תפקידם של אנזימים וציטוקינים בפתוגנזה של דלקת מפרקים ניוונית

בשנים האחרונות, תשומת לב רבה של חוקרים התמקדה בזיהוי פרוטאזות האחראיות לפירוק של הסחוס המפרקי (ECM) באוסטאוארתרוזיס. על פי תפיסות מודרניות, מטאלופרוטאזות מטריקס (MMPs) ממלאות תפקיד חשוב בפתוגנזה של אוסטאוארתרוזיס. בחולים עם אוסטאוארתרוזיס, מתגלה רמה מוגברת של שלושה MMPs - קולגנאזות, סטרומליסינים וג'לטינאזות. קולגנאז אחראי לפירוק קולגן טבעי, סטרומליסין - קולגן מסוג IV, פרוטאוגליקנים ולמינין, ג'לטינאז - לפירוק ג'לטין, קולגנים מסוג IV, Vh XI, אלסטין. בנוסף, מניחים נוכחות של אנזים נוסף - אגרקנאז, בעל תכונות של MMPs ואחראי על פרוטאוליזה של אגרגטים של פרוטאוגליקנים סחוסיים.

שלושה סוגים של קולגנאזות זוהו בסחוס המפרקי האנושי, שרמותיהם גבוהות משמעותית בחולים עם דלקת מפרקים ניוונית: קולגנאז-1 (MMP-1), קולגנאז-2 (MMP-8) וקולגנאז-3 (MMP-13). קיומם המשותף של שלושה סוגים שונים של קולגנאזות בסחוס המפרקי מצביע על כך שלכל אחד מהם תפקיד ספציפי משלו. ואכן, קולגנאזות-1 ו-2 ממוקמות בעיקר באזור השטחי והביניים העליון של הסחוס המפרקי, בעוד שקולגנאז-3 נמצא באזור הביניים התחתון ובאזור העמוק. יתר על כן, תוצאות מחקר אימונוהיסטוכימי הראו שככל שדלקת מפרקים ניוונית מתקדמת, רמת הקולגנאז-3 מגיעה לרמה ואף יורדת, בעוד שרמת הקולגנאז-1 עולה בהדרגה. ישנן עדויות לכך שבדלקת מפרקים ניוונית, קולגנאז-1 מעורב בעיקר בתהליך הדלקתי בסחוס המפרקי, בעוד שקולגנאז-3 מעורב בבניית רקמות. קולגנאז-3, המתבטא בסחוס של חולים עם דלקת מפרקים ניוונית, מפרק קולגן מסוג II בצורה אינטנסיבית יותר מקולגנאז-1.

מבין נציגי הקבוצה השנייה של מטלופרוטאזות, שלושה זוהו גם בסטרומליסין אנושי: סטרומליסין-1 (MMP-3), סטרומליסין-2 (MMP-10) וסטרומליסין-3 (MMP-11). כיום ידוע שרק סטרומליסין-1 מעורב בתהליך הפתולוגי באוסטאוארתרוזיס. סטרומליסין-2 אינו מזוהה בקרום הסינוביאלי של חולים באוסטאוארתרוזיס, אך הוא נמצא בכמויות קטנות מאוד בפיברובלסטים הסינוביאליים של חולים בדלקת מפרקים שגרונית. סטרומליסין-3 נמצא גם בקרום הסינוביאלי של חולים בדלקת מפרקים שגרונית ליד פיברובלסטים, במיוחד באזורי פיברוזיס.

בקבוצת הג'לטינאזות ברקמת סחוס אנושית, זוהו רק שתיים: ג'לטינאז 92 kD (ג'לטינאז B, או MMP-9) וג'לטינאז 72 kD (ג'לטינאז A, או MMP-2); בחולים עם דלקת מפרקים ניוונית, נקבעת עלייה ברמת הג'לטינאז 92 kD.

לאחרונה זוהתה קבוצה נוספת של MMPs הממוקמים על פני קרום התא ונקראים MMPs מסוג ממברנה (MMP-MT). קבוצה זו כוללת ארבעה אנזימים - MMP-MT1 - MMP-MT-4. ביטוי MMP-MT נמצא בסחוס מפרקי אנושי. למרות של-MMP-MT-1 יש תכונות קולגנאז, שני האנזימים MMP-MT-1 ו-MMP-MT-2 מסוגלים להפעיל ג'לטינאז-72 kDa וקולגנאז-3. תפקידה של קבוצת MMPs זו בפתוגנזה של OA דורש הבהרה.

פרוטאינזות מופשרות בצורת זימוגן, המופעל על ידי פרוטאינזות אחרות או תרכובות כספית אורגניות. הפעילות הקטליטית של MMPs תלויה בנוכחות אבץ באזור הפעיל של האנזים.

הפעילות הביולוגית של MMPs נשלטת על ידי TIMPs ספציפיים. עד כה, זוהו שלושה סוגים של TIMPs הנמצאים ברקמות מפרקיות אנושיות: TIMP-1–TIMP-3. סוג רביעי של TIMP זוהה ושובט, אך הוא טרם זוהה ברקמות מפרקיות אנושיות. מולקולות אלו נקשרות באופן ספציפי לאתר הפעיל של MMPs, אם כי חלקן מסוגלות להיקשר לאתר הפעיל של פרוגלטינז 72 kD (TIMP-2, -3, -4) ושל פרוגלטינז 92 kD (TIMP-1 ו- -3). עדויות מצביעות על כך שב-OA, קיים חוסר איזון בין MMPs ל-TIMPs בסחוס המפרקי, וכתוצאה מכך מחסור יחסי במעכבים, ככל הנראה בין היתר עקב עלייה ברמת ה-MMPs הפעילים ברקמה. TIMP-1 ו- -2 נמצאים בסחוס המפרקי ומסונתזים על ידי כונדרוציטים. באוסטאוארתריטיס, רק TIMP מסוג I מזוהה בקרום הסינוביאלי ובנוזל הסינוביאלי. TIMP-3 נמצא באופן בלעדי בתאי תאי התא האלקטרוניים (ECM). TIMP-4 חולק כמעט 50% מרצף חומצות האמינו שלו עם TIMP-2 ו-38% עם TIMP-1. בתאי מטרה אחרים, TIMP-4 אחראי על ויסות ההפעלה של פרוגלטינאז 72 kD על פני התא, דבר המצביע על תפקיד חשוב כווסת ספציפי לרקמה של עיצוב מחדש של ECM.

מנגנון נוסף לשליטה בפעילות הביולוגית של MMPs הוא הפעלתם הפיזיולוגית. ההערכה היא שאנזימים ממשפחת הסרין והציסטאין פרוטאז, כגון AP/פלסמין וקטפסין B, בהתאמה, הם מפעילים פיזיולוגיים של MMPs. רמות מוגברות של אורוקינאז (uAP) ופלסמין נמצאו בסחוס המפרקי של חולים עם דלקת מפרקים ניוונית.

למרות העובדה שמספר סוגים של קטפסינים נמצאים ברקמות מפרקים, קטפסין-B נחשב לגורם הסביר ביותר המפעיל של MMPs בסחוס. מעכבים פיזיולוגיים של פרוטאזות סרין וציסטאין נמצאו ברקמות מפרקים אנושיות. פעילותו של מעכב AP-1 (IAI-1), כמו גם פרוטאזות ציסטאין, מופחתת בחולים עם אוסטאוארתריטיס. בדומה ל-MMP/TIMP, חוסר האיזון בין פרוטאזות סרין וציסטאין והמעכבים שלהן הוא שיכול להסביר את הפעילות המוגברת של MMPs בסחוס המפרקי של חולים עם אוסטאוארתריטיס. בנוסף, MMPs מסוגלים להפעיל זה את זה. לדוגמה, סטרומיליסין-1 מפעיל קולגןאז-1, קולגןאז-3 וג'לטינאז 92 kD; קולגןאז-3 מפעיל ג'לטינאז 92 kD; MMP-MT מפעיל קולגןאז-3 וג'לטינאז 72 kDa מגביר הפעלה זו; MMP-MT מפעיל גם ג'לטינאז 72 kDa. ניתן לחלק ציטוקינים לשלוש קבוצות - הרסניים (דלקתיים), רגולטוריים (כולל נוגדי דלקת) ואנבוליים (גורמי גדילה).

סוגי ציטוקינים (על פי Van den Berg WB וחב')

הַרסָנִי	אינטרלוקין-1 TNF-α גורם מעכב לוקמיה אינטרלוקין-17
רגולטורית	אינטרלוקין-4 אינטרלוקין-10 אינטרלוקין-13 מעכבי אנזימים
אנבוליים	גורמי גדילה דמויי מונסולין TGF-b חלבונים מורפוגנטיים של העצם חלבונים מורפוגנטיים שמקורם בסחוס

ציטוקינים הרסניים, ובפרט IL-1, גורמים לעלייה בשחרור פרוטאזות ומעכבים את הסינתזה של פרוטאוגליקנים וקולגנים על ידי כונדרוציטים. ציטוקינים רגולטוריים, ובפרט IL-4 ו-10, מעכבים את ייצור IL-1, מגבירים את ייצור האנטגוניסט לקולטן IL-1 (IL-1RA) ומפחיתים את רמת סינתאז NO בכונדרוציטים. לפיכך, IL-4 פועל כנגד IL-1 בשלושה כיוונים: 1) מפחית את הייצור, ומונע את השפעותיו, 2) מגביר את ייצור ה"נוזל" העיקרי IL-1RA ו-3) מפחית את ייצור ה"שליח" המשני העיקרי NO. בנוסף, IL-4 מפחית פירוק אנזימטי של רקמות. In vivo, ההשפעה הטיפולית האופטימלית מושגת בשילוב של IL-4 ו-IL-10. גורמים אנבוליים כמו TGF-β ו-IGF-1 אינם מפריעים למעשה לייצור או לפעולה של IL-1, אלא מפגינים פעילות הפוכה, למשל, מגרה את הסינתזה של פרוטאוגליקנים וקולגן, מדכאים את פעילות הפרוטאזות, ו-TGF-β גם מעכב את שחרור האנזימים ומגרה את המעכבים שלהם.

ציטוקינים פרו-דלקתיים אחראים על סינתזה וביטוי מוגברים של MMPs ברקמות המפרק. הם מסונתזים בקרום הסינוביאלי ולאחר מכן מתפזרים לסחוס המפרקי דרך הנוזל הסינוביאלי. ציטוקינים פרו-דלקתיים מפעילים כונדרוציטים, אשר בתורם גם מסוגלים לייצר ציטוקינים פרו-דלקתיים. במפרקים שנפגעו מאוסטאוארתריטיס, את תפקיד מפעיל הדלקת ממלאים בעיקר תאים של קרום הסינוביאלי. הסינוציטים מסוג מקרופאג' הם שמפרישים פרוטאזות ומתווכים דלקתיים. ביניהם, IL-f, TNF-α, IL-6, גורם מעכב לוקמיה (LIF) ו-IL-17 הם ה"מעורבים" ביותר בפתוגנזה של אוסטאוארתריטיס.

חומרים פעילים ביולוגית המעוררים פירוק של סחוס מפרקי באוסטאוארתריטיס

• אינטרלוקין-1
• אינטרלוקין-3
• אינטרלוקין-4
• TNF-α
• גורמים מגרים מושבות: מקרופאג (מונוציט) ומקרופאג גרנולוציט
• חומר P
• עמוד ₂
• מפעילי פלסמינוגן (סוגי רקמות ואורוקינאז) ופלסמין
• מטלופרוטאזות (קולגנאזות, אלסטאזות, סטרומליסינים)
• קתפסינים A ו-B
• טרילסין
• ליפופוליסכרידים חיידקיים
• פוספוליפאז Ag

נתוני ספרות מצביעים על כך ש-IL-1, ואולי גם TNF-α, הם המתווכים העיקריים להרס רקמות מפרקים באוסטאוארתריטיס. עם זאת, עדיין לא ידוע האם הם פועלים באופן עצמאי זה מזה או האם קיימת היררכיה תפקודית ביניהם. מודלים של בעלי חיים לאוסטאוארתריטיס הראו שחסימת IL-1 מונעת ביעילות הרס סחוס מפרקי, בעוד שחסימת TNF-α מובילה רק לירידה בדלקת ברקמות המפרק. ריכוזים מוגברים של שני הציטוקינים נמצאו בקרום הסינוביאלי, בנוזל הסינוביאלי ובסחוס של חולים. בכונדרוציטים, הם מסוגלים להגביר את הסינתזה לא רק של פרוטאזות (בעיקר MMP ו-AP), אלא גם של קולגנים מינוריים, כגון סוגים I ו-III, ולהפחית את הסינתזה של קולגנים מסוגים II ו-IX ופרוטאוגליקנים. ציטוקינים אלה גם מגרים מיני חמצן ריאקטיביים ומתווכים דלקתיים כגון PGE2 _. התוצאה של שינויים מקרומולקולריים כאלה בסחוס מפרקי באוסטאוארתריטיס היא חוסר יעילות של תהליכי תיקון, מה שמוביל לפירוק נוסף של הסחוס.

הציטוקינים הפרו-דלקתיים שהוזכרו לעיל מווסתים את תהליכי הדיכוי/הפעלה של MMP באוסטאוארתריטיס. לדוגמה, חוסר האיזון בין רמות TIMP-1 ו-MMP בסחוס באוסטאוארתריטיס עשוי להיות מתווך על ידי IL-1, שכן מחקר in vitro הראה כי עלייה בריכוזי IL-1 בטא מובילה לירידה בריכוזי TIMP-1 ולעלייה בסינתזת MMP על ידי כונדרוציטים. סינתזת AP מווסתת גם היא על ידי IL-1 בטא. גירוי in vitro של כונדרוציטים בסחוס המפרקי עם IL-1 גורם לעלייה תלוית מינון בסינתזת AP ולירידה חדה בסינתזת iAP-1. היכולת של IL-1 להפחית את סינתזת iAP-1 ולעודד סינתזת AP היא מנגנון רב עוצמה לייצור פלסמין ולהפעלת MMP. בנוסף, פלסמין אינו רק אנזים המפעיל אנזימים אחרים, הוא גם משתתף בתהליך פירוק הסחוס על ידי פרוטאוליזה ישירה.

IL-ip מסונתז כקודמן לא פעיל עם מסה של 31 kD (pre-IL-ip), ולאחר מכן, לאחר ביקוע של פפטיד האות, הוא מומר לציטוקין פעיל עם מסה של 17.5 kD. ברקמות מפרקים, כולל הממברנה הסינוביאלית, הנוזל הסינוביאלי והסחוס המפרקי, IL-ip נמצא בצורה פעילה, ומחקרים in vivo הדגימו את יכולתה של הממברנה הסינוביאלית באוסטאוארתרוזיס להפריש ציטוקין זה. חלק מהפרוטאזות של סרין מסוגלות להמיר pre-IL-ip לצורתו הביו-אקטיבית. אצל יונקים, תכונות כאלה נמצאו רק בפרוטאז אחד, השייך למשפחת האנזימים הספציפיים לציסטאין אספרטט ונקרא אנזים ממיר IL-1β (ICF, או caspase-1). אנזים זה מסוגל להמיר באופן ספציפי pre-IL-ip ל-IL-ip "בוגר" פעיל ביולוגית עם מסה של 17.5 kD. ICF הוא פרואנזים (p45) במשקל 45 kD הממוקם בקרום התא. לאחר פירוק פרוטאוליטי של הפרו-אנזים p45, נוצרות שתי תת-יחידות המכונות p10 ו-p20, המאופיינות בפעילות אנזימטית.

TNF-α מסונתז גם כקודמור הקשור לממברנה עם מסה של 26 kDa; באמצעות ביקור פרוטאוליטי הוא משתחרר מהתא כצורה מסיסה פעילה עם מסה של 17 kDa. ביקור פרוטאוליטי מתבצע על ידי אנזים הממיר TNF-α (TNF-AC), השייך למשפחת האדמליזין. AR Amin ואחרים (1997) מצאו ביטוי מוגבר של mRNA של TNF-AC בסחוס המפרקי של חולים עם דלקת מפרקים ניוונית.

הפעלה ביולוגית של כונדרוציטים וסינובוציטים על ידי IL-1 ו-TNF-a מתווכת על ידי קישור לקולטנים ספציפיים על פני התא - IL-R ו-TNF-R. זוהו שני סוגי קולטנים עבור כל ציטוקין - IL-IP מסוג I ו-II ו-TNF-R מסוג I (p55) ו-II (p75). IL-1PI ו-p55 אחראים על העברת אותות בתאי רקמת המפרק. ל-IL-1R מסוג I יש זיקה מעט גבוהה יותר ל-IL-1beta מאשר ל-IL-1a; לעומת זאת, ל-IL-1R מסוג II יש זיקה גבוהה יותר ל-IL-1a מאשר ל-IL-ip. עדיין לא ברור האם IL-IP מסוג II יכול לתווך אותות IL-1 או שהוא משמש רק לעיכוב תחרותי של הקשר של IL-1 עם IL-1R מסוג I. כונדרואיטידים ופיברובלסטים סינוביאליים של חולים עם אוסטאוארתריטיס מכילים כמויות גדולות של IL-1PI ו-p55, מה שמסביר בתורו את הרגישות הגבוהה של תאים אלה לגירוי על ידי הציטוקינים המתאימים. תהליך זה מוביל הן להפרשה מוגברת של אנזימים פרוטאוליטיים והן להרס הסחוס המפרקי.

לא ניתן לשלול את מעורבותו של IL-6 בתהליך הפתולוגי באוסטאוארתריטיס. הנחה זו מבוססת על התצפיות הבאות:

• IL-6 מגביר את מספר תאי הדלקת בקרום הסינוביאלי,
• IL-6 מגרה התפשטות כונדרוציטים,
• IL-6 מגביר את ההשפעות של IL-1 על הגברת סינתזת MMP ועיכוב סינתזת פרוטאוגליקן.

עם זאת, IL-6 מסוגל לגרום לייצור של TIMPs, אך אינו משפיע על ייצור MMPs, ולכן מאמינים כי ציטוקין זה מעורב בתהליך עיכוב הפירוק הפרוטאוליטי של הסחוס המפרקי, המבוצע על ידי מנגנון משוב.

חבר נוסף במשפחת IL-6 הוא LIF, ציטוקין המיוצר על ידי כונדרוציטים המתקבלים מחולים עם אוסטאוארתריטיס בתגובה לגירוי על ידי הציטוקינים הפרו-דלקתיים IL-1p ו-TNF-a. LIF מגרה ספיגת פרוטאוגליקן בסחוס, כמו גם סינתזת MMP וייצור NO. תפקידו של ציטוקין זה באוסטאוארתריטיס לא הובהר במלואו.

IL-17 הוא הומודימר בגודל 20-30 kD עם אפקט דמוי IL-1, אך הרבה פחות בולט. IL-17 מגרה את הסינתזה והשחרור של מספר ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל IL-1p, TNF-α, IL-6 ו-MMP בתאי מטרה, כגון מקרופאגים אנושיים. בנוסף, IL-17 מגרה ייצור NO על ידי כונדרוציטים. בדומה ל-LIF, תפקידו של IL-17 בפתוגנזה של OA נחקר בצורה מועטה.

הרדיקל החופשי האנאורגני NO ממלא תפקיד חשוב בפירוק הסחוס המפרקי באוסטאוארתריטיס. כונדרוציטים שבודדו מחולי דלקת מפרקים ניוונית מייצרים כמויות גבוהות יותר של NO, הן באופן ספונטני והן לאחר גירוי עם ציטוקינים מעודדי דלקת, בהשוואה לתאים נורמליים. תכולת NO גבוהה נמצאה בנוזל הסינוביאלי ובסרום של חולים עם דלקת מפרקים ניוונית - זוהי תוצאה של ביטוי וסינתזה מוגברים של סינתאז NO מושרה (hNOC), האנזים האחראי לייצור NO. לאחרונה, שובט ה-DNA של hNOC ספציפי לכונדרוציטים, ורצף חומצות האמינו של האנזים נקבע. רצף חומצות האמינו מצביע על זהות של 50% ו-70% דמיון עם hNOC ספציפי לאנדותל ולרקמת עצבים.

NO מעכב את הסינתזה של מקרומולקולות של ה-ECM של הסחוס המפרקי וממריץ את הסינתזה של MMP. יתר על כן, עלייה בייצור NO מלווה בירידה בסינתזה של האנטגוניסט IL-IP (IL-1RA) על ידי כונדרוציטים. לפיכך, עלייה ברמת IL-1 וירידה ב-IL-1RA מובילות להיפר-סטימולציה של NO בכונדרוציטים, מה שמוביל בתורו לפירוק מוגבר של מטריצת הסחוס. ישנם דיווחים על ההשפעה הטיפולית in vivo של מעכב hNOC סלקטיבי על התקדמות אוסטאוארתריטיס ניסיונית.

מעכבי ציטוקינים טבעיים מסוגלים למנוע ישירות מציטוקינים להיקשר לקולטני קרום התא, ובכך להפחית את פעילותם הפרו-דלקתית. ניתן לחלק מעכבי ציטוקינים טבעיים לשלוש קבוצות על סמך אופן הפעולה שלהם.

המחלקה הראשונה של מעכבים כוללת אנטגוניסטים של קולטנים המונעים את קישור הליגנד לקולטן שלו על ידי תחרות על אתר הקישור. עד כה, מעכב כזה נמצא רק עבור IL-1 - זהו המעכב התחרותי הנ"ל של מערכת IL-1/ILIP IL-1 PA. IL-1 PA חוסם השפעות רבות הנצפות ברקמות מפרקים באוסטאוארתריטיס, כולל סינתזה של פרוסטגלנדינים על ידי תאי סינוביה, ייצור קולגנאז על ידי כונדרוציטים ופירוק של BM של סחוס מפרקי.

IL-1RA נמצא בצורות שונות - אחת מסיסה (rIL-1RA) ושתיים בין-תאיות (μIL-lPAI ו-μIL-1RAP). הזיקה של הצורה המסיסה של IL-1RA גבוהה פי 5 מזו של הצורות הבין-תאיות. למרות מחקר מדעי אינטנסיבי, תפקידו של האחרון נותר לא ידוע. ניסויים במבחנה הראו כי עיכוב פעילות IL-1beta דורש ריכוז של IL-1RA פי 10-100 מהרגיל, בעוד שתנאי in vivo דורשים עלייה פי אלף בריכוז IL-1RA. עובדה זו עשויה להסביר חלקית את המחסור היחסי של IL-1RA ואת העודף של IL-1 בסינוביום של חולים עם אוסטאוארתריטיס.

הסוג השני של מעכבי ציטוקינים טבעיים הם קולטני ציטוקינים מסיסים. דוגמאות למעכבים כאלה בבני אדם הקשורים לפתוגנזה של דלקת מפרקים ניוונית הן rIL-1R ו-pp55. קולטני ציטוקינים מסיסים הם צורות מקוצרות של קולטנים רגילים; כאשר הם נקשרים לציטוקינים, הם מונעים את קשירתם לקולטנים הקשורים לממברנה של תאי מטרה, ופועלים באמצעות מנגנון של אנטגוניזם תחרותי.

הקולטן המקור העיקרי של קולטנים מסיסים הוא IL-1RP הקשור לממברנה. הזיקה של rIL-IP ל-IL-1 ול-IL-1RA שונה. לכן, ל-rIL-1RN יש זיקה גבוהה יותר ל-IL-1β מאשר ל-IL-1RA, ו-rIL-1PI מפגין זיקה גבוהה יותר ל-IL-1RA מאשר ל-IL-ip.

ישנם גם שני סוגים של קולטנים מסיסים עבור TNF - pp55 ו-pp75, בדומה לקולטני IL-1 מסיסים, הם נוצרים על ידי "נשירה". בגוף חי, שני הקולטנים נמצאים ברקמות של המפרקים הפגועים. תפקידם של קולטני TNF מסיסים בפתוגנזה של אוסטאוארתריטיס נתון במחלוקת. ההנחה היא שבריכוזים נמוכים הם מייצבים את המבנה התלת-ממדי של TNF ומגדילים את זמן מחצית החיים של הציטוקין הביו-אקטיבי, בעוד שריכוזים גבוהים של pp55 ו-pp75 יכולים להפחית את פעילות TNF על ידי אנטגוניזם תחרותי. סביר להניח ש-pp75 יכול לשמש כנשא TNF, מה שמקל על קישורו לקולטן הקשור לממברנה.

הסוג השלישי של מעכבי ציטוקינים טבעיים מיוצג על ידי קבוצה של ציטוקינים נוגדי דלקת, הכוללים TGF-beta, IL-4, IL-10 ו-IL-13. ציטוקינים נוגדי דלקת מפחיתים את ייצור הפרוטאזות הפרו-דלקתיות וחלק מהפרוטאזות, ומגרים את ייצור IL-1RA ו-TIMP.