגידול תאי כבד עובריים חסר גורמי התמיינות של תאי עצב, ולהפך, הכיל גורמים המעוררים התמיינות של תאי סטרומה ממח העצם לתאי קדם-כבד. לסיכום, המחברים מציעים נוכחות של פלוריפוטנטיות בתאי סטרומה ממח העצם, מכיוון שהם מתמיינים במבחנה לתאי עצב או רקמת כבד בהתאם למדיום המותנה הספציפי ולמעוררים שבהם נעשה שימוש.

מספר מחקרים אכן הראו בצורה נכונה את ההתמיינות של תאי סטרומה במח העצם לתאי קרדיומיוציטים, סחוס, עצם ורקמת עצב. ישנן עדויות לכך שבין תאי מח העצם יש אוכלוסיות של תאי גזע המסוגלים להתמיין לתאי כבד. לאור נתונים אלה, ניתן לראות בתוצאות הניסויים הנ"ל על עכברים אישור נוסף לנוכחותם במח העצם של תאי גזע מזנכימליים פלוריפוטנטיים המסוגלים להתמיין לתאים מרקמות שונות של אורגניזם בוגר.

השתלת תאי גזע מזנכימליים

בהשתלות קליניות, ניתן להשתמש בתאי גזע מזנכימליים אנושיים כדי להבטיח את התפשטותם של תאי גזע המטופויאטיים, כמו גם את צאצאיהם המוקדמים. בפרט, החדרת תאי גזע המטופויאטיים אוטולוגיים ותאי MSC לחולי סרטן לאחר כימותרפיה במינון גבוה מאיצה את שיקום מספר הנויטרופילים והטסיות בדם ההיקפי. השתלות אלו- ואוטולוגיות של תאי גזע מזנכימליים משמשות לטיפול במיאלומה נפוצה, אנמיה אפלסטית ותרומבוציטופניה ספונטנית - מחלות הקשורות לפגם ראשוני בסטרומה של הרקמה ההמטופויאטית. יעילות הטיפול התאי בפתולוגיה אונקוההמטולוגית גבוהה יותר במקרים רבים עם החדרה בו זמנית של תאי גזע סטרומליים והמטופויאטיים, המתבטאת בהפחתה בתקופה שלאחר הניתוח של שיקום ההמטופויאזה, ירידה במספר התוצאות הקטלניות עקב הרס לא סלקטיבי של תאי סרטן אזוריים ותאי סרטן במחזור הדם, שבהם גם תאי ההמטופויאטיים האב של המטופל מתים. הסיכויים לשימוש בתאי MSC ותאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים אחרים בפועל הקליני נובעים מהקלות היחסית של קבלתם משאיבת מח עצם, הרחבת התרבית וטרנספקציה של גנים טיפוליים. במקביל, ניתן להשתמש בהשתלה מקומית של תאי אב מזנכימליים רב-פוטנציאליים כדי לפצות על פגמי רקמה מקומיים, ובמקרה של תפקוד לקוי מערכתי של רקמות ממקור מזנכימלי, החדרתם לזרם הדם הכללי אינה נשללת.

מחברי עבודות, בהן מנותחים הסיכויים לשימוש בתאי גזע מזנכימליים (MSCs) להשתלות מקומיות ומערכתיות ולטיפול גנטי מנקודת מבט של ביולוגיה של תאי סטרומה, זהירים יותר בנימוקיהם. מח עצם לאחר לידה נחשב באופן מסורתי לאיבר המורכב משתי מערכות עיקריות של קווי תאים מוגדרים בבירור - הרקמה ההמטופויאטית עצמה והסטרומה התומכת הקשורה אליה. לכן, תאי גזע מזנכימליים של מח עצם נחשבו בתחילה אך ורק כמקור לבסיס סטרומלי לייצור גורמים רגולטוריים של המיקרו-סביבה ההמטופויאטית. לאחר מכן, תשומת הלב של החוקרים עברה לחקר תפקידם של תאי גזע מזנכימליים כמקור גזע של רקמות שלד. הנתונים האחרונים מצביעים על פוטנציאל בלתי צפוי להתמיינות של תאי סטרומה של מח עצם עם היווצרות רקמה עצבית או שרירית. במילים אחרות, תאי גזע מזנכימליים מפגינים פלסטיות טרנסגרמלית - היכולת להתמיין לסוגי תאים שאינם קשורים באופן פנוטיפי לתאי הרקמה המקורית. יחד עם זאת, היבטים מסוימים של הביולוגיה של תאי סטרומה במח העצם נותרים לא ברורים ולא פתורים, הן מבחינה ביולוגית כללית והן בפרטים פרטניים, כולל זיהוי, טבע, מקור, התפתחות ותפקוד in vivo של תאי סטרומה במח העצם, כמו גם פוטנציאל ההתמיינות המותר ex vivo ואפשרויות השימוש הטיפולי in vivo. הנתונים שהתקבלו על הפוטנציאל של תאי MSC, כמו גם תוצאות מחקרים על פוטנציאל ההתחדשות של תאי גזע אחרים, עומדים בסתירה חדה לדוגמות שנקבעו בביולוגיה.

כאשר תאי גזע סטרומה של מח עצם מתורבתים בצפיפות נמוכה, הם יוצרים מושבות נפרדות, שכל אחת מהן נובעת מתא אב יחיד. אחוז תאי האב הסטרומליים בתאי מח עצם בעלי גרעין, הנקבע על ידי יכולת יצירת המושבות, תלוי במידה רבה הן בתנאי הגידול והן במיני תאי ה-MSC. לדוגמה, במכרסמים, נוכחותם של תאי הזנה וסרום מוקרנים של מח עצם בתרבית היא הכרחית לחלוטין כדי להשיג את המספר המרבי של תאי אב סטרומליים, בעוד שבבני אדם, יעילות יצירת המושבות של תאי גזע מזנכימליים אינה תלויה הן בתאי ההזנה והן במדיום הגידול. מספר הגורמים המיטוגניים הידועים המגרים התפשטות תאי אב סטרומליים מוגבל. אלה כוללים PDGF, EGF, FGF, TGF-b ו-IGF1. בתנאי גידול אופטימליים, קווי MSC פוליקלונליים יכולים לעמוד ביותר מ-50 חלוקות תאים במבחנה, מה שמאפשר להשיג מיליארדי תאי סטרומה של מח עצם מ-1 מ"ל של שאיבתם.

עם זאת, אוכלוסיית תאי הסטרומה במח העצם היא הטרוגנית, המתבטאת הן בשונות בגודל המושבות, בקצבי היווצרות שונים, ובמגוון מורפולוגיה תאית, המכסה את הטווח בין תאים בצורת כישור דמויי פיברובלסטים לתאים שטוחים גדולים. במהלך התפתחותן של תרביות כאלה, נצפית הטרוגניות פנוטיפית גם לאחר 20 יום. חלק מהמושבות מאופיינות בביטוי גבוה של פוספטאז אלקליין, אחרות אינן מבטאות אותו כלל, ומושבות מהסוג השלישי הן חיוביות לפוספטאז באזור המרכזי ושליליות לפוספטאז בפריפריה. מושבות בודדות יוצרות גושים של רקמת עצם (תחילת המינרליזציה של המטריצה מסומנת על ידי צביעה באדום אליזרין או לסידן לפי ואן קוס). במושבות אחרות מתרחשת הצטברות שומן, המזוהה על ידי צביעת G באדום שמן. בתדירות נמוכה יותר, מושבות של תאי גזע מזנכימליים יוצרות סחוסים המוכתמים בכחול אלציאני).

לאחר השתלה אקטופית לבעלי חיים ניסיוניים, קווי MGK פוליקלונאליים יוצרים עצם אקטופית עם סטרומה רטיקולרית הקשורה למיאלופויזה ואדיפוציטים, ופחות שכיחים, עם רקמת סחוס. כאשר מושתלים קווים חד שבטיים של תאי סטרומה במח העצם, נצפית כימריזם במקרים מסוימים, שבהם העצם דה נובו מורכבת מתאי רקמת עצם, מכילה סטרומה ואדיפוציטים ממקור תורם, בעוד שהתאים משושלת ההמטופויאטית ומערכת כלי הדם נגזרים מהמקבל.

תוצאות מחקרים אלה מאשרות את אופי הגזע של תא האב הסטרומלי ממח העצם שממנו נגזר הקו המשובט. הן גם מצביעות על כך שלא כל התאים הקלונוגניים בתרבית הם באמת תאי גזע רב-פוטנציאליים. ישנם חוקרים המאמינים, ואנו שותפים לדעתם, כי המידע האמין ביותר על פוטנציאל ההתמיינות האמיתי של שיבוטים בודדים ניתן להשיג רק in vivo לאחר השתלה, ולא על ידי קביעת הפנוטיפ של נגזרותיהם in vitro. הביטוי בתרבית של סמנים פנוטיפיים של אוסטאו-, כונדרו- או אדיפוגנזה (שנקבעו על ידי mRNA או על ידי טכניקות היסטוכימיות) ואפילו ייצור מטריצה מינרליזציה אינם משקפים את מידת הפלוריפוטנטיות של שיבוט בודד in vivo. לכן, זיהוי תאי גזע בקבוצת תאי סטרומה אפשרי רק a posteriori, בתנאים המתאימים של מבחן השתלה ביולוגי. בפרט, כונדרוגנזה נצפית לעיתים רחוקות מאוד במערכות השתלה פתוחות, בעוד היווצרות סחוס רחוקה מלהיות נדירה במערכות סגורות כמו תאי דיפוזיה או תרביות מיקרומסה in vitro של תאי סטרומה, שבהן מושג מתח חמצן מקומי נמוך, מה שמקדם את היווצרות רקמת הסחוס. לכן, אפילו טכניקת ההשתלה, כמו גם תנאי תרבית חוץ גופיים שאינם ספציפיים, משפיעים באופן משמעותי על טווח ההתמיינות של MSC.

השתלה ניסיונית בתנאי ניסוי מוגדרים היא תקן הזהב לקביעת פוטנציאל ההתמיינות של תאי סטרומה ממח עצם ומרכיב מפתח בזיהוים. מבחינה היסטורית, מחקרים על השתלת תאי סטרומה ממח עצם קשורים לבעיה הכללית של השתלת מח עצם. נקבע כי המיקרו-סביבה ההמטופויאטית נוצרת על ידי השתלת שורות תאי סטרומה ממח עצם ומספקת התפתחות אקטופית של רקמה המטופויאטית באזור ההשתלה. מקור המיקרו-סביבה מהתורם, והרקמה ההמטופויאטית מהמארח מאפשרים לנו להתייחס לעצם אקטופית כהשתלת מח עצם "הפוכה" אמיתית. השתלה מקומית של תאי סטרומה ממח עצם מקדמת תיקון יעיל של פגמי עצם, בולט יותר מאשר עם התחדשות תיקון ספונטנית. מספר מחקרים פרה-קליניים על מודלים ניסיוניים הדגימו באופן משכנע את האפשרות להשתמש בהשתלות תאי סטרומה ממח עצם באורתופדיה, אם כי נדרשים עבודה וניתוח זהירים ביותר כדי לייעל שיטות אלו, אפילו במקרים הפשוטים ביותר. בפרט, התנאים האופטימליים להתפשטות תאי סטרומה אוסטאוגניים ex vivo טרם נקבעו, המבנה וההרכב של הנשא האידיאלי, כמו גם מספר התאים הדרושים להתחדשות עצם נפחית, נותרו בלתי מפותחים.

בנוסף לשימוש בתאי סטרומה מורחבים ממוח עצם (ex vivo) לצורך התחדשות רקמות ממקור מזנכימלי, הפלסטיות הלא שגרתית של תאי גזע עצביים (MSCs) פותחת יישומים פוטנציאליים לחידוש תאי עצב או להעברת תוצרי גנים למערכת העצבים המרכזית. באופן עקרוני, זה מפשט טיפול תאי לנזק למערכת העצבים, מכיוון שאין צורך להשיג תאי גזע עצביים אנושיים אוטולוגיים. דווח על יישומים פוטנציאליים של תאי מח עצם לייצור קרדיומיוציטים ותאי אב מיוגניים ממקור סטרומי אמיתי ואקסטראסטרומלי כאחד.

נערכים ניסויים בהשתלה סיסטמית של תאי סטרומה ממח עצם לטיפול במחלות שלד נפוצות. אין ספק שתאי סטרומה ממח עצם הם האוכלוסייה האחראית להפרעות גנטיות במחלות שלד, דבר שמודגם היטב על ידי העברת מידע גנטי באמצעות תאים אלה, מה שמוביל להיווצרות רקמת עצם פתולוגית בבעלי חיים ניסיוניים. עם זאת, טרם הוכחה יכולתם של תאי סטרומה להשתיל, להשתיל, להתרבות ולהתמיין בעצמות השלד לאחר החדרתם לזרם הדם הכללי.

זה נובע בין היתר מכך שבהשתלת מח עצם סטנדרטית הסטרומה אינה מושתלת יחד עם הרקמה ההמטופויאטית, ולכן עדיין לא פותחו קריטריונים מחמירים להערכת השתלה מוצלחת של תאי סטרומה הניתנים באופן סיסטמי. יש לזכור כי נוכחותם של גנים סמנים בתמציות רקמה או בידוד תאים ממקור תורם בתרבית אינם מעידים על השתלה של התאים, אלא רק על הישרדותם. אפילו הזרקה תוך-עורקית של תאי סטרומה מח עצם לגפה של עכבר יכולה להוביל כמעט לאפס השתלה, למרות העובדה שתאים ממקור תורם נמצאים במספרים גדולים בתוך מיקרו-כלי הדם של מח העצם. למרבה הצער, תאים כאלה מתוארים בדרך כלל כ"מושתלים" פשוט על סמך גילוי גנים סמנים לתאי תורם בתרבית ex vivo. בנוסף, יש לספק ראיות משכנעות לשילוב ארוך טווח של תאים ממוינים ופעילים מבחינה תפקודית ממקור תורם ברקמות הנחקרות. במאמרים רבים שפורסמו המדווחים על השתלת תאי סטרומה מח עצם בשלד, היעדר נתונים ברורים מסוג זה בולט. עם זאת, יש לציין כי מספר ניסויים נכונים בבעלי חיים אכן קבעו השתלה מוגבלת אך אמיתית של תאי אב סטרומליים לאחר מתןם המערכתי.

נתונים אלה עולים בקנה אחד עם תוצאות מחקרים על האפשרות להעביר תאי אב מיוגניים של מח עצם לשריר דרך מערכת כלי הדם. עם זאת, אין לשכוח כי גם רקמת שלד וגם רקמת שריר נוצרות במהלך ההתפתחות והגדילה על סמך תנועות תאים חוץ-וסקולריות המשתמשות בתהליכי נדידה שאינם כוללים זרימת דם. אם קיים מסלול מחזורי עצמאי להעברת תאי אב לרקמות פאזה מוצקה, האם ניתן להניח את קיומם של תאי אב מזנכימליים במחזור פיזיולוגי? מהו מקורם של תאים אלה באורגניזם המתפתח וגם באורגניזם שלאחר הלידה, וכיצד הם חודרים לדופן כלי הדם? פתרון שאלות אלה נראה הכרחי לחלוטין ודורש את הניתוח הפרה-קליני הקפדני ביותר. גם לאחר מציאת תשובות לשאלות אלה, היבטים קינטיים בעייתיים הקשורים בגדילת שלד ובניית רקמת חיבור מחדש יישארו בלתי פתורים. יחד עם זאת, הטיפול בהפרעות אוסטאוגנזה על ידי החלפת כל אוכלוסיית תאי האב השלדיים המוטנטיים באלמנטים סטרומה בריאים נראה כסיכוי קליני אמיתי. במקרה זה, אזורי שבר מקומיים או עיוותים עקב אוסטאוגנזה פתולוגית, כמו גם שינויים הרסניים ברקמת העצם, ניתנים לתיקון באמצעות תאי גזע סטרומליים שגודלו במבחנה. לכן, מומלץ למקד מחקר עתידי בבעיות של טרנספורמציה או תיקון גנטי של תאי אב אוסטאוגניים מוטנטיים אוטולוגיים מחוץ לגוף (ex vivo).

הנדסה גנטית של תאים, לטווח קצר או קבוע, הפכה לבסיס הביולוגיה התאית והמולקולרית, מקור לתגליות מדעיות רבות הנוגעות לתפקידם של חלבונים בודדים בחילוף החומרים התאי במבחנה ובחי. השימוש בטכנולוגיות מולקולריות לתיקון פתולוגיה תורשתית ומחלות אנושיות מבטיח מאוד לרפואה המעשית, שכן תכונותיהם של תאי גזע סטרומה ממוח העצם מאפשרות לפתח תוכניות השתלה ייחודיות לתיקון מחלות גנטיות של השלד. יחד עם זאת, ניתן להשיג בקלות תאי מבשר מזנכימליים מהנמען העתידי, הם ניתנים למניפולציה גנטית ומסוגלים להתרבות בכמויות גדולות בפרק זמן קצר. השימוש בתאי גזע מזנכימליים מאפשר להימנע מהמגבלות והסיכונים הכרוכים במסירת חומר מידע גנטי ישירות למטופל באמצעות מבנים וקטוריים תוך-וסקולריים. אסטרטגיה דומה ישימה לתאי גזע עובריים, אך תאי סטרומה אוטולוגיים ממוח עצם לאחר לידה הם חומר עדיף יותר, שכן הכנסתם שוללת סיבוכים אימונולוגיים אפשריים לאחר ההשתלה. כדי להשיג אפקט לטווח קצר, למשל, כדי להאיץ את התחדשות העצם, השיטה האופטימלית ביותר היא שינוי גנטי של תאי גזע מזנכימליים באמצעות אלקטרופורציה, איחוי כימי, ליפופקציה, פלסמידים ומבנים אדנוויראליים. בפרט, טרנספקציה ויראלית לתאי סטרומה של מח עצם BMP-2 הוכחה כיעילה בהאצת התחדשות העצם בפוליטראומה ניסיונית. יצירת מבנים וקטוריים אדנוויראליים עדיפה בשל היעדר רעילות. עם זאת, שינוי גנטי של תאי סטרומה של מח עצם במקרה זה מאופיין ביציבות נמוכה ביותר. בנוסף, תאי סטרומה של מח עצם תקינים שעברו טרנספורמציה דורשים שימוש בנשאים וקטוריים של מידע גנטי שהם מדבקים פי 10 מסוגי תאים אחרים, מה שמגדיל משמעותית את אחוז התמותה של תאים שעברו טרנספקציה.

טיפול במחלות רצסיביות הנגרמות על ידי פעילות ביולוגית נמוכה או אפסית של גנים מסוימים דורש שינוי ארוך טווח או קבוע של תאי גזע מזנכימליים, הדורש שימוש בוירוסים הקשורים לאדנו, רטרו-וירוסים, לנטי-וירוסים או כימרות אדנו-רטרו-ויראליות. אזורי ההובלה של וירוסים אלה מסוגלים להעביר טרנספקטים גדולים של DNA (עד 8 קילו-בייט). הספרות המדעית כבר דיווחה על הפעילות הביולוגית האקסוגנית של תאי סטרומה במח עצם שעברו טרנספקציה עם מבנים רטרו-ויראליים המקודדים לסינתזה של מולקולות רטרו-ויראליות - IL-3, CD2, פקטור VIII, כמו גם אנזימים המעורבים בסינתזה של L-DOPA. עם זאת, גם במחקרים אלה, המחברים מצביעים על מספר מגבלות שיש להתגבר עליהן לפני היישום המעשי של טכנולוגיה זו. הבעיה הראשונה היא לייעל את תהליך השינוי של MSC ex vivo. ידוע כי ריבוי ארוך טווח (3-4 שבועות) של תאי סטרומה במח עצם in vitro מפחית את הטרנספקציה שלהם. יחד עם זאת, כדי להשיג רמה גבוהה של שינוי גנטי של תאי MSC, יש צורך לבצע מספר מחזורי טרנספקציה. הבעיה השנייה קשורה למשך ביטוי הגנים הטיפולי, שאינו עולה עדיין על ארבעה חודשים. ירידה טבעית בביטוי גנים יעיל נובעת מאי-אקטיבציה של פרומוטרים ומוות של תאים שעברו שינוי. לאור הסיכויים הכלליים להעברת מידע גנטי באמצעות תאי גזע מזנכימליים, תוצאות המחקרים הראשוניים מצביעות על הצורך באופטימיזציה נוספת של שיטות טרנספקציה ex vivo, בחירת פרומוטר מתאים המווסת את הפעילות הביולוגית בכיוון הרצוי, ועלייה ביכולתם של תאי סטרומה של מח עצם שעברו שינוי לשמר את עצמם in vivo לאחר השתלה. יש לציין כי השימוש במבנים רטרו-ויראליים לשינוי תאי סטרומה של מח עצם בכיוון הרצוי אינו תמיד דורש השתלה חובה שלהם. תאי גזע מזנכימליים שעברו טרנספקציה יכולים לבצע פונקציה מתקנת על רקע שהייה יציבה וללא שילוב פיזי פעיל ותפקוד חובה ברקמת חיבור. במקרה זה, יש להתייחס אליהם כאל משאבה ביולוגית מיני המייצרת in vivo גורם, שחסר בו קובע את ביטוי הפתולוגיה הגנטית.

השימוש בתאי סטרומה ממוח עצם שעברו טרנספורמציה לטיפול בפתולוגיה גנטית דומיננטית, המאופיינת בביטוי של גן בעל פעילות ביולוגית פתולוגית או חריגה, הוא בעייתי הרבה יותר, שכן במקרה זה יש צורך לחסום את ההעברה או היישום של מידע גנטי מעוות. אחת השיטות של הנדסה גנטית היא רקומבינציה הומולוגית של תאי גזע עובריים על מנת ליצור בעלי חיים טרנסגניים. עם זאת, רמת הרקומבינציה ההומולוגית הנמוכה ביותר בשילוב עם בעיות הזיהוי, ההפרדה וההרחבה של רקומביננטים כאלה אינה צפויה לתרום לשימוש נרחב בשיטה זו בעתיד הקרוב, גם אם יפותחו שיטות טכנולוגיות חדשות. הגישה השנייה בטיפול גנטי בפתולוגיה דומיננטית מבוססת על תיקון אוטומטי של DNA פגום, שכן ניתן לתקן מוטציות גנטיות על ידי החדרת DNA אקסוגני עם הרצף הרצוי (אוליגונוקלאוטידים קצרים של DNA או אוליגונוקלאוטידים כימריים של RNA/DNA), אשר נקשר להומולוגים בגנום הפגוע. האפשרות השלישית כרוכה בחסימת העברת מידע פתולוגי, המושגת באמצעות שימוש באוליגונוקלאוטידים שתוכננו במיוחד הנקשרים לגן ספציפי ליצירת מבנה סלילי טרנרי המבטל את האפשרות של שעתוק.

למרות שתיקון של מחלה גנטית ברמת הגנום נותר השיטה הטיפולית האופטימלית והמועדפת ביותר, mRNA הוא גם וקטור מבטיח (ואולי אף נגיש יותר) לחסימת גן שלילי דומיננטי. מולקולות חלבון עם אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס או רצפים שלמים החוסמים את קישור ה-mRNA למנגנון הביוסינתזה התאי משמשות זה מכבר לעיכוב תרגום ו/או להגברת פירוק mRNA. בנוסף, RNA דו-גדילי גורם לפירוק mRNA מהיר, שמנגנון זה נותר לא ברור. עם זאת, לא סביר שעצם חיסולם של mRNAs שעוברים תעתיק מאלל מוטנטי עם מוטציות קצרות או בודדות יקדם את ביטוי ה-mRNA של האלל הרגיל. חלופה היא שימוש בריבו-סינתזות פטיש וראש-סיכה, בעלות היכולת להיקשר לאזורים ספציפיים ביותר של mRNA עם אינדוקציה שלאחר מכן של ביקוע ואי-אקטיבציה שלהם במהלך התרגום. האפשרות להשתמש בשיטה זו בטיפול באוסטאוגנזה פתולוגית נחקרת כעת. ללא קשר למה בדיוק המטרה - אלמנטים גנומיים או ציטופלזמיים, הצלחתן של טכנולוגיות ריפוי גנטי חדשות תיקבע על ידי יעילות הכללת ריאגנטים בתאי סטרומה של מח עצם מחוץ לגוף (ex vivo), הבחירה האופטימלית של וקטור ספציפי והיכולת היציבה של תאי גזע מזנכימליים לבטא את הגורמים הדרושים בתוך גוף (in vivo).

לפיכך, גילוי תאי גזע מזנכימליים עם תכונותיהם הבלתי צפויות יוצר תוכנית מושגית חדשה לפיתוח שורות תאים. עם זאת, נדרש מחקר בין-תחומי נוסף כדי להבין את התפקיד הביולוגי של תאי גזע סטרומליים, את טבעם, את יכולתם להתמיין או להתפרק, את חשיבותם הפיזיולוגית במהלך התפתחות עוברית, גדילה לאחר לידה, התבגרות והזדקנות, כמו גם במחלות אנושיות.