^

בריאות

A
A
A

מודלים ניסיוניים של אוסטאוארתריטיס

 
, עורך רפואי
סקירה אחרונה: 11.04.2020
 
Fact-checked
х

כל תוכן iLive נבדק מבחינה רפואית או נבדק למעשה כדי להבטיח דיוק עובדתי רב ככל האפשר.

יש לנו קווים מנחים קפדניים המקור רק קישור לאתרים מדיה מכובד, מוסדות מחקר אקדמי, בכל עת אפשרי, עמיתים מבחינה רפואית מחקרים. שים לב שהמספרים בסוגריים ([1], [2] וכו ') הם קישורים הניתנים ללחיצה למחקרים אלה.

אם אתה סבור שתוכן כלשהו שלנו אינו מדויק, לא עדכני או מפוקפק אחרת, בחר אותו ולחץ על Ctrl + Enter.

סחוס הוא רקמה מאוד מיוחדים המכילים רק סוג אחד של תאים (chondrocytes), המאופיינת על ידי היעדר דם כלי הלימפה. תזונה של הסחוס מתבצעת בעיקר על ידי ספיגה מן הנוזל הסינוביאלי. מטבוליזם של chondro-cytes מוסדר על ידי מספר גורמים מסיסים המיוצרים מקומית על ידי chondrocytes ו הרקמות הסובבות. הפונקציה של chondrocytes גם תלוי בהרכב של המדיום תאיים (מתח חמצן, ריכוז יון, pH, וכו '), הרכב VCM, אינטראקציה תא מטריקס, אותות פיזיים. המשימה העיקרית של מודלים ניסיוניים היא יצירת תרבויות בסביבה תאיים מבלי לשנות את הפנוטיפ של תאים בוגרים. המשימה השנייה היא ליצור תרבויות כדי לחקור את התגובה מוקדם, מתעכב, קצר או ארוך טווח של chondrocytes כדי כימיים ו / או אותות פיזיים. מחקרים במבחנה גם לספק הזדמנות ללמוד את ההתנהגות של הכונדרוציטים אוסטיאוארתריטיס. המשימה השלישית היא פיתוח של מערכות מרפא משותף, המאפשרים ללמוד את האינטראקציות של רקמות שונות במפרק. המשימה הרביעית היא הכנת שתלים סחוס עבור ההשתלה שלאחר מכן. ולבסוף, המשימה החמישית היא לחקור גורמי גדילה, ציטוקינים או סוכני טיפול המסוגלים לעורר תיקון ו / או לעכב את ספיגת הסחוס.

במהלך העשור האחרון, נוצר דפוסים שונים של תרביות תאי סחוס במפרק, ביניהם - monolayers, תרבות מושעה, תרבות hondronov, explants, coculture, תרבות התאים אלמוות. כל תרבות יש יתרונות וחסרונות שלה וכל אחד מתאים ללמוד היבט אחד של מטבוליזם chondrocyte. לפיכך, explants סחוס הם מודל מצוין ללימוד מחזור של אלמנטים מטריקס, אשר דורש אמיתי קולטנים פני השטח התא מטריקס תא נורמלי אינטראקציות תא מטריקס. במקביל, המחקר של הפיקדונות במטריצה או מנגנונים להסדרת מטבוליזם chondrocyte מומלץ להתבצע על תרבות של תאים בודדים. תרבות monolayer צפיפות נמוכה יש צורך ללמוד את התהליך של התמיינות תאים. תרבויות מושעות במטריצה טבעית או סינתטית הן מודל לניתוח התגובה ההסתגלותית של הכונדרוציטים ללחץ מכני.

trusted-source[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]

תרבויות chondrocyte

בעת בחירת רקמות הסחוס עבור במבחנה מחקרים, כמה נקודות חשובות צריך להיחשב. מטריקס הרכב פעילות מטבולית של chondrocytes להשתנות המפרקים שונים, וגם האחרון תלוי בעומק של chondrocyte ברקמה. נתונים אלו התקבלו במספר ניסויים שבהם נבדקו תת-קבוצות בודדות של כונדרוציטים מאזורי הסחוס בעומקים שונים. נמצאו מספר הבדלים מורפולוגיים וביוכימיים בין כונדרוציטים מעובדים הממוקמים על פני השטח לבין שכבות עמוקות של הסחוס המפרקי. תאים פנימיים לסנתז מטריקס נדיר, מדולל fibroillar proteoglycan, בעוד תאים עמוקים לייצר מטריצה כי הוא עשיר fibrils ו proteoglycans. יתר על כן, תאים פני השטח לייצר יחסית קטן יותר לא צובר proteoglycans וחומצה היאלורונית ו aggrecan יחסית פחות keratan גופרתי יותר chondrocytes ממוקם עמוק יותר. תכונה חשובה נוספת להבחין של מטבוליזם של chondrocytes מבודדים מאזורי הסחוס בעומקים שונים היא התגובה לגירוי אקסוגני. לדברי מ 'איידלוט ושותפיו, השורונדציטים של השור מאזור פני השטח של הסחוס היו רגישים יותר ל- IL-1 מאשר לתאי האזור העמוק.

ההתנהגות של התאים גם תלוי במיקום הרקמה. Chondrocytes קצות סחוס אוזן, נלקחים מאותו החיה מגיבה בצורה שונה גורמי גדילה כגון גורם גדילה פיברובלסטים (FGF), ו-בטא TGF. FGF הגביר את שילוב של תימידין, proline ו leucine לתוך התרבות chondrocyte של הצלע, אבל לא את האוזן. TGF-P העלתה את ההתאגדות של thymidine לתוך צלע chondrocytes סחוס האוזן, אך לא השפיע על ההתאגדות thymidine לתוך chondrocytes ואוזן פרולין. תאים סחוס המתקבלים באזורים הנושאים את המטען הגדול ביותר נבדלים מאלה עם עומס נמוך על הסחוס. לדוגמה, chondrocytes בוגרת של הסחוס במפרק הברך מאזור המרכז של משטח עצם השוקה כבשים במפרק מכוסה ולא על ידי במיניסקוס, אשר נושאת את העומס הגדול in vivo, aggrecan מסונתז קטן, decorin אבל גדול תאים של השטחים הכלולים המניסקוס. החוקרים מדגישים גם את החשיבות של שימוש בסחוס מאזורי מפרקים זהים כאשר בוחנים את הפונקציה הסינתטית של המפרקים.

חילוף החומרים של chondrocytes והתגובה שלהם לגורמים רגולטוריים גם תלוי באופן משמעותי בעידן של התורם, התפתחות השלד שלה ואת מצב המפרקים שמהם התאים נלקחים. ב chondrocytes האדם, ירידה משמעותית עם הגיל של התגובה שגשוג הוא ציין. הירידה הגדולה ביותר נצפתה בקרב תורמים בגילאי 40-50 שנים ויותר מ -60 שנה. יתר על כן, חומרת התגובה השגשוגית לגורמי גדילה (כגון FGF ו- TGF-Beta) יורדת במהלך ההזדקנות. בנוסף לשינויים כמותיים בשגשוג של chondrocytes, יש גם שינויים איכותיים. תאי התורם הצעירים (בגילאי 10-20) מגיבים טוב יותר לגורם הגדילה של טסיות הדם (PDGF) מאשר ל- TGF-Beta, בעוד שההפך מתרחש בתאי התורם הבוגרים. כדי להסביר את השינויים תלויי גיל בתפקוד סינתטי של chondrocytes ואת התגובה שלהם את ההשפעה של גורמי גדילה, מספר מנגנונים משמשים. ביניהם, ירידה במספר הזיקה של הקולטנים הסלולר פני השטח, שינוי סינתזה ביו-אקטיביות של גורמי גדילה ציטוקינים, ושינוי אותות שלאחר ההודעה.

מצב פתולוגי של המפרקים גם משנה את המורפולוגיה ופעילות מטבולית של chondrocytes. אז, ג 'יי Kouri ושותפים שיתוף (1996) זיהו שלוש תת אוכלוסיות של chondrocytes בסחוס עם osteoarthritis. Chondrocytes מן השטח השטחית והאמצעית העליונה של אשכולות הטופס הסחוס לסנתז יותר proteoglycans ו קולגן. TGF-Beta ו אינסולין כמו גורם הצמיחה (IGF) מסוגלים לעורר את הסינתזה של proteoglycans ידי chondrocytes ו לנטרל חלקית את ההשפעות של IL-1 ו TNF-a. Explants סחוס היו נגועים עם אוסטיאוארתריטיס, ואת chondrocytes מבודד סחוס של חולים עם דלקת מפרקים ניוונית, הם יותר רגישים לגירוי של בטא TGF מ chondrocytes סחוס בריא. הבדלים אלה קשורים ככל הנראה עם שינויים פנוטיפי chondrocytes בשכבות העליונות של הסחוס המפרקי.

בידוד של chondrocytes בודדים מושגת על ידי טיפול רציף עם אנזימים proteolytic של ECM. לאחר שחרורם מן ECM, תאים מבודדים הם אידיאליים לחקר הסינתזה של רכיבי מטריקס דה נובו. כמה מחברים להשתמש רק collagenase clostridium, אחרים מראש דגירה הסחוס עם טריפסין, pronase, DNase ו / או hyaluronidase. מספר התאים המבודדים תלוי באנזימים המשמשים. לפיכך, בעת עיבוד אחד רקמות collagenase 1 גרם ניתן להשיג 1,4T0 6 chondrocytes, ואילו בעת שימוש pronase, hyaluronidase ו collagenase - 4,3-10 6. כאשר עיבוד עם collagenase, aggrecan, חלבונים, IL-6, IL-8 להישאר בתרבית תאים הרבה יותר מאשר במקרה של טיפול רציף עם אנזימים שונים. ישנם מספר הסברים להבדלים אלה בין שתי תרבויות התא:

  • קולטני התאים שנפגעו או מדוכאים על ידי פעולה של אנזימים, TGF-beta מעכב סינתזה DNA של proteoglycans של כונדרוציטים מבודד החדש (יום 1), ואילו ה- DNA וסינתזה proteoglycan של chondrocytes בתרבית בשכבה (7 ימים) מגורה על ידי-בטא TGF. עם זאת, כדי reexpress אלה מרכיבים קרום, תקופה נאותה נדרשת לפני תחילת הניסוי.
  • פרוטאזות אקסוגניות יכולות לשבור את האינטראקציה בין תאים לבין המטריצה, בתיווך אינטגרינים. משפחת אינטגרין מקדמת את ההתקשרות של chondrocytes למולקולות VKM (Shakibaei M. Et al., 1997), קרע זה יכול להשפיע על הביטוי של גנים מטריקסיים.
  • שאריות של רכיבים מטריקס יכול לווסת את הפונקציה הסינתטית של chondrocytes. אינטגרינים מסוגלים לזהות מוצרים השפלה של ECM, ובכך לשחק תפקיד חשוב בתיקון רקמות לאחר החשיפה לאנזימים proteolytic. ט לארסון והאח (1989) דיווח כי התוספת של proteoglycans השלם או מקוטע בתאים בתרבית מעודד הסינתזה של חלבוני proteoglycans. עם זאת, רמות גבוהות של חומצה היאלורונית גורמת לירידה משמעותית הכללת סינתזה proteoglycan סולפט ידי chondrocytes העובר עוף chondrocytes להבשיל לתאי החזיריות עכברוש כונדרוסרקומה. יתר על כן, חומצה היאלורונית - מעכב שחרור proteoglycan מהתאים אפילו בנוכחות IL-lb, TNF-a, FGF, המציין כי הראשון שמבטיח לצמצם את הפעילות הביולוגית של גורמי גדילה וציטוקינים. המנגנון המדויק העומד מאחורי פעולת החומצה היאלורונית אינו ברור; זה ידוע כי chondrocytes מכילים קולטן עבור חומצה היאלורונית, הקשורים חוטים אקטין של cytosol. הכריכה של חומצה היאלורונית לקולטן שלה מגרה את הזרחון של חלבונים. לפיכך, נתונים אלה מדגימים פונקציות ויסות חילוף חומרים של כונדרוציטים יליד או חלבונים מטריקס מולקולות מקוטעים על ידי הפעלת קולטנים קרום תא.
  • גירוי מהיר על ידי אנזימים של סינתזה של חלבונים מטריקס ידי chondrocytes יכול להיות תוצאה של שינוי בצורת chondrocytes ו / או רה-ארגון של השלד.
  • כמה ציטוקינים (למשל, IL-8) וגורמי גדילה (למשל, IGF-1, TGF-P) קבועים ב- ECM. הדוגמה הידועה ביותר היא הכריכה של TGF-Beta עם decore, מה שמוביל לירידה ביכולתו של הראשון לעודד צמיחה תאית בתאי השחלות באוגרים סיניים. הנתונים שהתוכן של עיטור הסחוס עולה עם הגיל, מצביעים על ירידה בזמינות הביולוגית של TGF-Beta בהזדקנות. גורמי גדילה וציטוקינים יכולים להשתחרר משאריות מטריקס במהלך התרבות ולאחר מכן לשנות את תפקוד chondrocyte.

trusted-source[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]

Monolayer התרבות של chondrocytes

הפנוטיפ הבדיל של chondrocytes מאופיין בעיקר על ידי סינתזה של קולגן סוג II רקמות ספציפיים proteoglycans, כמו גם רמה נמוכה של פעילות מיטוטי. ישנן עדויות כי טיפוח לטווח ארוך של תאים בשכבה, ואחרי כמה קטעים חוזרים ונשנים של תאים, chondrocytes לאבד הצורה הכדורית שלהם, הופך צורה מאורכת, פיברובלסטים דמויים. עם תפקוד סינטטי כזה מטפלזיה פיברובלסטים שונה גם תאים, התאפיינו בירידה פרוגרסיבית בסינתזה של collagens השנייה, IX וסוגי XI וסינתזה משופרת של לי קולגן, III ו- Utipov. קטן proteoglycans שאינם מצטברים מסונתזים על ידי aggrecan תפקודית. Synthetzatepsin B ו- L הוא נמוך מאוד בתאים מובחנים, אבל בתהליך של אובדן של הגדלת בידול. Collagenase-1 מתבטא chondrocytes מובחן, עם טיפוח ממושך, הביטוי שלה פוחתת, בעוד הייצור של מעכבי רקמה של metalloproteases (TIMP) עולה.

Chondrocytes הבדיל מחדש להביע את קולגן של פנוטיפ מובחן כאשר הם מועברים מתרבות monolayer כדי מושעה אחד. תהליך ההבחנה קשור כנראה לצורת התאים. מאפיין זה משמש באופן קבוע על ידי חוקרים הלומדים השתלות פגומות עם chondrocytes אוטולוגיים. מספר קטן של תאים המתקבלים מחומר ביופסיה ניתן להכפיל בתרבות monolayer ולאחר מכן להציב שוב מטריצה תלת מימדית לפני ההשתלה. Re-ביטוי של פנוטיפ ספציפי על ידי chondrocytes dediferentiated הועבר לתרבות agarose יכול להיות מגורה עם TGF-p, קומפלקס ossein-hydroxyapatite וחומצה אסקורבית.

בתגובה להשפעה של גורמי גדילה וציטוקינים, הכונדרוציטים משתנים במהלך תהליך ההבחנה. התגובה הסלולרית לציטוקינים ולגורמי גדילה שונים בין צ'ונדרוציטים לא מובחנים ומובחנים. IL-1 מגרה את התפשטות fibroblasts, בעוד הצמיחה של chondrocytes לא מובחן הוא מעוכב על ידי IL-1. סינתזה של דנ"א מגורה על ידי IGF-1 בכרונזיטים מוארכים, אך לא שטוחים. ב chondrocytes הבדיל, את ההשפעות הממריצות של IL-1β ו TNF-α על מוצרי procollagenase בולטים יותר מאשר אלה שאינם מובחנים.

טיפוח של כונדרוציטים

טיפוח chondrocytes ההשעיה במדיום נוזלי או טבעי או סינתטי תלת מימדי מטריצה מייצב את הפנוטיפ של chondrocyte. תאים שומרים על צורתם הכדורית, מסנתזים חלבונים ספציפיים לרקמות. תרבות chondrocyte משוקלל מומלץ בדרך כלל לחקר היווצרות של מטריצה תאיים חדשים. תרבויות chondrocyte ב פולימרים סינתטיים או טבעיים סופגים משמשים להשתיל תאים לתוך פגמים סחוס כדי לעורר את התחדשות רקמות הסחוס של המפרק. סביבה סינתטית או טבעית עבור תאים מושתלים חייבת לספק מספר דרישות:

  • שתלים צריך להיות מבנה נקבובי עבור הידבקות ותא הגידול,
  • לא הפולימר עצמו ולא המוצרים של השפלה שלה צריך לגרום דלקת או תגובות רעילות במהלך השתלת vivo,
  • נושאת ההשתלה צריכה להיות מסוגלת לקשור סחוס או עצם סובקונדרלית סמוכה,
  • מטריקס טבעי או סינתטי חייב להיות מסוגל לספוג, השפלה שלה חייב להיות מאוזן על ידי התחדשות רקמות,
  • כדי להקל על תיקון הסחוס, המבנה הכימי ואדריכלות המטריצה של המטריצה צריכים לסייע בשמירה על הפנוטיפ הסלולרי שהוכנס בתוך הכונדרוציטים וסינתזה של חלבונים ספציפיים לרקמות,
  • במהלך ההשתלה in vivo, יש צורך ללמוד את התכונות המכניות של המטריצה סינתטי או טבעי.

trusted-source[18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]

השעיה של chondrocytes בשלב נוזלי

מצורף תא כלי פלסטיק, שבה culturing של כונדרוציטים ניתן למנוע הקירות שלהם מצופים תאי מתיל פתרון, agarose, הידרוג'ל (פולי-2-hydroxyethylmethacrylate) או תערובת של agarose קולגן. בתנאים אלה, chondrocytes טופס אשכולות לסנתז בעיקר aggrecan ורקמות ספציפיות collagens (II, IX, XI סוגים). בדרך כלל, שני סוגים של תאים נמצאים. התאים הממוקמים במרכז לשמור על צורה כדורית מוקף ECM מפותחת, אשר אושר על ידי מחקרים היסטוכימיים ultrastructural. על chondrocytes הפריפריה יש קווי discoid, מוקפים ECM נדיר; מעט ידוע על המאפיינים הפונקציונליים של תאים כאלה.

טיפוח של chondrocytes על microcarriers נתמך ההשעיה אפשרי; חרוזי Dextran (cytodex), חרוזים dextran מצופים קולגן (cytodex III), שאינם microspheres של קולגן סוג אני (קולגן) משמשים microcarriers. בתנאים אלה התרבות, chondrocytes לצרף את פני השטח של microcarrier, לשמור על צורת כדורית שלהם, לייצר חומר דמוי מטריצה. יתר על כן, השימוש קולגן מקדם את התפשטות chondrocytes ואת reexpression של פנוטיפ רגיל. לכן, טיפוח chondrocytes על microspheres של קולגן ניתן להשתמש כדי לשחזר את הפנוטיפ התא לפני ההשתלה.

שיטה נוספת של גידול ההשעיה של chondrocytes במדיום נוזלי הוא הטיפוח שלהם בצורה של חרוזים צפופים המורכב של תאים (0.5-1 * 10 ב ) המתקבל על ידי צנטריפוגה. Chondrocytes כאלה מסוגלים לייצר מטריצה המכילה מספר גדול של proteoglycans, סוג קולגן II, אבל לא סוג אני קולגן, אשר אושר על ידי שיטות היסטולוגית, immunohistochemical וכמותי.

השעיה של chondrocytes ב ECM טבעי

Chondrocytes יכול להיות מתורבת ב ההשעיה במטריצה תלת מימדי (אגר רך, agarose, קוראים גנים ג'ל או ספוג, חומצה היאלורונית, דבק הפיברין, חרוזים אלגינט).

Condured agarose chondrocytes לשמור על הפנוטיפ הרגיל שלהם לסנתז סוג קולגן II ו ספציפי צבירה אגרגטים חדשים. כאשר מתורבת agarose, cell- מסונתז proteoglycans משתחררים לתוך המדיום במשך 50 ימים. לשם השוואה - בתרבות monolayer שלב התא הוא overfilled עם glycosaminoglycans כבר 5-6 ימים הראשונים של טיפוח; כאשר מעובדים במדיום לאחר סינתזה ושחרור של glycosaminoglycans הוא התעצם, ירידה תלוי הזמן glycosaminoglycans מתרחשת הראשון 8-10 ימים. עם זאת, ההתנהגות של chondrocytes במהלך הטיפוח שלהם agarose שונה מזה בתנאים in vivo. ב agarose, מספר גדול של אגרגטים אגרית מסונתז מכילים מולקולות קטנות וקטנות יותר מאשר in vivo. TGF-P מגרה את הסינתזה של proteoglycans ב explant, אך מפחית את הסינתזה של aggrecan ב agarose.

Alginate הוא polysaccharide ליניארי נגזר אצות חומות. בנוכחות קטיונים divalent, כגון Ca 2 + יונים, פולימר זה הופך לג'ל. כל הכונדרוציטים נתפס אלגינט, מוקף מטריצה של סוכרים טעונים שלילית, נקבוביות אשר דומים לאלו של סחוס hyaline. המטריצה אשר נוצרה chondrocytes ב חרוזי אלגינט, מורכב משני מגזרים - שכבה דקה של מטריקס הקשורים תא מתאים מטריצות pericellular והטריטוריאליות של סחוס במפרק ואת שווה interterritorial מטריקס מרחוק יותר ברקמת ילידים. ביום ה -30 של תרבות, כבשו נפח יחסי ומוחלט על ידי תאים, וכל אחד שתי המחלקות חרוז אלגינט הוא כמעט לגמרי זהים לאלו של הסחוס המקורית. במשך כמעט 30 ימים chondrocytes לשמור על הצורה הכדורית שלהם ולהפיק aggrecan, תכונות הידרודינמית דומות לאלו של מולקולות aggrecan במטריצה של מולקולת סחוס וקולגן במפרק השני, סוגי IX ו- XI. במקביל, כמו תרבויות אחרות, השעיות, חרוזים אלגינט על פני השטח של תאים שטוחים נוכחים שיוצרים כמות קטנה של סוג I קולגן מולקולות, שוחררה ישירות לתוך הסביבה ולא מאוגד VCR. ב אלגינט חרוזים, התפשטות מתונה של chondrocytes הוא ציין. לאחר 8 חודשים של טיפוח chondrocytes הבוגרת אלגינט ג'ל לא לאבד פעילות מטבולית וממשיכים לסנתז קולגן סוג רקמות ספציפיות שני aggrecan.

N. Tanaka ו coauthors (1984) חקרו את תכונות דיפוזיה של מולקולות טבעיות שונות של alginate ומצא כי מולקולות גדול מ 70 kD לא לפזר דרך alginate. לפיכך, עיבוד של תאים באלגינט מתאים ללמוד את הרגולציה של ביוסינתזה מטריקס וארגון של ECM. הזמינות של תאים מעובדים alginate מאפשר אחד לחקור את ההשפעה של גורמים רגולטוריים פפטיד סוכני תרופתי על רמות תעתיק, פוסט טראנסציוניאלי ו translational.

Chondrocytes מתורבתים גם מטריצה של סיבי קולגן I ו- II סוגים. S. Nehrer ושותפים למחברים (1997) השווה את התפקוד של chondrocytes הכלב ב מטבולי פולגן קולגן-proteoglycan פולימריים המכילים collagens מסוגים שונים. הם מצאו הבדלים חשובים במורפולוגיה של הפונקציה biosynthetic של chondrocytes מתורבת מטריצות קולגן המכיל סוגים קולגן I ו- II. תאים במטריצה של קולגן סוג II מפותל צורה כדורית שלהם, ואילו בקולגן סוג אני, היה להם מורפולוגיה fibroblast. יתר על כן, במטריצה של קולגן סוג II, chondrocytes מיוצר יותר glycosaminoglycans. ג 'ון van Susante et al (1995) השווה את המאפיינים של chondrocytes מתורבת ב alginate ואת קולגן (סוג אני) ג' ל. החוקרים מצאו עלייה משמעותית במספר תאי ג'ל קולגן, אבל היום ה -6 של טיפוח, התאים אבדו פנוטיפ האופייני שלהם, הפכו תאי פיברובלסטים דמויים. ב אלגינט ג'ל, ירידה במספר התאים נצפתה, אבל chondrocytes שמרו פנוטיפ הרגיל שלהם. כמות proteoglycans ג'ל קולגן לכל תא הייתה גבוהה משמעותיים מאשר אלגינט, אך הירידה נצפתה סינתזת האלמנטים מטריקס ג'ל החל מיום ה -6 של טיפוח, ואילו סינתזת אלגינט המשיכה לגדול.

מוצק פיברין תלת מימדי מטריקס הוא חומר טבעי התומך chondrocytes שקלו בו פנוטיפ מובחן. מטריצת פיברין 3D יכול לשמש גם כמוביל להשתלת chondrocyte. היתרונות של פיברין הם היעדר cytotoxicity, היכולת למלא את החלל, יכולת דבק. על ידי מחקרים היסטולוגית ו ביוכימיים Autoren-diografii, מיקרוסקופית אלקטרונים חשף כי chondrocytes בג'לים הפיברין לשמר מורפולוגיה שלהם, להכפיל ולהפיק מטריקס גם לאחר 2 שבועות של טיפוח. עם זאת, G. Homminga ושותפים (1993) דיווחו כי לאחר 3 ימים של גידול, ההתפוררות של הפיברין מתחילה, dedifferentiation של chondrocytes מתקדמת.

השעיה של chondrocytes ב ECM מלאכותי (סינתטי)

שתלים סחוס עבור ניתוח שחזור או אורתופדי ניתן להשיג על ידי הגדלת chondrocytes מבודדים במבחנה ב מטריקס biocompatible סינתטי.

Polondlycolic חומצה מתורבת chondrocytes להתרבות ולשמור על מורפולוגיה נורמלי פנוטיפ בתוך 8 שבועות. חומצה chondrocyte-polyglycolic מורכב מורכב תאים, glycosaminoglycans, collagens, ויש לו כמוסה קולגן חיצוני. עם זאת, בשתלים כאלה ישנם שני סוגים של מולקולות קולגן - I ו- II. שתלים מ dediferentiated על ידי סדרה של מעברים של chondrocytes יש מספר גדול יותר של glycosaminoglycans ו collagens מאשר שתלים מ chondrocytes בעיקר לא מובחנים.

L. פריד ומשתפי -פעולה (1 993b) השוו את ההתנהגות של התרבויות האנושיות והשונדרוציטיות של השומן בחומצה פוליגליקולית סיבית (HPHC) ובחומצה פולילקטית (PPLC). לאחר 6-8 שבועות של עיבוד של chondrocytes השור ב HSVG או PPLC, המחברים צפו התפשטות תאים סחוס מטריקס התחדשות. ב HSBC, chondrocytes היו כדורית, הממוקם lacunae מוקף מטריקס cartilaginous. לאחר 8 שבועות של תרבות במבחנה, הרקמה התחדשה הכילה עד 50% של חומר יבש (4% מסה של תאים, 15% של glycosaminoglycans, ו 31% של קולגן). בתאי PPLK היו בצורת ציר, כמות קטנה של glycosaminoglycans ו קולגן. ב- HSBC, גידול התאים היה פי 2 יותר אינטנסיבי מאשר ב- PTCA. בשנת in vivo התנאים, chondrocytes גדל ב HPVC ו PPLC עבור 1 עד 6 חודשים הפיק רקמה דומה היסטולוגית דומה הסחוס. השתלים הכילו glycosaminoglycans, הקלד I ו collagens סוג II.

Chondrocytes שור עובריים היו מתורבת פוליאתילן בצפיפות גבוהה הידרופובי הידרופילית הידרופילית. לאחר 7 ימים של הדגירה בשני מצעים, התאים שמרו על צורה כדורית, המכיל בעיקר קולגן סוג II. לאחר 21 ימי עיבוד, התברר כי המטריצה הידרופילית מכילה יותר קולגן מסוג II מאשר המטריצה ההידרופובית.

רקמת סחוס ניתן להשיג גם על ידי culturing ב monolayer על מסננים CM-Millicell. טרום ציפוי מסננים עם קולגן הוא הכרחי עבור הקובץ המצורף של chondroits. בדיקה היסטולוגית של התרבות מדגים את הצטברות של chondrocytes ב- ECM המכילים proteoglycans ו קולגן סוג II. קולגן סוג אני בתרבות כזו לא מזוהה. Chondrocytes ברקמת הסחוס וכתוצאה מכך יש צורה כדורית, אבל על פני השטח של הרקמה הם שטוחים למדי. עובי הרקמה החדש שנוצר גדל עם הזמן תלוי הצפיפות הראשונית של monolayer של תאים. בתנאים אופטימליים תרבות, עובי הרקמה הסחוס הגיע 110 מיקרומטר, ארגון התאים שלה קולגן אל פני השטח ואת השכבות העמוקות דומה לזה של הסחוס המפרקי. VKM מכיל כ 3 פעמים יותר קולגן proteoglycans. לאחר שבועיים של עיבוד, הצטברות המטריצה-סקה צוינה, דבר שאפשר לחלץ את הרקמה מהמסנן ולהשתמש בה להשתלה.

סימס ושות '(1996) חקרו את טיפוח chondrocytes ב פוליאתילן תחמוצת ג'ל מטריצה פולימר המוטבע המאפשר מספר רב של תאים להיות מועבר על ידי הזרקה. שישה שבועות לאחר ההזרקה לרקמה תת-עורית של עכברים אתיים, נוצרה סחוס חדש, אשר מורפולוגית התאפיינה בהפלה לבנה הדומה לסחוס הלילי. נתונים ממחקרים היסטולוגיים וביוכימיים הצביעו על נוכחותם של כונדרוציטים פעילים, המייצרים ECM.

הסבר

בחינה של רקמות סחוס משמשת כדי לחקור את התהליכים של ana ו- catabolism בו, הומאוסטזיס, ספיגה ותיקון. Chondrocytes ב explants רקמות סחוס לתמוך הפנוטיפ הרגיל הרכב של ECM, בדומה לאלה הסחוס המפרקי in vivo. לאחר 5 ימים של גידול בנוכחות של סרום, רמה קבועה של סינתזה והשפלה טבעית מושגת. ספיגה יכולה להאיץ בתרבית רקמה בתרבות העיקרית בתוספת הסרום באמצעות מספר הסוכנים, לדוגמה, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, נגזרות של חומצה רטינואית או רדיקלים חמצן פעילים. כדי לבדוק את תיקון הסחוס, הנזק שלו נגרם על ידי מתווכים מסיסים של דלקת (H 2 O 2, IL-1, TNF-a) או קרע פיזי של המטריצה.

השיטה של תרבויות organotypic הוא מודל לחקר ההשפעות חוץ גופית של גורמים חיצוניים מבודדים על chondrocytes ואת המטריצה שמסביב. ב vivo, chondrocytes נמצאים לעתים רחוקות ב- ECM ולא ליצור קשר אחד עם השני. התרבות של הסחוס המפרקי אקספלנט שומרת על ארגון מבניים זה, כמו גם את האינטראקציות המיוחדות בין chondrocytes לבין הסביבה החיצונית הסובבת שלהם. מודל זה משמש גם כדי לחקור את ההשפעה של לחץ מכני, סוכני תרופתי, גורמי גדילה, ציטוקינים, הורמונים על חילוף החומרים של הסחוס.

יתרון נוסף של explantation רקמת סחוס הוא היעדר נזק chondrocyte ידי אנזימים proteolytic או גורם מכני, אשר הוא בלתי נמנע כאשר תאים מבודדים. קולטנים וחלבונות ממברנה אחרים וגליקופרוטאינים מוגנים מפני גורמים מזיקים.

trusted-source[26], [27], [28], [29], [30]

תרבות של chondrons

Hondron - מבנית, פונקציונלית מטבוליות יחידת סחוס במפרק מורכב מטריצת הכונדרוציטים pericellular ו כמוסת הנימה הקומפקטית שלה הוא אחראי הומאוסטזיס של מטריקס. Chondrons מיוצרים באופן מכני מן הסחוס שנאספו על ידי כמה homogenizations במהירות נמוכה במהירות עוקבת. מבודד מהאזורים של בעומקים שונים סחוס hondrony ניתן לחלק לארבע קטגוריות: אחת hondron, תאום hondrony, מרובה (שלוש או יותר) hondrony מסודר באופן ליניארי (hondronov טור) גודש hondronov.

Chondrons בודדים נמצאים בדרך כלל בשכבות האמצעיות של הסחוס שלם, בזווג - על הגבול של השכבות האמצעיות והעמוקות, chondrons ממוקמים באופן לינארי אופייניים עבור שכבות עמוקות של סחוס שלם. לבסוף, אשכולות של chondrons מורכב מאורגן באופן אקראי קבוצות של chondrons יחיד ומשויך כי לשמור על המצב המצטבר לאחר homogenization. הצטברות של chondrons הם שברי סחוס גדולים, בדרך כלל המכילים כמה chondrons ו ממוקמים סיבי קולגן, כלומר, ארגון טיפוסי המאפיין של שכבות עמוקות של המטריצה. Chondrons משותקים בתוך agarose שקוף, המאפשר ללמוד את המבנה שלהם, הרכב מולקולרי פעילות מטבולית. מערכת chondron - agarose נחשב כמו micromodel הסחוס, אשר שונה מן chondrocyte - agarose המערכת המסורתית כי microenvironment טבעי נשמר, אין צורך לבצע סינתזה שלה הרכבה. התרבות של chondrons הוא מודל לחקר האינטראקציות של תאים מטריצה הסחוס במפרקים בתנאים נורמליים ופתולוגיים.

trusted-source[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]

תרבות של כונדרוציטים בני אלמוות

כדי ליצור שורות תאים קבע באמצעות דנ"א רקומביננטי או וירוסים onkogensoderzhaschie שיכול להפוך את התא "אלמוות". Chondrocytes אלמוות יש את היכולת התפשטות אינסופית, שמירה על פנוטיפ יציב. פ Mallein-Gerin ואח (1995) הראה כי אונקוגן הוא התפשטות המושרה SV40T של כונדרוציטים העכבר אשר ובכך להמשיך לבטא את collagens ביציבות השנייה, IX ו- XI סוגים, כמו גם חלבון מחייב משותף aggrecan. עם זאת, שורת תאים זו רוכש את היכולת לסנתז שאני סוג קולגן על ידי culturing זה בתרבות בשכבה או ג'ל agarose.

W. הורטון ושיתוף מחברים (1988) תיאר שורה של תאים אלמוות עם רמה נמוכה של קולגן סוג II ביטוי mRNA. תאים אלה התקבלו על ידי הפיכתם עם רטרווירוס עכבר המכיל I-myc ו- y-ra oncogenes. סוג זה של תאים הוא מודל ייחודי לחקר האינטראקציות של המטריצה המפרקית בהעדר קולגן מסוג II, כמו גם הסדרת הסינתזה של קולגן מסוג II.

תרבות chondropytes עם גנים מוטציה או נמחק הוא מודל נוח ללמוד את הפונקציה הפיזיולוגית שלהם. דגם זה מתאים במיוחד עבור לומד את התפקיד של מולקולות ספציפיות בארגונים מטריקס הסחוס או לומד את ההשפעות של גורמים רגולטוריים שונים על המטבוליזם סחוס. Chondrocytes סיבי קולגן התשיעי סוג גן מרחוק קולגן מסונתז רחב יותר מרגיל, המציין כי IX קולגן מהסוג מסדיר את הקוטר של סיבים. כפי שציינתי בפרק 1, שהמוטציה מצא חדש קידוד COLAI סוג II קולגן במשפחות עם אוסטיאוארתריטיס כללית עיקרית. כדי לחקור את ההשפעה של קולגן סוג מוטציה השנייה במטריצה במפרק ר Dharmrvaram ואח (1997) ביצע transfection ( "זיהום" חומצת גרעין זרים) פגום COL 2 AI (ארגינין במיקום 519 מוחלפת ציסטאין) ב chondrocytes האדם העובר במבחנה.

מערכת תרבויות. במפרק, הסחוס אינטראקציה עם תאים מסוגים אחרים הכלולים קרום סינוביאלי, נוזל סינוביאלי, מיתרים, עצם תת subchondral. מטבוליזם של chondrocytes יכול להיות מושפע מגורמים מסיסים שונים מסונתז על ידי תאים אלה. לכן, דלקת מפרקים מפרקים נהרסת על ידי אנזימים proteolytic ורדיקלים חופשיים, אשר מיוצרים על ידי תאים סינוביאליים. לכן, מודלים פותחו כדי לחקור אינטראקציות מורכבות בין הסחוס לרקמות שמסביב, אשר נקראים coculture.

ס לאקומב-Gleise ואח (1995) היו chondrocytes ארנב תרבותי אוסטאובלסטים במערכת coculture (שחקן המשנה), שבו התאים הופרדו קרום microporous (0.4 מיקרון) מאפשר החליפין בין שני סוגי התאים ללא כל מגע ישיר. מחקר זה הוכיח את היכולת של אוסטאובלסטים כדי להמריץ את צמיחת הכונדרוציטים ידי מתווכים מסיסים.

M. מאלפייט ושותפיו (1994) חקרו את הקשר בין מונוציטים של דם פריפריאלי לבין כונדרוציטים. מודל זה נוח ללמוד את התהליכים מתווכת על ידי ציטוקינים, ארתרופטיס דלקתית (דלקת מפרקים שגרונית, spondylitis seronegative, וכו '). מחברי המודל הפרידו את התאים על ידי קרום חלבון מחייב עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר בקוטר. המחקר מצא כי מונוציטים-מגורה lipopolysaccharide הסתדר iFNO IL-1-A, אשר מעכב את הסינתזה של כונדרוציטים aggrecan ותרם לזילות של אגרגטים aggrecan כבר מסונתז.

ק בטדה ואחות (1994) יצר מודל coculture שבו תאי האנדותל קולגן (I-type) ג'ל הוכנסו לחדר הפנימי מן החדר החיצוני ומופרד ממנה chondrocytes להציב מסנן עם גודל נקבובי של 0.4 מיקרון. במצב של בידוד מוחלט מן החדר החיצוני, תאים אנדותל אנושיים יצרו צינורות בג'ל קולגן בנוכחות EGF או TGF-a. עם גידול סימולטני של שני סוגים של תאים TGF, היווצרות תלוי של צינורות על ידי תאים אנדותל היה מעוכב. העיכוב הכבד של תהליך זה בוטל בחלקו על ידי נוגדנים נגד TGF-Beta. ניתן להניח כי TGF ביתא המיוצר על ידי chondrocytes מדכא את כלי הדם של הסחוס עצמו.

ס 'גרוט ושותפי משנה (1994) טיפחו את הכונדרוציטים בו זמנית מאזורי היפרטרופיה ושגשוג של עצם של עכבר בן 16 יום עם חלקי רקמת מוח. לאחר 4 ימים של תרבות, transdifferentiation של chondrocytes לתוך osteoblasts ואת הופעתה של היווצרות osteoid נצפו. לאחר 11 ימי עיבוד, חלק מהסחוס הוחלף ברקמת עצם, ומטריצת העצם סווגה חלקית. כמה נוירופפטידים ונוירוטרנסמיטרים המיוצרים על ידי רקמת המוח, משפיעים על חילוף החומרים של אוסטאובלסטים או קולטנים עליהם. ביניהם, norepinephrine, vasidactive מעיים פפטיד, פפטיד הקשורים עם הגן calcitonin, חומר P ו somatostatin יכול להיות מבודד . מתורבת עם chondrocytes, חתיכות של רקמת המוח יכול לייצר כמה גורמים אלה, אשר יכול לעורר את תהליך transdifferentiation chondrocyte לתוך osteoblasts.

trusted-source[42], [43], [44], [45], [46], [47], [48], [49]

השפעת גורמים חיצוניים על התרבות של chondrocytes

ההשפעה של מתח חמצן על מטבוליזם של chondrocytes

ברוב המקרים, תרבויות chondrocyte לפתח בתנאים של מתח חמצן אטמוספרי. עם זאת, ידוע היטב כי chondrocytes vivo קיימים תחת תנאים היפוקסיים ואת המתח חמצן משתנה עם תנאים פתולוגיים שונים. במהלך תהליך ההבשלה, שינויים משמעותיים באספקת הדם של epiphyses הם נצפו. מאז וסקולריזציה משתנה באזורים שונים של צלחת הצמיחה, מתח החמצן בהם משתנה גם. ג 'ברייטון ור' Heppenstall (1971) הוכיחו כי בצלחת של שוקה בארנבונים, מתח החמצן באזור היפרטרופי הוא פחות מאשר הסחוס שמסביב. מדידות של כמה פרמטרים מטבוליים הראו כי chondrocytes מסוגלים להגיב במהירות לשינויים מקומיים בריכוז החמצן. קודם כל, עם מתח חמצן נמוך, הצריכה של chondrocytes שלה פוחתת. עם ירידה במתח החמצן מ -21 ל -0.04%, השימוש בגלוקוז גדל, פעילות האנזים הגליקוליזה וסינתזת חומצה לקטית גדלות. גם עם מתח חמצן נמוך, את כמות מוחלטת של ATP, ADP, ו AMP נשאר יציב. נתונים אלה מצביעים על כיווניות של מטבוליזם כונדרוציטי כדי למקסם את שימור האנרגיה. עם זאת, הפעילות הסינתטית, ומכאן תהליכי הפיצול, משתנים בתנאים של היפוקסיה.

מתח חמצן גבוה משפיע גם על חילוף החומרים של chondrocytes, גרימת ירידה של סינתזה של proteoglycans ו- DNA, השפלה של המטריצה של הסחוס. תופעות אלו, ככלל, מלווה בייצור של רדיקלים חופשיים חופשיים.

השפעת ריכוז יון ולחץ אוסמוטי של הסביבה על הפונקציה של chondrocytes

בשנת ריכוז יון סחוס הילידים שונה באופן משמעותי מזו של רקמות אחרות: את תכולת הנתרן בטווח הבינוני-התאי היא 250 - 350 mmoles, ו osmolarity שלה - 350-450 mOsm. כאשר chondrocytes לבודד ממכשיר וידיאו דוגרים אותם התקשורת סטנדרטי (DMEM (בינוני Essential מינימלי של Dulbecco - בינוני Essential Minimum של Dulbecco) osmolarity - 250-280,7 mOsm) שינויים שמסביב בחדות הסביבה של התא. יתר על כן, ריכוז סידן ואשלגן בתקשורת תקן נמוך משמעותי מאשר ברקמת ילידים, ריכוז אניון - הוא גבוה בהרבה.

תוספת של סוכרוז למדיום מוביל לעלייה Osmolarity שלה גורם לעלייה תאיים חולף בריכוז של H + וסידן אניונים ב cytosol. שינויים תאיים כאלה יכולים להשפיע על תהליכים של בידול chondrocyte ועל הפעילות המטבולית שלהם. ג 'יי עירוני ואח' (1993) מצא כי שילוב של 35 8 סולפט ו -3 H- proline עם chondrocytes מבודדים מודגרת במדיום DMEM תקן עבור 2-4 שעות היה רק 10% מזה של רקמת הילידים. עוצמת הסינתזה הגיעה מקסימלית עם osmolarity של המדיום תאיים של 350-400 מוסמול הן chondrocytes מבודדים החדש ב explants של רקמה סחוס. יתר על כן, נפח chondrocyte גדל ב 30-40% לאחר הצבת תאים בודדים במדיום DMEM תקן של osmolarity אמר. עם זאת, בטיפול של chondrocytes תחת osmolarity nonphysiological עבור 12-16 שעות, התאים להסתגל לתנאים חדשים, הפחתת עוצמת הביוסינתזה ביחס פרוזדור של המדיום תאיים.

פ Borgetti ואח (1995) חקרו את ההשפעה של osmolarity של המדיום תאיים על הצמיחה, מורפולוגיה, ו ביוסינתזה של כונדרוציטים חזירי. המחברים הפגינו מאפיינים ביוכימיים מורפולוגיים דומים של chondrocytes בתרבית התקשורת עם osmolarity mOsm 0.28 ו 0.38. כאשר 0.48 osmolarity mOsm של המדיום במהלך תרבות 4-6 השעות של הראשון נצפה ירידת התפשטות תאי סינתזת חלבון, אך לאחר מכן התרחש לשחזר פרמטרים אלה שבסופו של דבר הגיעו הערכים השליטים. כאשר culturing chondrocytes במדיום עם 0.58 תאי osmolarity mOsm מאבד את יכל לתמוך בעצמה פיזיולוגית תהליכי שגשוג ואחרי 6 ימים מספר chondrocytes מצטמצם משמעותית. עם osmolarity של המדיום, 0.58 מוסמול, עיכוב עמוק של סינתזה חלבון הוא ציין. בנוסף, כאשר בתרבית תקשורת עם osmolarity mOsm 0,28-0,38 chondrocytes לשמור פנוטיפ פיסיולוגי בכל osmolarity גבוה (mOsm 0,48-0,58) שינויים משמעותיים מורפולוגיה תא, כמו פנוטיפ אופייני אובדן שמגשים chondrocytes מרה לתוך תאים דמויי fibroblast, כמו גם אובדן תאים, היכולת להרכיב proteoglycans מטריקס. תוצאות המחקר מצביעות על היענות הכונדרוציטים לתנודות osmolality המוגבל של הסביבה התאית.

השינוי בריכוז של יונים אחרים יכול גם להשפיע על תהליכים של biosynthesis ב chondrocytes. לפיכך, מידת ההכללה של 35 S (סולפט) מגדילה בחצי עם עלייה בריכוז של יונים אשלגן מ 5 מ"מול (ריכוז בינוני DM DM רגיל) עד 10 מ"מ (ריכוז ב VKM in vivo). ריכוז סידן מתחת 0.5 mmol תרמו לייצור קולגן על ידי chondrocytes שור בוגרת, בעוד ריכוז של 1-2 mmol (המקביל לריכוז בינוני DM DM רגיל) גרם לירידה משמעותית סינתזה קולגן. עלייה מתונה בביוסינתזה נצפתה ברמות גבוהות של סידן (2-10 מ"מול). קטיונים שונים להשתתף המצורפת של chondrocytes כדי חלבונים VKM. לפיכך, מגנזיום יונים מנגן לספק ההתקשרות פיברונקטין וקולגן סוג II, ואילו יוני סידן לא להשתתף המצורף של chondrocytes לחלבונים. לפיכך, התוצאות של מחקרים שתוארו מצביעים על ההשפעה של שינויים יונים תאיים של אשלגן, נתרן, סידן ו osmolarity של המדיום על פונקציה biosynthetic של chondrocytes מודגרות בתקשורת סטנדרטית.

השפעת הלחץ המכני על מטבוליזם של chondrocytes

אימוביליזציה של המפרק גורמת לאטרופיה הפיכה של הסחוס, דבר המצביע על הצורך בגירויים מכאניים לקורס הנורמלי של תהליכים מטבוליים ב- ECM. ברוב המקרים, מודלים תרבות התא בשימוש קיימים בתנאים לחץ אטמוספרי נורמלי. מ 'רייט ושותפי משנה (1996) הראו כי הסביבה המכנית משפיעה על חילוף החומרים של chondrocytes, התגובה של תאים תלוי בעוצמה ובתדירות של עומס הדחיסה. ניסויים עם טעינה על explants של סחוס המפרק שלם במבחנה הפגינו ירידה בסינתזה של חלבונים proteoglycans תחת פעולה של עומס סטטי, בעוד הטעינה דינמי מגרה את התהליכים האלה. המנגנונים המדויקים למימוש ההשפעה של לחץ מכני על הסחוס הם מורכבים והם קשורים כנראה לעיוות תאים, לחץ הידרוסטטי, לחץ אוסמוטי, פוטנציאל חשמלי ורצפטורים סלולריים פנימיים למולקולות מטריקס. כדי ללמוד את ההשפעה של כל אחד מהפרמטרים הללו, יש צורך ליצור מערכת שבה פרמטר אחד יכול להיות מגוון באופן עצמאי. לדוגמה, תרבות explant אינו מתאים ללמוד עיוות התא, אבל זה יכול לשמש כדי ללמוד את ההשפעה הכוללת של הלחץ על הפעילות המטבולית של chondrocytes. דחיסה של הסחוס גורמת לתא עיוות, וכן מלווה גם את המופע של שיפוע הלחץ ההידרוסטטי, פוטנציאל חשמלי, ו physicochemical שינוי זרימת נוזל גורמים כגון תכולת המים המטריצה, צפיפות מטען חשמלי, רמת הלחץ האוסמוטי. תאים דפורמציה ניתן ללמוד באמצעות chondrocytes מבודדים שקוע agarose או קולגן ג'ל.

מספר מערכות פותחו כדי לחקור את ההשפעה של גירוי מכני על התרבות של chondrocytes. כמה חוקרים משתמשים במערכות למטרה זו, שבה הלחץ מוחל על תרבות התא באמצעות השלב הגזי. לדוגמא, ואח Veldhuijzen JP (1979) באמצעות לחץ מעל האטמוספרה של 13 kPa בתדר נמוך (0.3 הרץ) במהלך 15 דקות, נצפה עליית סינתזת מחנה proteoglycans והוריד סינתזת DNA. ר 'סמית ואח' (1996) הראו כי חשיפה לסירוגין של תרבויות העיקרי של הלחץ ההידרוסטטי שור chondrocytes (10 מגפ"ס) בשעה 1 הרץ עבור 4 שעות גרמה לעלייה של סינתזה מסוג aggrecan וקולגן השנייה, ואילו הלחץ המתמיד לא היתה כל השפעה על תהליכים אלה. באמצעות מערכת דומה אל M. רייט et (1996) דיווח כי הלחץ המחזורי על תרבית התאים קשור hyperpolarization של קרום התא של כונדרוציטים והפעלה של Ca 2+ ערוצי אשלגן תלויים. לפיכך, ההשפעות של לחץ מחזורי מתווכות על ידי תעלות יונים, מופעל על ידי מתיחה, בממברנה chondrocyte. התגובה של chondrocytes ללחץ הידרוסטטי תלוי בתנאים של תרבות התא ואת התדירות של העומס המופעל. לפיכך, לחץ ההידרוסטטי מחזורי (5 MPA) מפחית את ההתאגדות של סולפט לתוך בשכבה הכונדרוציטים בתדר של 0.05, 0.25 ו 0.5 הרץ, ואילו עבור תדרים מעל סולפט הכללה 0.5 הרץ בעליות explant סחוס.

מ 'בושמן ואחרים (1992) דיווחו כי chondrocytes בג'ל agarose לשנות biosynthesis בתגובה ללחץ מכני סטטי ודינמי באותו אופן כמו איבר שלם בתרבית. החוקרים מצאו כי עומס מכני מייצר גירוי hyperosmotic ואחריו ירידה ב- pH ב chondrocytes.

ההשפעה של מתיחה מכנית ניתן ללמוד על תרבות של תאים שקועים בג'ל. כוח מתיחה ניתן ליצור באמצעות ואקום הנשלט על ידי המחשב. כאשר המערכת נמצאת בחלל ריק במידה מסוימת, החלק התחתון של צלחת פטרי עם תרבות התא הוא המורחבת על ידי כמות מסוימת, העיוות הוא מקסימלי בשולי התחתונה של הגביע הוא מינימלי במרכז. מתיחה מועבר תרבותי בצלחת פטרי של chondrocytes. בעזרת שיטה זו, Holm- וול ושותפים מחברים (1995) הראו כי הביטוי של mRNA של 2 α-Ingegrin הוא גדל בתרבית קולגן (סוג II) ג 'ל chondrosarcoma תאים . 2 p r integrin מסוגל מחייב קולגן סוג II. זה נחשב כמכניסטור, שכן הוא אינטראקציה עם מחייב אקטין חלבונים, ובכך לחבר את ECM ואת השלד.

השפעת ה- pH על מטבוליזם Chondrocyte

ה- pH של נוזל interstitial של ECM של רקמת הסחוס הוא חומצי יותר מאשר ברקמות אחרות. A. Maroudas (1980) קבע את ה- pH של הסחוס המפרקי ב -6.9. W. Diamant ושותפי משנה (1966) מצאו pH של 5.5 בתנאים פתולוגיים. זה ידוע כי chondrocytes לחיות ב PO2 נמוך, אשר מציין את התפקיד החשוב של הגליקוליזה (95% מכלל המטבוליזם גלוקוז) בחילוף החומרים של תאים אלה; הגליקוליזה מלווה בהפקת כמות גדולה של חומצה לקטית.

בנוסף לחומציות של הסביבה על ידי מוצרי הגליקוליזה, רכיבי המטריקס עצמם הם בעלי חשיבות רבה. מספר רב של מטען שלילי קבוע על proteoglycans תאי משנה את ההרכב היוני: קיים ריכוז גבוה של קטיונים בחינם (לדוגמה H +, Na +, K + ) וריכוז נמוך של אניוני (לדוגמה, O2, NPHS). בנוסף, בהשפעת עומס מכני מוציאים מים מה- ECM, מה שמוביל לעלייה בריכוז המטענים השליליים הקבועים ומשיכה של קטיונים נוספים למטריצה. זה מלווה ירידה של ה- pH של המדיום תאיים, אשר משפיע על ה- pH תאיים, ובכך לשנות את חילוף החומרים של chondrocytes. ר 'וילקין וא' הול (1995) חקרו את ההשפעה של ה- pH של המדיום החוץ תאיים על הביוסינתזה של המטריצה על ידי chondrocytes השורדים מבודדים. הם נצפו שינוי כפול של סינתזת מטריקס עם ירידה ב- pH. ירידה קלה pH (7.4 35 S0 4 ו 3 H-פרולין לתוך chondrocytes, בעוד החמצה עמוקה יותר (pH <7.1) מעכב את הסינתזה של 75% לעומת שליטה. יצירת ה- pH נמוך (6.65) עם יונים אמוניום גרם לירידה סינתזה מטריקס ידי רק 20%. התוצאות שהתקבלו מצביעים על כך ששינוי ה- pH של המדיום הסינתטי של תא המטריצה אינו יכול להיות מוסבר רק על ידי שינויים ב- pH של המדיום התוך תאי. יתר על כן, chondrocytes להחזיק את היכולת לווסת pH תאיים על ידי Na +, H + מחליף, Ca + תלויי C1 _ -NSOZ -CONVEYORS ו- H + / ATPase.

trusted-source[50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]

ההשפעה של הרכב המדיום לעיבוד על חילוף החומרים של chondrocytes

המדיום עבור culturing chondrocytes חייב להתאים את התנאים הניסוייים. בשנים האחרונות, סרום עגל שימש כדי לייעל את תנאי התרבות. עם זאת, כאשר משתמשים בסרום, יש לשקול מספר נקודות חשובות:

  • צמיחה חיצונית של תאים מהפריפריה של רקמות בתרבויות איברים,
  • את השונות של הרכב סרה של סדרות שונות,
  • נוכחות של רכיבים לא ידועים בהם,
  • סיכון מוגבר של הפרעות, ממצאים במחקר ההשפעה של גורמים ביולוגיים שונים על הפעילות המטבולית של תאים.

דוגמה של האחרון הוא המחקר של ההשפעה של EGF על chondrocytes סחוס בחולדות. EGF מגורה שילוב של 3 H- תימידין ועלייה בתכולת ה- DNA בתרבות. השפעה זו הייתה בולטת יותר בריכוזים נמוכים בסרום (<1%), אך בריכוזים גבוהים (7.5%) ההשפעה נעלמה.

זה ידוע היטב כי רמות של סינתזה והשפלה ב DMEM מועשר בסרום עגל מוגברת באופן משמעותי בהשוואה לתנאי in vivo. ההבדלים בין in vivo ו ב מטבוליזם במבחנה יכולה להיגרם על ידי הבדלים בין הנוזל הסינוביאלי לבין הסביבה שבה התאים מתורבתים. ד Lee et al (1997) היו chondrocytes בתרבית שוורים צעירים agarose באמצעות מדיום מזין המכיל DMEM, מועשר 20% נסיוב עגל ומספר גדול של נוזל סינוביאלי נורמלי אלוגנאית. הנוכחות של נוזל סינוביאלי בגידול מושרה הבינוני בסך של proteoglycans, עד 80% של נוזל סינוביאלי. תוצאות אלו מצביעות על כך הנוזל הסינוביאלי בתרבות גורם קצב חילוף החומרים, דומה לזה in vivo, עם רמות גבוהות של סינתזה של glycosaminoglycans ורמות נמוכות של חלוקת התא.

ג Verbruggen ואח (1995) הראה כי סינתזה של 35 S-arrpeKaHa chondrocytes אדם בתרבית agarose ב DMEM ללא בסרום היה 20-30% של רמת סינתזה שנצפתה DMEM, בתוספת 10% עגל בסרום. המחברים לקבוע את המידה שבה IGF-1, IGF-2, TGF-P או aggrecan ייצור אינסולין מופחת במדיום ללא בסרום. החוקרים מסכמים וכותבים כי 100 סינתזת ng / ml האינסולין, IGF-1 או IGF-2 חלקים המופחתת של aggrecan כדי 39-53% של רמות מלאות. עם שילוב של גורמים אלו, לא זוהו תופעות סינרגיות או מצטברות. במקביל, 10 ng / ml של TGF-P בנוכחות 100 אינסולין ng / ml מגורה סינתזה של aggrecan כדי 90% או יותר את רמת ההתייחסות. לבסוף, טרנספרין בסרום, לבד או בשילוב עם אינסולין, לא השפיע על הסינתזה של aggrecan. כאשר סרום עגל הוחלף עם אלבומין בסרום שור, התוכן המצטבר של aggrecan הופחת באופן משמעותי. העשרה של המדיום לתרבית האינסולין, IGF או TGF-P שוחזר חלקית את היכולת של התאים לייצר אגרגטים aggrecan. במקרה זה, IGF-1 ואינסולין מסוגלים לשמור על הומאוסטזיס בתרביות תאים. לאחר 40 ימים של תרבות במדיום בתוספת 10-20 ננוגרם / מ"ל IGF-1, סינתזה proteoglycan נשמרה באותה רמה או אפילו גבוה יותר בהשוואה בינוני המכילה סרום 20% עגל. תהליכי קטבולי התנהלו באיטיות במדיום בתוספת IGF-1 מאשר המדיום השלים עם פתרון אלבומין 0.1%, אך מהר למדי במדיום בתוספת 20% בסרום. בתרבויות ארוכות חיים, 20 ng / ml IGF-1 שומרת על מצב יציב של תאים.

ד Lee et al (1993) השווה את השפעת הרכב בינוני תרבות (DMEM, DMEM + 20% נסיוב עגל, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) על סינתזה DNA בתרבות של סחוס explant, תרבות בשכבה וב להשעיה agarose . כאשר מתורבת agarose בנוכחות סרום, המחברים נצפו נטייה chondrocytes הקבוצה לאשכולות גדולים. תאים בתרבית ללא בסרום עם IGF1, שומרים על צורה עגולה ב agarose, נאספו בקבוצות קטנות, אבל לא בצורה אגרגטים גדול. במונולייר, הסינתזה של הדנ"א הייתה גבוהה משמעותית במדיה המכילה סרום מאשר במדיום המועשר ב- IGF-1; הסינתזה של הדנ"א הייתה גבוהה בהרבה מזו שבסביבה הלא מסודרת. כאשר culturing chondrocytes ב להשעיה agarose במדיום unconcentrated ו במדיום עם IGF-1, אין הבדל סינתזה DNA. במקביל את slurry culturing chondrocytes ב agarose במדיום בתוספת סרום, לווה התאגדות מוגברת radionucleotide 3 H-thymidine בהשוואה לסביבות אחרות.

ויטמין C הוא הכרחי להפעלת אנזימים המעורבים היווצרות של מבנה ספירלי יציב של סיבי קולגן. Chondrocytes, חסר ביחס חומצה אסקורבית, לסנתז מתחת hydroxylated מבשר שאינו הסליל של קולגן, אשר מופרשים לאט. המבוא של חומצה אסקורבית (50 מיקרוגרם / מ"ל) גורם הידרוקסילציה של סוגי קולגן II ו IX והפרשתם בכמויות רגילות. תוספת של ויטמין C לא השפיע על רמת סינתזה של proteoglycans. כתוצאה מכך, הפרשת קולגן מוסדר באופן עצמאי של הפרשת proteoglycans.

trusted-source[58], [59], [60], [61], [62], [63], [64], [65]

You are reporting a typo in the following text:
Simply click the "Send typo report" button to complete the report. You can also include a comment.