^

בריאות

A
A
A

מודלים ניסויים של דלקת מפרקים ניוונית

 
, עורך רפואי
סקירה אחרונה: 07.07.2025
 
Fact-checked
х

כל תוכן iLive נבדק מבחינה רפואית או נבדק למעשה כדי להבטיח דיוק עובדתי רב ככל האפשר.

יש לנו קווים מנחים קפדניים המקור רק קישור לאתרים מדיה מכובד, מוסדות מחקר אקדמי, בכל עת אפשרי, עמיתים מבחינה רפואית מחקרים. שים לב שהמספרים בסוגריים ([1], [2] וכו ') הם קישורים הניתנים ללחיצה למחקרים אלה.

אם אתה סבור שתוכן כלשהו שלנו אינו מדויק, לא עדכני או מפוקפק אחרת, בחר אותו ולחץ על Ctrl + Enter.

סחוס הוא רקמה מיוחדת ביותר המכילה רק סוג אחד של תאים (כונדרוציטים) ומאופיינת בהיעדר כלי דם וכלי לימפה. הסחוס ניזון בעיקר מספיגה מנוזל הסינוביאלי. חילוף החומרים של הכונדרוציטים מווסת על ידי מספר גורמים מסיסים המיוצרים באופן מקומי על ידי הכונדרוציטים והרקמות הסובבות אותם. תפקוד הכונדרוציטים תלוי גם בהרכב הסביבה החוץ-תאית (מתח חמצן, ריכוז יונים, pH וכו'), בהרכב ה-ECM, באינטראקציה בין תאים למטריצה, ובאותות פיזיקליים. המטרה העיקרית של מידול ניסיוני היא ליצור תרבויות בסביבה החוץ-תאית מבלי לשנות את הפנוטיפ של תאים בוגרים. המטרה השנייה היא ליצור תרבויות כדי לחקור את התגובה המוקדמת, המאוחרת, לטווח קצר או ממושך של כונדרוציטים לאותות כימיים ו/או פיזיקליים. מחקרים במבחנה מספקים גם הזדמנות לחקור את התנהגות הכונדרוציטים באוסטאוארתריטיס. המטרה השלישית היא לפתח מערכות תרבות משותפות המאפשרות לחקור את האינטראקציות של רקמות שונות במפרק. המשימה הרביעית היא הכנת שתלי סחוס להשתלה לאחר מכן. ולבסוף, המשימה החמישית היא חקר גורמי גדילה, ציטוקינים או חומרים טיפוליים המסוגלים לעורר תיקון ו/או לעכב ספיגת סחוס.

במהלך העשורים האחרונים נוצרו מודלים שונים של תרביות תאי סחוס מפרק, כולל תרביות חד-שכבתיות, תרביות מושעות, תרביות כונדרון, אקספלנטים, קו-תרבויות ותרביות תאים אלמותיות. לכל תרבית יתרונות וחסרונות משלה, וכל אחת מהן מתאימה לחקר היבט ספציפי אחד של חילוף החומרים של כונדרוציטים. לפיכך, אקספלנטים של סחוס הם מודל מצוין לחקר תחלופת אלמנטים של המטריצה, הדורשת קולטנים אמיתיים על פני התא ואינטראקציות תקינות בין תאים למטריצה ומטריצה-תא. במקביל, מומלץ לחקור משקעי מטריצה או מנגנונים המווסתים את חילוף החומרים של כונדרוציטים בתרבית של תאים מבודדים. תרבית חד-שכבתית בצפיפות נמוכה נחוצה לחקר תהליך התמיינות התאים. תרביות מושעות במטריצה טבעית או סינתטית הן מודל לניתוח התגובה האדפטיבית של כונדרוציטים ללחץ מכני.

trusted-source[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

תרבויות כונדרוציטים

יש לקחת בחשבון מספר נקודות חשובות בעת בחירת רקמת סחוס למחקרים במבחנה. הרכב המטריקס ופעילות המטבולית של כונדרוציטים משתנים בין מפרקים שונים, והאחרון תלוי גם בעומק מיקום הכונדרוציטים ברקמה. נתונים אלה התקבלו במספר ניסויים בהם נחקרו תת-אוכלוסיות מבודדות של כונדרוציטים מאזורי סחוס בעומקים שונים. נמצאו מספר הבדלים מורפולוגיים וביוכימיים בין כונדרוציטים בתרבית הממוקמים בשכבות השטחיות והעמוקות של הסחוס המפרקי. תאים שטחיים מסנתזים מטריצה פיברילרית דלילה ועשירה בפרוטאוגליקנים, בעוד שתאים עמוקים יותר מייצרים מטריצה עשירה בסיבים ובפרוטאוגליקנים. יתר על כן, תאים שטחיים מייצרים יחסית יותר פרוטאוגליקנים קטנים ולא מצטברים וחומצה היאלורונית ויחסית פחות אגרקן וקרטן סולפט מאשר כונדרוציטים עמוקים יותר. מאפיין חשוב נוסף של חילוף החומרים של כונדרוציטים המבודדים מאזורי סחוס בעומקים שונים הוא התגובה לגירוי אקסוגני. על פי M. Aydelotte ואחרים, כונדרוציטים של בקר מהאזור השטחי של הסחוס היו רגישים יותר ל-IL-1 מאשר תאים מהאזור העמוק.

התנהגות התאים תלויה גם במיקום הרקמה. כונדרוציטים מסחוס צלעות ואוזן מאותו בעל חיים מגיבים בצורה שונה לגורמי גדילה כמו גורם גדילה של פיברובלסטים (FGF) ו-TGF-beta. FGF הגביר את שילוב התימידין, הפרולין והלאוצין בצלעות בתרבית אך לא באוזן. TGF-beta הגביר את שילוב התימידין בכונדרוציטים של סחוס צלעות ואוזן אך לא השפיע על שילוב התימידין והפרולין בכונדרוציטים של האוזן. תאי סחוס מאזורים עם לחץ גבוה נבדלים מאלה מאזורים עם לחץ נמוך על הסחוס. לפיכך, כונדרוציטים של סחוס מפרק הברך של כבשים בוגרות מהאזור המרכזי של המשטח המפרקי של עצם השוקה שאינו מכוסה על ידי המניסקוס, הנושא את העומס הגדול ביותר in vivo, מסנתזים פחות אגרקן, אך יותר דקורין מתאים מהאזורים המכוסים על ידי המניסקוס. המחברים מדגישים גם את החשיבות של שימוש בסחוס מאזורי מפרקים זהים בעת מחקר התפקוד הסינתטי של מפרקים.

חילוף החומרים של כונדרוציטים ותגובתם לגורמי בקרה תלויים באופן משמעותי גם בגיל התורם, בהתפתחות השלד שלהם ובמצב המפרקים מהם נלקחים התאים. בכונדרוציטים אנושיים נצפית ירידה משמעותית בתגובה השגשוגית עם הגיל. הירידה הגדולה ביותר נצפית בתורמים בגילאי 40-50 ומעל גיל 60. יתר על כן, חומרת התגובה השגשוגית לגורמי גדילה (למשל, FGF ו-TGF-beta) פוחתת עם הגיל. בנוסף לשינויים כמותיים בשגשוג כונדרוציטים, ישנם גם שינויים איכותיים. תאים מתורמים צעירים (10-20 שנים) מגיבים טוב יותר לגורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF) מאשר ל-TGF-beta, בעוד שההפך נצפה בתאים מתורמים בוגרים. מספר מנגנונים משמשים להסבר שינויים תלויי גיל בתפקוד הסינתטי של כונדרוציטים ותגובתם לגורמי גדילה. אלה כוללים ירידה במספר ובזיקה של קולטני תאי שטח, שינויים בסינתזה ובביו-אקטיביות של גורמי גדילה וציטוקינים, ושינוי של אותות פוסט-קולטן.

מצב פתולוגי של המפרקים משנה גם את המורפולוגיה והפעילות המטבולית של הכונדרוציטים. לפיכך, ג'יי קורי ואחרים (1996) זיהו שלוש תת-אוכלוסיות של כונדרוציטים בסחוס באוסטאוארתרוזיס. כונדרוציטים מהחלק השטחי והעליון של אמצע הסחוס יוצרים אשכולות ומייצרים כמות גדולה יותר של פרוטאוגליקנים וקולגן. TGF-beta וגורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) מסוגלים לעורר את הסינתזה של פרוטאוגליקנים על ידי כונדרוציטים ולנטרל חלקית את ההשפעות של IL-1 ו-TNF-α. קטעי סחוס שנפגעו מאוסטאוארתרוזיס וכונדרוציטים שבודדו מהסחוס של חולה עם אוסטאוארתרוזיס רגישים יותר לגירוי של TGF-beta מאשר כונדרוציטים של סחוס בריא. הבדלים אלה קשורים ככל הנראה לשינויים פנוטיפיים בכונדרוציטים בשכבות העליונות של הסחוס המפרקי.

בידוד של כונדרוציטים בודדים מושג על ידי טיפול רציף בתרבית התאים האלקטרונית (ECM) עם אנזימים פרוטאוליטיים. לאחר שחרורם מה-ECM, התאים המבודדים אידיאליים לחקר הסינתזה דה נובו של רכיבי המטריצה. חלק מהמחברים משתמשים רק בקולגנאז קלוסטרידיאלי, בעוד שאחרים מדגרים מראש את הסחוס עם טריפסין, פרונאז, DNase ו/או היאלורונידאז. מספר התאים המבודדים תלוי באנזימים בהם נעשה שימוש. לכן, כאשר מטפלים בקולגנאז בלבד, ניתן להשיג 1.4-106 כונדרוציטים מגרם אחד של רקמה, בעוד ששימוש בפרונאז, היאלורונידאז וקולגנאז -4.3-106. כאשר מטפלים בקולגנאז, אגרקן, חלבונים, IL-6 ו-IL-8 נשארים בתרבית התאים בכמויות גדולות משמעותית מאשר בטיפול רציף עם אנזימים שונים. ישנם מספר הסברים להבדלים אלה בין שתי תרביות התאים:

  • קולטני תאים ניזוקים או מעוכבים על ידי אנזימים, TGF-beta מעכב סינתזת DNA ופרוטאוגליקן בכונדרוציטים שבודדו טריים (יום 1), בעוד שסינתזת DNA ופרוטאוגליקן בכונדרוציטים שגודלו בשכבה חד-שכבתית (7 ימים) מגורה על ידי TGF-beta. עם זאת, נדרשת תקופה מספקת לביטוי מחדש של רכיבי ממברנה אלה לפני תחילת הניסוי.
  • פרוטאזות אקסוגניות יכולות לשבש את האינטראקציה בין תא למטריצה בתיווך אינטגרינים. משפחת האינטגרינים מקדמת את היצמדותם של כונדרוציטים למולקולות ECM (Shakibaei M. et al., 1997). שיבוש זה יכול להשפיע על ביטוי גנים של מטריקס.
  • שאריות רכיבי המטריצה יכולות לווסת את התפקוד הסינתטי של כונדרוציטים. אינטגרינים מסוגלים לזהות את תוצרי פירוק ה-ECM, ובכך ממלאים תפקיד חשוב בתיקון רקמות לאחר פעולת אנזימים פרוטאוליטיים. ט. לרסון ואחרים (1989) דיווחו כי הוספת פרוטאוגליקנים שלמים או מקוטעים לתרבית תאים מגרה את הסינתזה של חלבונים ופרוטאוגליקנים. עם זאת, רמה גבוהה של חומצה היאלורונית גורמת לירידה משמעותית בהכללת סולפטים בסינתזה של פרוטאוגליקנים על ידי כונדרוציטים של עובר עוף, כונדרוציטים בוגרים של תאי כונדרוסרקומה של חזיר וחולדה. יתר על כן, חומצה היאלורונית היא מעכבת שחרור פרוטאוגליקנים מתאים אפילו בנוכחות IL-1b, TNF-α, FGF, דבר המצביע על פעולה נגדית של הפעילות הביולוגית הראשונה של גורמי גדילה וציטוקינים. המנגנון המדויק העומד בבסיס פעולת החומצה ההיאלורונית נותר לא ברור; ידוע כי כונדרוציטים מכילים קולטן לחומצה היאלורונית הקשור לסיבים של אקטין בציטוזול. קישור חומצה היאלורונית לקולטן שלה מגרה זרחון חלבונים. לפיכך, נתונים אלה מדגימים אפנון של תפקוד מטבולי של כונדרוציטים על ידי מולקולות מקוטעות או טבעיות של חלבוני מטריקס באמצעות הפעלת קולטני קרום התא.
  • גירוי מהיר של סינתזת חלבון המטריצה על ידי כונדרוציטים על ידי אנזימים עשוי להיות תוצאה של שינויים בצורת הכונדרוציטים ו/או ארגון מחדש של השלד התא.
  • ציטוקינים מסוימים (למשל, IL-8) וגורמי גדילה (למשל, IGF-1, TGF-β) נצברים ב-ECM. הדוגמה הידועה ביותר היא קישור TGF-β על ידי דקורין, מה שמביא לירידה ביכולתו של הראשון לגרום לגדילת תאים בתאי שחלה של אוגר סיני. הממצא שתכולת הדקורין בסחוס עולה עם הגיל מצביע על ירידה בזמינות הביולוגית של TGF-β עם ההזדקנות. גורמי גדילה וציטוקינים עשויים להשתחרר משאריות מטריצה במהלך התרבית ובהמשך לווסת את תפקוד הכונדרוציטים.

trusted-source[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

תרבית חד-שכבתית של כונדרוציטים

הפנוטיפ הממוין של כונדרוציטים מאופיין בעיקר בסינתזה של קולגן מסוג II ופרוטאוגליקנים ספציפיים לרקמה, כמו גם ברמה נמוכה של פעילות מיטוטית. ישנן עדויות לכך שעם טיפוח תאים ממושך בשכבה חד-שכבתית, כמו גם לאחר מספר מעברי תאים חוזרים, כונדרוציטים מאבדים את קווי המתאר הכדוריים שלהם ומקבלים צורה מוארכת, דמוית פיברובלסט. עם מטפלזיה פיברובלסטית כזו, גם התפקוד הסינתטי של התאים משתנה, המאופיין בירידה הדרגתית בסינתזה של קולגנים מסוג II, IX ו-XI ובעלייה בסינתזה של קולגנים מסוג I, III ו-Y. פרוטאוגליקנים קטנים שאינם מצטברים מסונתזים עקב אגרקן פונקציונלי. הסינתזה של קטפסין B ו-L נמוכה ביותר בתאים ממוינים, אך עולה בתהליך אובדן ההתמיינות. קולגנאז-1 מתבטא בכונדרוציטים ממוינים; עם טיפוח ממושך, הביטוי שלו פוחת, בעוד שייצור מעכבי רקמות של מטלופרוטאזות (TIMPs) עולה.

כונדרוציטים ממוינים מבטאים מחדש קולגן של הפנוטיפ הממוין כאשר הם מועברים משכבה חד-שכבתית לתרבית מורחבת. תהליך ההתמיינות קשור כנראה לצורת התא. תכונה זו משמשת באופן קבוע חוקרים החוקרים שתלים פגומים עם כונדרוציטים אוטולוגיים. מספר קטן של תאים המתקבלים מחומר ביופסיה ניתנים להרחבה בתרבית שכבה חד-שכבתית ולאחר מכן להחדיר מחדש למטריצה תלת-ממדית לפני ההשתלה. ביטוי מחדש של פנוטיפ ספציפי על ידי כונדרוציטים ממוינים שהועברו לתרבית אגרוז ניתן לגירוי על ידי TGF-β, קומפלקס אוסאין-הידרוקסיאפטיט וחומצה אסקורבית.

בתגובה לגורמי גדילה וציטוקינים, כונדרוציטים עוברים שינויים במהלך תהליך ההתמיינות. התגובה התאית לציטוקינים וגורמי גדילה שונה בין כונדרוציטים לא ממוינים לבין כונדרוציטים ממוינים. IL-1 מגרה התפשטות פיברובלסטים, בעוד שגדילתם של כונדרוציטים לא ממוינים מעוכבת על ידי IL-1. סינתזת DNA מגורה על ידי IGF-1 בכונדרוציטים מוארכים אך לא שטוחים. בכונדרוציטים ממוינים, ההשפעות הממריצות של IL-1beta ו-TNF-α על ייצור פרוקולגנאז בולטות יותר מאשר בכונדרוציטים לא ממוינים.

גידול כונדרוציטים

גידול כונדרוציטים בתרחיף במדיום נוזלי או במטריצה תלת-ממדית טבעית או סינתטית מייצב את הפנוטיפ של הכונדרוציטים. התאים שומרים על צורתם הכדורית ומסנתזים חלבונים ספציפיים לרקמה. תרבית תרחיפה של כונדרוציטים מומלצת בדרך כלל לחקר היווצרות של מטריצה פרי-תאית חדשה. תרביות של כונדרוציטים בפולימרים סופגים סינתטיים או טבעיים משמשות להשתלת תאים בפגמי סחוס כדי לעודד התחדשות של רקמת סחוס במפרק. המדיום הסינתטי או הטבעי לתאים מושתלים חייב לעמוד במספר דרישות:

  • שתלים חייבים להיות בעלי מבנה נקבובי לצורך הידבקות וצמיחה של תאים,
  • לא הפולימר עצמו ולא תוצרי הפירוק שלו צריכים לגרום לדלקת או לתגובות רעילות בעת השתלה in vivo,
  • על נושא השתל להיות בעל יכולת להיקשר לסחוס סמוך או לעצם תת-סחוסית,
  • המטריצה הטבעית או הסינתטית חייבת להיות בעלת יכולת ספיגה, פירוקה חייב להיות מאוזן על ידי התחדשות רקמות,
  • כדי להקל על תיקון הסחוס, המבנה הכימי וארכיטקטורת הנקבוביות של המטריצה חייבים להקל על שמירה על הפנוטיפ התאי וסינתזה של חלבונים ספציפיים לרקמה על ידי הכונדרוציטים המוצבים בה,
  • במהלך השתלה in vivo, יש צורך ללמוד את התכונות המכניות של המטריצה הסינתטית או הטבעית.

trusted-source[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

השעיה של כונדרוציטים בשלב נוזלי

ניתן למנוע הידבקות של תאים לכלי פלסטיק שבהם מגדלים כונדרוציטים על ידי ציפוי דפנותיהם בתמיסה של מתילצלולוז, אגרוז, הידרוג'ל (פולי-2-הידרוקסיאתיל מתאקרילט), או תערובת קולגן-אגרוז. בתנאים אלה, כונדרוציטים יוצרים צבירים ומסנתזים בעיקר קולגנים אגרקניים וקולגנים ספציפיים לרקמות (סוגים II, IX, XI). בדרך כלל נמצאים שני סוגי תאים. התאים הממוקמים במרכז שומרים על צורה כדורית ומוקפים ב-ECM מפותח היטב, דבר שאושר על ידי מחקרים היסטוכימיים ואולטרה-סטרוקטורליים. בפריפריה, לכונדרוציטים יש קווי מתאר דיסקואידיים והם מוקפים ב-ECM דליל; מעט ידוע על המאפיינים התפקודיים של תאים כאלה.

ניתן לגדל כונדרוציטים על גבי מיקרו-נשאים המוחזקים בתרחיף; חרוזי דקסטרן (ציטודקס), חרוזי דקסטרן מצופים קולגן (ציטודקס III) ומיקרו-כדורים לא נקבוביים של קולגן מסוג I (סלגן) משמשים כמיקרו-נשאים. בתנאי גידול אלה, כונדרוציטים נצמדים לפני השטח של המיקרו-נשא, שומרים על צורתם הכדורית ומייצרים חומר דמוי מטריצה. יתר על כן, השימוש בסלגן מקדם התפשטות כונדרוציטים וביטוי מחדש של הפנוטיפ הרגיל. לכן, גידול כונדרוציטים על גבי מיקרו-כדורים של סלגן יכול לשמש לשחזור פנוטיפ התא לפני ההשתלה.

שיטה נוספת לגידול תרחיף כונדרוציטים במדיום נוזלי היא גידולם בצורת כדורים צפופים המורכבים מתאים (0.5-1 * 10 ב ), המתקבלים על ידי צנטריפוגה. כונדרוציטים כאלה מסוגלים לייצר מטריצה המכילה כמות גדולה של פרוטאוגליקנים, קולגן מסוג II, אך לא קולגן מסוג I, דבר שאושר על ידי שיטות היסטולוגיות, אימונוהיסטוכימיות וכמותיות.

השעיה של כונדרוציטים ב-ECM טבעי

ניתן לגדל כונדרוציטים בתרחיף במטריצה תלת-ממדית (אגר רך, אגרוז, ג'ל קולגן או ספוג, חומצה היאלורונית, דבק פיברין, חרוזי אלגינט).

כונדרוציטים שגודלו באגרוז שומרים על הפנוטיפ הרגיל שלהם ומייצרים קולגן מסוג II ואגרגטים של אגרקן ספציפיים לרקמה. כאשר מתורבים באגרוז, פרוטאוגליקנים המסונתזים על ידי התא משתחררים למדיום למשך 50 יום. לשם השוואה, בתרבית חד-שכבתית, הפאזה התאית מתמלאת יתר על המידה בגליקוזאמינוגליקנים כבר ב-5-6 הימים הראשונים של הגידול; כאשר מתורבים במדיום, לאחר סינתזה ושחרור מוגברים של גליקוזאמינוגליקנים ב-8-10 הימים הראשונים, מתרחשת ירידה תלוית-זמן שלהם. אף על פי כן, התנהגותם של כונדרוציטים כאשר מתורבים באגרוז שונה מזו שבגוף החי. באגרוז, מספר רב של אגרגטים של אגרקן מסונתזים מכילים מולקולות קטנות יותר ופחות מולקולות מאשר בגוף החי. TGF-β מגרה סינתזת פרוטאוגליקנים באקספלנט, אך מפחית את סינתזת האגרקן באגרוז.

אלגינט הוא פוליסכריד ליניארי המופק מאצות חומות. בנוכחות קטיונים דו-ערכיים, כגון יוני סידן 2+, פולימר זה הופך לג'ל. כל כונדרוציט הלכוד באלגינט מוקף במטריצה של פוליסכרידים בעלי מטען שלילי, אשר נקבוביותיהם דומות לאלו שבסחוס היאליני. המטריצה שנוצרת על ידי כונדרוציטים בחרוזי אלגינט מורכבת משני מדורים - שכבה דקה של מטריצה הקשורה לתאים המתאימה למטריצה הפרי-תאית והטריטוריאלית של הסחוס המפרקי ומטריצה מרוחקת יותר המקבילה לזו הבין-טריטוריאלית ברקמה טבעית. ביום ה-30 לגידול, הנפח היחסי והמוחלט שתפוסים התאים וכל אחד משני המדים בחרוזי אלגינט זהים כמעט לחלוטין לאלו שבסחוס טבעי. במשך כמעט 30 יום, כונדרוציטים שומרים על צורתם הכדורית ומייצרים אגרקן, שתכונותיו ההידרודינמיות דומות לאלו של מולקולות אגרקן במטריצת הסחוס המפרקי, כמו גם מולקולות קולגן מסוגים II, IX ו-XI. במקביל, כמו תרביות סידן אחרות, תאים שטוחים נמצאים על פני חרוזי האלגינט, המייצרים כמות קטנה של מולקולות קולגן מסוג I, אשר משתחררות ישירות לתוך המדיום ואינן משולבות ב-ECM. בחרוזי האלגינט נצפית ריבוי מתון של כונדרוציטים. לאחר 8 חודשי גידול בג'ל אלגינט, כונדרוציטים בוגרים אינם מאבדים פעילות מטבולית וממשיכים לסנתז קולגן מסוג II ואגרקן ספציפיים לרקמה.

ה. טנאקה ואחרים (1984) חקרו את תכונות הדיפוזיה של מולקולות טבעיות שונות באלגינט ומצאו שמולקולות גדולות מ-70 kDa לא עוברות דיפוזיה דרך אלגינט. לכן, תרבית תאים באלגינט מתאימה לחקר הרגולציה של ביוסינתזה של המטריצה וארגון ECM. זמינותם של תאים שגודלו באלגינט מאפשרת לחקור את פעולתם של גורמי בקרה פפטידיים וחומרים פרמקולוגיים ברמות התעתוק, הפוסט-תעתוק והטרנסלציוניות.

כונדרוציטים מגודלים גם במטריצה של סיבי קולגן מסוגים I ו-II. S. Nehrer et al. (1997) השוו את תפקודם של כונדרוציטים כלביים במטריצות פולימר קולגן-פרוטאוגליקן נקבוביות המכילות קולגנים מסוגים שונים. הם מצאו הבדלים חשובים במורפולוגיה של התפקוד הביוסינתטי של כונדרוציטים שגודלו במטריצות קולגן המכילות קולגן מסוגים I ו-II. תאים במטריצה של קולגן מסוג II שמרו על צורתם הכדורית, בעוד שבקולגן מסוג I הייתה להם מורפולוגיה דמוית פיברובלסט. יתר על כן, במטריצה של קולגן מסוג II, כונדרוציטים ייצרו כמות גדולה יותר של גליקוזאמינוגליקנים. J. van Susante et al. (1995) השוו את תכונותיהם של כונדרוציטים שגודלו בג'ל אלגינט וקולגן (סוג I). המחברים מצאו עלייה משמעותית במספר התאים בג'ל הקולגן, אך החל מהיום השישי לגידול התאים איבדו את הפנוטיפ האופייני שלהם, והפכו לתאים דמויי פיברובלסט. בג'ל האלגינט נצפתה ירידה במספר התאים, אך הכונדרוציטים שמרו על הפנוטיפ הרגיל שלהם. בג'ל הקולגן מספר הפרוטאוגליקנים לתא היה גבוה משמעותית מאשר באלגינט, אך בג'ל נצפתה ירידה בסינתזה של יסודות המטריצה, החל מהיום השישי לגידול, בעוד שבאלגינט הסינתזה המשיכה לעלות.

מטריצת פיברין תלת-ממדית מוצקה היא חומר טבעי התומך בכונדרוציטים התלויים בה בפנוטיפ ממוין. מטריצת פיברין תלת-ממדית יכולה לשמש גם כנשא בהשתלת כונדרוציטים. יתרונות הפיברין הם היעדר ציטוטוקסיות, היכולת למלא חלל ויכולת הידבקות. מחקרים היסטולוגיים וביוכימיים, אוטורדיוגרפיה ומיקרוסקופ אלקטרונים הראו שכונדרוציטים בג'ל פיברין שומרים על המורפולוגיה שלהם, מתרבים ומייצרים מטריקס גם לאחר שבועיים של טיפוח. עם זאת, ג'. הומינגה ואחרים (1993) דיווחו כי התפרקות הפיברין מתחילה לאחר 3 ימים של טיפוח, ודה-התמיינות הכונדרוציטים מתקדמת.

השעיה של כונדרוציטים ב-ECM מלאכותי (סינתטי)

ניתן להשיג שתלי סחוס לניתוחים שחזוריים או אורתופדיים על ידי גידול כונדרוציטים מבודדים במבחנה בתוך מטריצה ביו-קומפטיבית סינתטית.

כונדרוציטים שגודלו בחומצה פוליגליקולית מתרבים ושומרים על מורפולוגיה ופנוטיפ תקינים במשך 8 שבועות. הקומפלקס של כונדרוציטים וחומצה פוליגליקולית מורכב מתאים, גליקוזאמינוגליקנים, קולגנים, ויש לו קפסולת קולגן חיצונית. עם זאת, שתלים כאלה מכילים שני סוגים של מולקולות קולגן - I ו-II. שתלים מכונדרוציטים שעברו התמיינות על ידי סדרה של מעברים מכילים כמות גדולה יותר של גליקוזאמינוגליקנים וקולגנים מאשר שתלים מכונדרוציטים שלא התמיינו בעיקרם.

ל. פריד ואחרים (1993b) השוו את התנהגותם של תרביות כונדרוציטים אנושיות ובקר בחומצה פוליגליקולית פיברוזית (FPGA) ובחומצה פולילקטית נקבובית (PPLA). לאחר 6-8 שבועות של גידול כונדרוציטים בקר ב-FPGA או PPLA, המחברים הבחינו בהתפשטות תאים ובהתחדשות מטריצת הסחוס. ב-FPGA, לכונדרוציטים הייתה צורה כדורית והם היו ממוקמים בחסר מוקף במטריצת סחוס. לאחר 8 שבועות של גידול חוץ גופי, הרקמה המתחדשת הכילה עד 50% חומר יבש (4% מסת תאים, 15% גליקוזאמינוגליקנים ו-31% קולגנים). ב-PPLA, לתאים הייתה צורת כישור וכמות קטנה של גליקוזאמינוגליקנים וקולגן. ב-FPGA, צמיחת התאים הייתה אינטנסיבית פי 2 מאשר ב-PPLA. בגוף חי, כונדרוציטים שגודלו ב-VPGK וב-PPLC ייצרו רקמה דומה מבחינה היסטולוגית לסחוס תוך 1-6 חודשים. השתלים הכילו גליקוזאמינוגליקנים, קולגנים מסוג I ו-II.

כונדרוציטים עובריים של בקר גודלו בפוליאתילן נקבובי הידרופובי והידרופילי בצפיפות גבוהה. לאחר 7 ימי דגירה בשני הסובסטרטים, התאים שמרו על צורה כדורית והכילו בעיקר קולגן מסוג II. לאחר 21 ימי גידול, נמצא כי המטריצה ההידרופילית מכילה יותר קולגן מסוג II מאשר המטריצה ההידרופובית.

ניתן להשיג רקמת סחוס גם על ידי גידול בשכבה חד-צדדית על מסנני Millicell-CM. ציפוי מקדים של המסננים בקולגן נחוץ להצמדת כונדרויטינים. בדיקה היסטולוגית של התרבית מדגימה הצטברות של כונדרוציטים ברקמת הסחוס המתקבלת המכילים פרוטאוגליקנים וקולגן מסוג II. קולגן מסוג I לא זוהה בתרבית כזו. הכונדרוציטים ברקמת הסחוס שהתקבלה הם בעלי צורה כדורית, אך על פני הרקמה הם שטוחים במידה מסוימת. עובי הרקמה החדשה שנוצרה גדל עם הזמן והיה תלוי בצפיפות ההתחלתית של שכבת התאים החד-צדדית. בתנאי גידול אופטימליים, עובי רקמת הסחוס הגיע ל-110 מיקרומטר, ארגון התאים והקולגן שלה לשכבות שטחיות ועמוקות דומה לזה של סחוס מפרקי. ה-ECM מכיל בערך פי 3 יותר קולגן ופרוטאוגליקנים. לאחר שבועיים של גידול נצפתה הצטברות מטריצה, המאפשרת את החילוץ של הרקמה מהמסנן ושימוש בה להשתלה.

סימס ועמיתיו (1996) חקרו את גידול כונדרוציטים בג'ל פוליאתילן אוקסיד, מטריצה פולימרית עטופה המאפשרת העברת מספר רב של תאים באמצעות הזרקה. שישה שבועות לאחר ההזרקה לרקמה התת עורית של עכברים אתימיים, נוצר סחוס חדש, אשר התאפיין מורפולוגית על ידי אופלסנציה לבנה בדומה לסחוס היאליני. נתונים היסטולוגיים וביוכימיים הצביעו על נוכחות של כונדרוציטים המתרבים באופן פעיל ומייצרים ECM.

הסברה

הוצאת רקמת סחוס משמשת לחקר תהליכי האנא- והקטבוליזם בה, שמירה על הומאוסטזיס, ספיגה ותיקון. כונדרוציטים ברקמת סחוס שומרים על פנוטיפ תקין והרכב ECM תקינים בדומה לאלה שבסחוס המפרקי in vivo. לאחר 5 ימים של גידול בנוכחות סרום, מושגת רמה קבועה של סינתזה ותהליכי פירוק טבעיים. ניתן להאיץ את ספיגת הרקמה בתרבית העיקרית ובתרבית על ידי הוספת סרום באמצעות מספר חומרים, כגון IL-IB, TNF-α, ליפופוליסכרידים חיידקיים, נגזרות חומצה רטינואית או רדיקלים פעילים של חמצן. כדי לחקור תיקון סחוס, הנזק שלו נגרם על ידי מתווכים דלקתיים מסיסים (H2O2 ,IL -1, TNF- α ) או קרע פיזי של המטריצה.

שיטת התרבית האורגנוטיפית היא מודל למחקרים במבחנה (in vitro) של השפעות של גורמים חיצוניים מבודדים על כונדרוציטים והמטריצה הסובבת אותם. בגוף חי (in vivo), כונדרוציטים ממוקמים בדלילות ב-ECM ואינם באים במגע זה עם זה. תרבית הוצאת הסחוס המפרקי משמרת את הארגון המבני הזה, כמו גם את האינטראקציות הספציפיות בין כונדרוציטים לסביבה החוץ-תאית הסובבת אותם. מודל זה משמש גם לחקר השפעות של לחץ מכני, חומרים פרמקולוגיים, גורמי גדילה, ציטוקינים והורמונים על חילוף החומרים של הסחוס.

יתרון נוסף של הוצאת רקמת סחוס הוא היעדר נזק לכונדרוציטים תחת פעולת אנזימים פרוטאוליטיים או גורמים מכניים, דבר בלתי נמנע בבידוד תאים. קולטנים וחלבוני ממברנה וגליקופרוטאינים אחרים מוגנים מפני גורמים מזיקים.

trusted-source[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

תרבות כונדרון

כונדרון הוא יחידה מבנית, תפקודית ומטבולית של סחוס מפרקי המורכבת מכונדרוציט, מטריצה פרי-תאית שלו וקפסולה פילמנטית קומפקטית, האחראית על הומאוסטזיס של המטריצה. כונדרים מופקים מכנית מהסחוס ונאספים באמצעות מספר הומוגניזציות עוקבות במהירות נמוכה. כונדרים המבודדים מאזורים בעומקי סחוס שונים ניתנים לחלוקה לארבע קטגוריות: כונדרון בודד, כונדרים מזווגים, כונדרים מרובים (שלושה או יותר) המסודרים באופן ליניארי (עמודות כונדרון), ואשכולות כונדרון.

כונדרונים בודדים נמצאים בדרך כלל בשכבות האמצעיות של סחוס שלם, כונדרונים מזווגים נמצאים בגבול השכבות האמצעיות והעמוקות, כונדרונים מרובים המסודרים באופן ליניארי אופייניים לשכבות העמוקות של סחוס שלם. לבסוף, אשכולות כונדרונים מורכבים מקבוצות מאורגנות באופן אקראי של כונדרונים בודדים וזוגיים, אשר שומרים על מצב צבירה לאחר הומוגניזציה. אשכולות כונדרונים הם שברי סחוס גדולים, המכילים בדרך כלל מספר כונדרונים וסיבורי קולגן המסודרים באופן רדיאלי, כלומר, ארגון טיפוסי המאפיין את השכבות העמוקות של המטריצה. כונדרונים מקובעים באגרוז שקוף, המאפשר מחקרים של המבנה שלהם, ההרכב המולקולרי והפעילות המטבולית שלהם. מערכת הכונדרון-אגרוז נחשבת למיקרו-מודל של סחוס, השונה ממערכת הכונדרוציטים-אגרוז המסורתית בכך שהמיקרו-סביבה הטבעית נשמרת, ואין צורך לסנתז ולהרכיב אותה. תרבית כונדרונים היא מודל לחקר האינטראקציות של תאים ומטריצה בסחוס המפרקי בתנאים רגילים ופתולוגיים.

trusted-source[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

תרבית של כונדרוציטים אלמותיים

DNA רקומביננטי או וירוסים המכילים אונקוגן המסוגלים להפוך תא ל"אלמותי" משמשים ליצירת שורות תאים קבועות. כונדרוציטים בני אלמוות מסוגלים להתרבות ללא סוף תוך שמירה על פנוטיפ יציב. פ. מאליין-גרין ואחרים (1995) הראו כי האונקוגן SV40T גורם להתרבות של כונדרוציטים של עכברים, אשר ממשיכים לבטא ביציבות קולגן מסוג II, IX ו-XI, כמו גם אגרקן מפרקי וחלבון מקשר. עם זאת, שורה כזו רוכשת את היכולת לסנתז קולגן מסוג I כאשר היא גדלה בתרבית חד-שכבתית או בג'ל אגרוז.

וו. הורטון ואחרים (1988) תיארו קו של תאים אלמותיים עם רמת ביטוי נמוכה של mRNA של קולגן מסוג II. תאים אלה הושגו על ידי טרנספורמציה שלהם עם רטרו-וירוס עכברי המכיל אונקוגנים I-myc ו-y-ra. סוג תאים זה מייצג מודל ייחודי לחקר האינטראקציות של המטריצה המפרקית בהיעדר קולגן מסוג II, כמו גם את ויסות סינתזת הקולגן מסוג II.

תרבית של כונדרוטים עם גנים מוטנטיים או מחוקים היא מודל נוח לחקר תפקודם הפיזיולוגי. מודל זה מתאים במיוחד לחקר תפקידן של מולקולות ספציפיות בארגון מטריצת הסחוס או לחקר השפעותיהם של גורמים רגולטוריים שונים על חילוף החומרים של הסחוס. כונדרוציטים עם גן מחוקים לקולגן מסוג IX מסנתזים סיבי קולגן רחבים יותר מהרגיל, דבר המצביע על כך שקולגן מסוג IX מווסת את קוטר הסיבים. כפי שצוין בפרק 1, מוטציה בגן COLAI המקודד לקולגן מסוג II התגלתה לאחרונה במשפחות עם דלקת מפרקים ניוונית כללית ראשונית. כדי לחקור את השפעת הקולגן מסוג II המוטנטי על המטריצה המפרקית, R. Dharmrvaram ואחרים (1997) טרנספקטו (הודבקו בחומצת גרעין זרה) COL 2 AI פגום (ארגינין במיקום 519 מוחלף בציסטאין) לתוך כונדרוציטים עובריים אנושיים במבחנה.

מערכת תרביות משותפות. במפרק, הסחוס מקיים אינטראקציה עם סוגים אחרים של תאים הכלולים בקרום הסינוביאלי, בנוזל הסינוביאלי, ברצועות ובעצם התת-סחוסית. חילוף החומרים של כונדרוציטים יכול להיות מושפע מגורמים מסיסים שונים המסונתזים על ידי התאים המפורטים. לפיכך, בדלקת פרקים, הסחוס המפרקי נהרס על ידי אנזימים פרוטאוליטיים ורדיקלים חופשיים המיוצרים על ידי תאים סינוביאליים. לכן, פותחו מודלים לחקר אינטראקציות מורכבות בין סחוס לרקמות הסובבות, הנקראות תרביות משותפות.

S. Lacombe-Gleise ואחרים (1995) גידלו כונדרוציטים ואוסטאובלסטים של ארנבת במערכת תרבית משותפת (COSTAR) שבה התאים הופרדו על ידי ממברנה מיקרופורוסית (0.4 מיקרומטר) המאפשרת חילופי תאים בין שני סוגי התאים ללא מגע ישיר. מחקר זה הדגים את יכולתם של אוסטאובלסטים לעורר צמיחת כונדרוציטים באמצעות מתווכים מסיסים.

AM Malfait ושותפיו (1994) חקרו את הקשר בין מונוציטים בדם היקפי לבין כונדרוציטים. מודל זה נוח לחקר תהליכים בתיווך ציטוקינים בארתרופתיות דלקתיות (דלקת מפרקים שגרונית, ספונדילוארתריטיס סרו-נגטיבית וכו'). מחברי המודל הפרידו בין התאים באמצעות קרום קושר חלבונים עם נקבוביות בקוטר של 0.4 מיקרומטר. המחקר הראה שמונוציטים שעברו גירוי בליפופוליסכריד ייצרו IL-1 ו-TNF-α, אשר עיכבו את הסינתזה של אגרקן על ידי כונדרוציטים ותרמו לפירוק של אגרגטים של אגרקן שכבר סונתזו.

ק. טאדה ואחרים (1994) יצרו מודל של תרבות משותפת (coculture) שבו תאי אנדותל בג'ל קולגן (סוג I) הונחו בתא פנימי מופרד מהתא החיצוני, ובתוכו הונחו כונדרוציטים באמצעות פילטר בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרון. במצב של בידוד מוחלט מהתא החיצוני, תאי אנדותל אנושיים יצרו צינורות בג'ל קולגן בנוכחות EGF או TGF-a. כאשר שני סוגי התאים גודלו בו זמנית, היווצרות צינורות תלויי TGF-a על ידי תאי אנדותל עוכבה. עיכוב תהליך זה על ידי כונדרוציטים בוטל חלקית על ידי נוגדנים אנטי-TGF-beta. ניתן להניח ש-TGF-beta המיוצר על ידי כונדרוציטים מעכב את כלי הדם של הסחוס עצמו.

ש. גרוט ואחרים (1994) גידלו בו זמנית כונדרוציטים מאזורי ההיפרטרופיה והפרוליפרטיביות של עצם של עובר עכבר בן 16 ימים עם חתיכות של רקמת מוח. לאחר 4 ימים של טיפוח, נצפתה התמיינות טרנס של כונדרוציטים לאוסטאובלסטים ותחילת היווצרות אוסטאואידים. לאחר 11 ימים של טיפוח, חלק מהסחוס הוחלף ברקמת עצם ומטריצת העצם הסתיידה חלקית. נוירופפטידים ומוליכים עצביים מסוימים המיוצרים על ידי רקמת המוח משפיעים על חילוף החומרים של אוסטאובלסטים או שיש להם קולטנים עבורם. ביניהם נמנים נוראפינפרין, פפטיד וזואקטיבי של המעי, פפטיד הקשור לגן קלציטונין, חומר P וסומטוסטטין. חתיכות של רקמת מוח שגודלו יחד עם כונדרוציטים יכולות לייצר חלק מהגורמים המפורטים המסוגלים לגרום לתהליך של התמיינות טרנס של כונדרוציטים לאוסטאובלסטים.

trusted-source[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

השפעת גורמים חיצוניים על תרבית כונדרוציטים

השפעת מתח החמצן על חילוף החומרים של כונדרוציטים

ברוב המקרים, תרביות כונדרוציטים מתפתחות בתנאים של מתח חמצן אטמוספרי. עם זאת, ידוע היטב כי כונדרוציטים in vivo קיימים בתנאים היפוקסיים ומתח החמצן משתנה בתנאים פתולוגיים שונים. במהלך תהליך ההבשלה, נצפים שינויים משמעותיים באספקת הדם לאפיפיזות. מכיוון שהווסקולריזציה משתנה באזורים שונים של לוח הגדילה, גם מתח החמצן בהם משתנה. C. Brighton and R. Heppenstall (1971) הדגימו כי בלוח הטיביאלי של ארנבות, מתח החמצן באזור ההיפרטרופיה נמוך יותר מאשר בסחוס שמסביב. מדידות של כמה פרמטרים מטבוליים הראו כי כונדרוציטים מסוגלים להגיב במהירות לשינויים מקומיים בריכוז החמצן. ראשית, במתח חמצן נמוך, צריכתו על ידי כונדרוציטים פוחתת. עם ירידה במתח החמצן מ-21% ל-0.04%, ניצול הגלוקוז עולה, פעילות האנזימים הגליקוליטיים וסינתזת חומצת החלב עולות. אפילו במתח חמצן נמוך, הכמות המוחלטת של ATP, ADP ו-AMP נשארת יציבה. נתונים אלה מצביעים על כך שחילוף החומרים של כונדרוציטים מכוון לשימור אנרגיה מקסימלי. עם זאת, פעילות סינתטית, ולכן תהליכי תיקון, משתנים בתנאים היפוקסיים.

מתח חמצן גבוה משפיע גם על חילוף החומרים של כונדרוציטים, וגורם לירידה בסינתזת פרוטאוגליקן ו-DNA ולפירוק מטריצת הסחוס. השפעות אלו מלוות בדרך כלל בייצור של רדיקלים חופשיים של חמצן.

השפעת ריכוז היונים והלחץ האוסמוטי של הסביבה על תפקוד הכונדרוציטים

בסחוס טבעי, ריכוז היונים שונה באופן משמעותי מזה שברקמות אחרות: תכולת הנתרן במדיום החוץ-תאי היא 250-350 מילימול, והאוסמולריות שלו היא 350-450 מוסמול. כאשר מבודדים כונדרוציטים מה-ECM ומודגרים במדיום סטנדרטי (DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Medium), האוסמולריות היא 250-280.7 מוסמול), הסביבה המקיפה את התאים משתנה באופן דרמטי. בנוסף, ריכוז הסידן והאשלגן במדיום סטנדרטי נמוך משמעותית מאשר ברקמה טבעית, וריכוז האניונים גבוה משמעותית.

הוספת סוכרוז למצע מגבירה את האוסמולריות שלו וגורמת לעלייה תוך תאית חולפת בריכוז אניוני H + וסידן בציטוזול. שינויים תוך תאיים כאלה יכולים להשפיע על תהליכי ההתמיינות של הכונדרוציטים ועל פעילותם המטבולית. ג'יי אורבן ואחרים (1993) מצאו כי שילוב התאים החוץ תאיים מסוג 358 -סולפט ו -3 H-פרולין על ידי כונדרוציטים מבודדים שמודגרו ב-DMEM סטנדרטי למשך 2-4 שעות היה רק 10% מזה שברקמה טבעית. עוצמת הסינתזה הגיעה למקסימום באוסמולריות של המצע החוץ תאי של 350-400 מוסמול הן בכונדרוציטים שבודדו טריים והן ברקמות סחוס שנלקחו מהגוף. יתר על כן, נפח הכונדרוציטים גדל ב-30-40% לאחר הצבת התאים המבודדים ב-DMEM סטנדרטי באוסמולריות שצוינה. עם זאת, כאשר מטפחים כונדרוציטים בתנאים של אוסמולריות לא פיזיולוגית במשך 12-16 שעות, התאים מסתגלים לתנאים החדשים, ומפחיתים את עוצמת הביוסינתזה ביחס לשינוי באוסמולריות של הסביבה החוץ-תאית.

פ. בורגטי ואחרים (1995) חקרו את השפעת האוסמולריות של המדיום החוץ-תאי על הצמיחה, המורפולוגיה והביוסינתזה של כונדרוציטים של חזירים. המחברים הדגימו מאפיינים ביוכימיים ומורפולוגיים דומים של כונדרוציטים שגודלו במדיום עם אוסמולריות של 0.28 ו-0.38 מוסמול. באוסמולריות בינונית של 0.48 מוסמול, נצפתה ירידה בהתפשטות תאים ובסינתזת חלבונים במהלך 4-6 השעות הראשונות של הגידול, אך פרמטרים אלה התאוששו לאחר מכן ובסופו של דבר הגיעו לערכי בקרה. כאשר כונדרוציטים גודלו במדיום עם אוסמולריות של 0.58 מוסמול, התאים איבדו את היכולת לשמור על העוצמה הפיזיולוגית של תהליכי התפשטות, ולאחר 6 ימים מספר הכונדרוציטים הופחת משמעותית. באוסמולריות בינונית של 0.58 מוסמול, נצפתה עיכוב עמוק של סינתזת חלבונים. בנוסף, כאשר גדלים במדיה עם אוסמולריות של 0.28-0.38 mOsm, הכונדרוציטים שומרים על הפנוטיפ הפיזיולוגי שלהם; באוסמולריות גבוהה יותר (0.48-0.58 mOsm), מתרחשים שינויים משמעותיים במורפולוגיה של התאים, המתבטאים באובדן הפנוטיפ האופייני, הפיכת הכונדרוציטים לתאים דמויי פיברובלסטים, ואובדן היכולת של התאים להרכיב פרוטאוגליקנים במטריצה. תוצאות מחקר זה מצביעות על יכולתם של הכונדרוציטים להגיב לתנודות מוגבלות באוסמולריות של הסביבה החוץ-תאית.

שינויים בריכוז של יונים אחרים יכולים גם הם להשפיע על תהליכי הביוסינתזה בכונדרוציטים. לפיכך, מידת השילוב של 35S (סולפט) עולה בחצי עם עלייה בריכוז יוני האשלגן מ-5 מילימול (הריכוז במדיום DM EM סטנדרטי) ל-10 מילימול (הריכוז ב-ECM in vivo). ריכוזי סידן מתחת ל-0.5 מילימול קידמו ייצור קולגן על ידי כונדרוציטים בוגרים של בקר, בעוד שריכוז של 1-2 מילימול (התואם לריכוז במדיום DM EM סטנדרטי) גרם לירידה משמעותית בסינתזת הקולגן. עלייה מתונה בביוסינתזה נצפתה ברמות סידן גבוהות (2-10 מילימול). קטיונים שונים משתתפים בהיצמדות של כונדרוציטים לחלבוני ECM. לפיכך, יוני מגנזיום ומנגן מספקים היצמדות לפיברונקטין ולקולגן מסוג II, בעוד שיוני סידן אינם משתתפים בהיצמדות של כונדרוציטים לחלבונים. לפיכך, תוצאות המחקרים המתוארים מצביעות על השפעת השינויים ביונים חוץ-תאיים של אשלגן, נתרן, סידן ואוסמולריות של המדיום על תפקוד הביוסינתטי של כונדרוציטים המודגרים במדיום סטנדרטי.

השפעת לחץ מכני על חילוף החומרים של כונדרוציטים

קיבוע מפרק גורם לאטרופיה הפיכה של הסחוס, דבר המצביע על הצורך בגירויים מכניים לתהליכים מטבוליים תקינים ב-ECM. ברוב המקרים, מודלי תרבית התאים בהם נעשה שימוש מתקיימים תחת לחץ אטמוספרי רגיל. מ. רייט ואחרים (1996) הראו כי הסביבה המכנית משפיעה על חילוף החומרים של הכונדרוציטים, תגובת התא תלויה בעוצמת ובתדירות העומס הדחוס. ניסויים עם עומס על אקספלנטים של סחוס מפרקי שלם במבחנה הראו ירידה בסינתזה של חלבונים ופרוטאוגליקנים תחת פעולת עומס סטטי, בעוד שעומס דינמי מגרה תהליכים אלה. המנגנונים המדויקים של השפעת העומס המכני על הסחוס הם מורכבים וקשורים כנראה לעיוות תאים, לחץ הידרוסטטי, לחץ אוסמוטי, פוטנציאל חשמלי וקולטנים תאיים על פני השטח עבור מולקולות מטריצה. כדי לחקור את ההשפעה של כל אחד מהפרמטרים הללו, יש צורך ליצור מערכת שבה ניתן לשנות פרמטר אחד באופן עצמאי. לדוגמה, תרבית אקספלנט אינה מתאימה לחקר עיוות תאים, אך ניתן להשתמש בה כדי לחקור את ההשפעה הכללית של לחץ על הפעילות המטבולית של כונדרוציטים. דחיסת סחוס מובילה לעיוות תאים ומלווה גם בהופעת מפל לחץ הידרוסטטי, פוטנציאל חשמלי, זרימת נוזלים ושינויים בפרמטרים פיזיקוכימיים כגון תכולת המים במטריקס, צפיפות המטען החשמלי ורמת הלחץ האוסמוטי. ניתן לחקור את עיוות התאים באמצעות כונדרוציטים מבודדים טבולים בג'ל אגרוז או קולגן.

מספר מערכות פותחו כדי לחקור את השפעת הגירוי המכני על תרבית כונדרוציטים. חוקרים מסוימים משתמשים במערכות בהן מופעל לחץ על תרבית התאים דרך הפאזה הגזי. לפיכך, JP Veldhuijzen ואחרים (1979), תוך שימוש בלחץ של 13 kPa מעל אטמוספרי בתדירות נמוכה (0.3 הרץ) למשך 15 דקות, הבחינו בעלייה בסינתזה של cAMP ופרוטאוגליקנים ובירידה בסינתזת DNA. R. Smith ואחרים (1996) הראו שחשיפה לסירוגין של תרבית של כונדרוציטים בקר ראשוניים ללחץ הידרוסטטי (10 MPa) בתדירות של 1 הרץ למשך 4 שעות גרמה לעלייה בסינתזה של אגרקן וקולגן מסוג II, בעוד שלחץ קבוע לא השפיע על תהליכים אלה. באמצעות מערכת דומה, Wright ואחרים (1996) דיווחו כי לחץ מחזורי על תרבית תאים קשור להיפרפולריזציה של קרום התא של הכונדרוציטים ולהפעלת תעלות אשלגן תלויות Ca2 +. לפיכך, השפעות הלחץ המחזורי מתווכות על ידי תעלות יונים המופעלות על ידי מתיחה בקרום הכונדרוציטים. תגובת הכונדרוציטים ללחץ הידרוסטטי תלויה בתנאי תרבית התאים ובתדירות העומס המופעל. לפיכך, לחץ הידרוסטטי מחזורי (5 מגה פסקל) מפחית את שילוב הסולפט בשכבת הכונדרוציטים בתדירות של 0.05, 0.25 ו-0.5 הרץ, ואילו בתדירות גבוהה מ-0.5 הרץ, שילוב הסולפט בשכבת הסחוס עולה.

מ. בושמן ואחרים (1992) דיווחו כי כונדרוציטים בג'ל אגרוז משנים ביוסינתזה בתגובה לעומס מכני סטטי ודינמי באותו אופן כמו איבר שלם בתרבית. המחברים מצאו כי עומס מכני יוצר גירוי היפר-אוסמוטי עם ירידה שלאחר מכן ב-pH בכונדרוציטים.

ניתן לחקור את השפעת המתיחה המכנית על תרבית תאים הטבולה בג'ל. ניתן ליצור את כוח המתיחה באמצעות ואקום מבוקר מחשב. כאשר המערכת נמצאת תחת דרגת ואקום מסוימת, תחתית צלחת הפטרי עם תרבית התאים נמתחת בכמות ידועה, העיוות הוא מקסימלי בקצוות תחתית הצלחת ומינימלי במרכז. המתיחה מועברת גם לכונדרוציטים שגודלו בצלחת הפטרי. באמצעות שיטה זו, K. Holm-vall ואחרים (1995) הראו כי בתאי כונדרוסרקומה שגודלו בג'ל קולגן (סוג II), הביטוי של mRNA של 2-אינטגרין גדל. אינטגרין מסוגל להיקשר לקולגן מסוג II. הוא נחשב לקולטן מכאני, מכיוון שהוא מקיים אינטראקציה עם חלבונים הקושרים אקטין, ובכך מחבר את ה-ECM לשלד התא.

השפעת ה-pH על חילוף החומרים של כונדרוציטים

רמת החומציות (pH) של הנוזל הבין-מפרקי של ה-ECM של רקמת הסחוס חומצית יותר מאשר ברקמות אחרות. א. מרודס (1980) קבע את רמת החומציות של מטריצת הסחוס המפרקי ב-6.9. ב. דיאמנט ואחרים (1966) מצאו pH של 5.5 בתנאים פתולוגיים. ידוע כי כונדרוציטים חיים ב-PO2 נמוך, דבר המצביע על התפקיד החשוב של הגליקוליזה (95% מכלל מטבוליזם הגלוקוז) במטבוליזם של תאים אלה; גליקוליזה מלווה בייצור כמות גדולה של חומצה לקטית.

בנוסף לחמצון הסביבה על ידי תוצרי גליקוליזה, למרכיבי המטריצה עצמם יש חשיבות רבה. כמות גדולה של מטען שלילי קבוע על פרוטאוגליקנים משנה את הרכב היונים החוץ-תאיים: נצפית ריכוז גבוה של קטיונים חופשיים (למשל, H +, Na +, K + ) וריכוז נמוך של אניונים (למשל, O2, HCO3). בנוסף, תחת השפעת עומס מכני, מים נפלטים מה-ECM, מה שמוביל לעלייה בריכוז המטענים השליליים הקבועים ולמשיכה של קטיונים נוספים לתוך המטריצה. זה מלווה בירידה ב-pH של הסביבה החוץ-תאית, המשפיעה על ה-pH התוך-תאי, ובכך משנה את חילוף החומרים של כונדרוציטים. ר. וילקין וא. הול (1995) חקרו את השפעת ה-pH של הסביבה החוץ-תאית והתוך-תאית על הביוסינתזה של המטריצה על ידי כונדרוציטים בקר מבודדים. הם צפו בשינוי כפול של סינתזת המטריצה עם ירידה ב-pH. ירידה קלה ב-pH (7.4של 35SO4 ו -3 H-פרולין בכונדרוציטים, בעוד שהחמצה עמוקה יותר של המצע (pH<7.1) עיכבה את הסינתזה ב-75%בהשוואה לקבוצת הביקורת. יצירת pH נמוך (6.65) באמצעות יוני אמוניום גרמה לירידה בסינתזת המטריצה ב-20% בלבד. התוצאות שהתקבלו מצביעות על כך שהשינוי ב-pH של המצע החוץ-תאי של סינתזת המטריצה אינו ניתן להסבר רק על ידי שינויים ב-pH של המצע התוך-תאי. יתר על כן, לכונדרוציטים יש את היכולת לווסת את ה-pH התוך-תאי באמצעות מחליף Na + ו-H +, נשא Cl_ - НСОС3 התלוי ב-Ka +, ו-H + /ATPase.

trusted-source[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

השפעת הרכב מצע הגידול על חילוף החומרים של כונדרוציטים

המצע לגידול כונדרוציטים חייב להתאים לתנאי הניסוי. בשנים האחרונות נעשה שימוש בסרום עגל כדי לייעל את תנאי הגידול. עם זאת, בעת שימוש בסרום, יש לקחת בחשבון מספר נקודות חשובות:

  • צמיחה חיצונית של תאים מפריפריה של רקמה בתרביות איברים,
  • שונות בהרכב הסרומים מסדרות שונות,
  • נוכחותם של רכיבים לא ידועים בהם,
  • סיכון מוגבר להפרעות ולארטיפקטים בעת מחקר השפעתם של גורמים ביולוגיים שונים על הפעילות המטבולית של תאים.

דוגמה לאחרון היא מחקר על השפעת EGF על כונדרוציטים בסחוס בחולדות. EGF עודד את שילובו של 3H- תימידין ועלייה בתכולת ה-DNA בתרבית. השפעה זו הייתה בולטת יותר בריכוזים נמוכים בסרום (<1%), אך בריכוזים גבוהים (>7.5%) ההשפעה נעלמה.

ידוע היטב שרמות הסינתזה והפירוק ב-DMEM בתוספת סרום עגל גבוהות משמעותית בהשוואה לתנאי in vivo. ההבדלים בין מטבוליזם in vivo לבין in vitro עשויים לנבוע מהבדלים בין הנוזל הסינוביאלי לבין המצע בו גדלים התאים. לי ועמיתיו (1997) גידלו כונדרוציטים צעירים של בקר באגרוז באמצעות מצע תזונתי המכיל DMEM בתוספת 20% סרום עגל וכמות גדולה של נוזל סינוביאלי אלוגני רגיל. נוכחות נוזל סינוביאלי במצע גרמה לעלייה בכמות הפרוטאוגליקנים, עד 80% מכמות הנוזל הסינוביאלי הכוללת. תוצאות אלו מצביעות על כך שנוזל סינוביאלי בתרבית גורם לרמת מטבוליזם דומה לזו in vivo, עם רמה גבוהה של סינתזת גליקוזאמינוגליקן ורמה נמוכה של חלוקת תאים.

ג'. ורברוגן ואחרים (1995) הראו כי סינתזת 35S -arrpeKaHa על ידי כונדרוציטים אנושיים שגודלו באגרוז ב-DMEM נטול סרום הייתה 20-30% מרמת הסינתזה שנצפתה ב-DMEM בתוספת 10% סרום עגל. המחברים קבעו את המידה שבה IGF-1, IGF-2, TGF-R או אינסולין שיקמו את ייצור האגרקן במדיום נטול סרום. המחברים הסיקו כי 100 ננוגרם/מ"ל אינסולין, IGF-1 או IGF-2 שיקמו חלקית את סינתזת האגרקן ל-39-53% מרמת הביקורת. לא נצפתה סינרגיה או הצטברות עם שילוב של הגורמים המפורטים. יחד עם זאת, 10 ננוגרם/מ"ל TGF-R בנוכחות 100 ננוגרם/מ"ל אינסולין עודדה את סינתזת האגרקן ל-90% או יותר מרמת הייחוס. לבסוף, טרנספרין בסרום אנושי, לבד או בשילוב עם אינסולין, לא השפיע על סינתזת האגרקן. כאשר סרום עגל הוחלף באלבומין בסרום בקר, תכולת אגרגטים של אגרקן ירדה משמעותית. העשרת מצע הגידול באינסולין, IGF או TGF-R החזירה חלקית את יכולתם של התאים לייצר אגרגטים של אגרקן. יתר על כן, IGF-1 ואינסולין מסוגלים לשמור על הומאוסטזיס בתרביות תאים. לאחר 40 ימי גידול במצע מועשר ב-10-20 ננוגרם/מ"ל IGF-1, סינתזת הפרוטאוגליקן נשמרה באותה רמה או אף גבוהה יותר בהשוואה למצע המכיל 20% סרום עגל. תהליכים קטבוליים התנהלו לאט יותר במצע מועשר ב-IGF-1 מאשר במצע מועשר בתמיסת אלבומין של 0.1%, אך מהר יותר במצע מועשר ב-20% סרום. בתרביות ארוכות חיים, 20 ננוגרם/מ"ל IGF-1 שומר על מצב יציב של תאים.

ד. לי ועמיתיו (1993) השוו את השפעת הרכב מצע התרבית (DMEM, DMEM+20% סרום עגל, DMEM+20 ng/ml IGF-1) על סינתזת DNA בתרבית של הסרת רקמת סחוס, תרבית חד-שכבתית, ובתרחיף אגרוז. בעת תרבית באגרוז בנוכחות סרום, המחברים הבחינו בנטייה של כונדרוציטים להתקבץ לאשכולות גדולים. תאים שגודלו ללא סרום או עם IGF-1 שמרו על צורה עגולה באגרוז, נאספו לקבוצות קטנות, אך לא יצרו אגרגטים גדולים. בשכבה חד-שכבתית, סינתזת ה-DNA הייתה גבוהה משמעותית במצע המכיל סרום מאשר במצע מועשר ב-IGF-1; סינתזת ה-DNA באחרונה הייתה גבוהה משמעותית מאשר במצע הלא מועשר. לא נמצאו הבדלים בסינתזת ה-DNA כאשר כונדרוציטים גודלו בתרחיף אגרוז במצע לא מועשר ובמצע עם IGF-1. במקביל, גידול תרחיפים של כונדרוציטים באגרוז במדיום מועשר בסרום לווה בשילוב מוגבר של הרדיונוקלאוטיד 3H- תימידין בהשוואה למדיומים אחרים.

ויטמין C נחוץ להפעלת אנזימים המעורבים ביצירת מבנה סלילי יציב של סיבי קולגן. כונדרוציטים חסרי חומצה אסקורבית מסנתזים קולגן לא-סלילי חסר-הידרוקסילציה, אשר מופרשים באיטיות. מתן חומצה אסקורבית (50 מיקרוגרם/מ"ל) גורם להידרוקסילציה של קולגן מסוג II ו-IX ולהפרשתו בכמויות תקינות. תוספת ויטמין C לא השפיעה על רמת סינתזת הפרוטאוגליקן. לכן, הפרשת הקולגן מווסתת באופן עצמאי מהפרשת פרוטאוגליקן.

trusted-source[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]

Translation Disclaimer: The original language of this article is Russian. For the convenience of users of the iLive portal who do not speak Russian, this article has been translated into the current language, but has not yet been verified by a native speaker who has the necessary qualifications for this. In this regard, we warn you that the translation of this article may be incorrect, may contain lexical, syntactic and grammatical errors

You are reporting a typo in the following text:
Simply click the "Send typo report" button to complete the report. You can also include a comment.