תאי גזע עובריים

הגילוי של תאי גזע עובריים - לא היה תאונה, והופיע על מחקר הקרקע המוכן בתחום מחקר בביולוגיה התפתחותית. המונח "תא גזע" הוכנס לרפואה כבר בשנת 1908 בקונגרס של החברה ההמטולוגית בברלין על ידי אלכסנדר מקסיסימוב בקשר לתאי המטופויטים. הרבה לפני הבידוד והכנת קווי יציבה של תאי גזע עובריים פלוריפוטנטיים בפיתוח המוקדם של תהליך המחקר השתמשו terato- גזע (תאים-קרצינומה עובר שבה לומדים את המנגנונים הידועים של עובר, כולל הרצף של ביטוי הגנים מוקדם ומוצרי חלבון עבודתם.

אבל האם הטוטפוטנטיות של הגנום האנושי אובדת ללא תקנה בתהליך האבולוציה? לא, ו embryogenesis היא הוכחה. אם כך, אז מתי, באופן עקרוני, את הדרך השנייה של התפתחות אבולוציונית להתממש? ככל הנראה, כאשר אדם עוזב את קוסמוס, שבו התנאים הסביבתיים יהיה קבוע יחסית במשך זמן רב למדי. איבוד העצם (איבוד מינרלים העצם במצב חסר משקל) מאוד שיפוץ מקובל לאט והתחדשות יכול להיחשב כצעד ראשון בתהליך ההסתגלות האנושי כמין הקיום בחלל. עם זאת, התשלום עבור הנתיב השני של התפתחות אבולוציונית יהיה שונה - עקרות יהיה המחיר לשלם בחזרה לכל התאים של טוטפוטנטיות פלסטיות מוחלטת. אז להכפיל בעולם הזה של "זיקית אבולוציונית" לא תהיה המיוזה, otpochkovaniem. אבל נחיה זמן רב. אלמוות Telomerase הוא אלמוות של אמבה. באורגניזם רב תאי, תאי הגזע הם המצע של אורך חיים כמותי ואיכותי.

[1], [2], [3], [4]

מקורות של תאי גזע עובריים

מקורות היום של תאי גזע עובריים לצורך בדיקות מעבדה הם teratocarcinoma בעכברים Line (129 / SV, F19, F8, צין 40, CGR 86, RL, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) ו teratocarcinoma האנושי (NTERA-2, TERA-2 , שיבוט H-9), כמו גם את הקווים של ESC Trauneone. עם זאת, הנוכחות מפורטת דרכון הסלולר המציין פנוטיפ חיסוני, תוצאות ניתוח כרומוזום פרופילי ביטוי mRNA החשופים קולטנים ואיתות החלבון תאי לא לפצות על חסרונות משמעותיים teratokartsinomnyh קווי ESC - איבוד מהיר של מפוטנציית-על ואת האפשרות של יישום של ניסויים הקליניים, והבחנה מעורבת בתרבות קשה מאוד לבודד טהור המקצועית מאוכלוסייה הטרוגנית של תאים. לכן, בדרך כלל מקור קווי ESC המיוצר למטרות קליניות, משמש מסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט, בלסטומרים בודדים עוברים של 8 תאים בשלב של פיתוח, תאים מורולה בשלבים מאוחרים יותר, וכן תאי נבט ראשוניים.

יש לציין כי תאים teratocarcinoma, אם כי יש להם את המאפיין של pluripotency, יש פוטנציאל pluripotent נמוך משמעותית לעומת ESC. השילוב שלהם עם תאים עובריים לעתים רחוקות מוביל להיווצרות של chimeras, שבו, בנוסף, gametes עם גנוטיפ של תאים teratocarcinoma מעולם לא נוצרו. הוא האמין כי זה נובע תופעה מתמשכת במהלך פגמים בכרומוזומים teratocarcinoma תרבית תאים: הפסד של כרומוזום Y, מגוון טריזומיה, מחיקות או טרנסלוקציות.

ניסיונות להבדיל בין קו ESC האנושי בוצעו פעמים רבות, אך משימה זו לא ניתן היה לפתור, שכן בלסטוסיסטים אנושיים רגילים קשה לגשת אובייקטים. בנוסף, בבני אדם, התדירות של הפרעות כרומוזומליות גבוהה יותר מאשר embryogenesis של בעלי חיים. הרוב המכריע של העוברים האנושיים המוקדמים המתקבלים לאחר הפריה חוץ גופית מפגינים מוזאיקה כרומוזומלית כאוטית ולעתים קרובות יש עיוותים מספריים ומבניים. אפילו בשלב מאוחר יותר, בשלב של הבלסטוציסט, רק 20-25% מעוברי האדם מורכבים מתאים עם קריוטיפ רגיל. זה היה כמעט בלתי אפשרי להשתמש עוברים כאלה כדי ליצור ESC, שכן zygotes היו מתורבת בדרך כלל על שלבים של שניים או ארבעה blastomeres ולאחר מכן מושתלים לתוך הרחם. רק לאחרונה היתה טכניקה אמינה שפותחה לטיפוח ביציות אנושיות מופרות לשלב הבלאסטוציסט. החדרת הטכניקה הזו לתרגול הפריה חוץ גופית לא רק הגבירה את תדירות ההשתלה המוצלחת, אלא גם הפכה את הבלסטוציסטים הנורמליים לאובייקט נגיש יותר.

מקור נוסף של תאי גזע פלוריפוטנטיים הוא תאי המין העיקריים, אשר, בניגוד לאוכלוסיות ובתאים מתקדמים יותר germenativnogo האפיתל, הם לא על פני השטח של integrin בטא, אבל להביע phosphatase shelochnoy פעילות גבוהה. יש לציין כי בניסוי, אוכלוסיית תאי הגזע, שנוצרו מתאי מין ראשוניים, נחקרה מאז שנות השמונים של המאה הקודמת. במקביל, פותחה טכניקה לבידוד תאי נבט ראשוניים מן היסוד של גונאד העובר בעכבר. התוצאות הלא מוצלחות הראשונות של גידול תאי נבט ראשוניים במבחנה הצביעו על חוסר התקווה של הניסיונות הללו, שכן התאים, למרות שהם שרדו, לא התפשטו ומתו בתוך 24 השעות הראשונות. מאוחר יותר נמצא כי עכבר תאים נבט העיקרי להתרבות במבחנה רק בנוכחות של גורמי גדילה פוליפפטידים ספציפיים מסיסים וממברנה במדיום התרבות. התוצאות של מחקרים רבים הצביעו על כך שההישרדות וההתפשטות של תאי נבט ראשוניים מחייבת נוכחות במדיום התרבות של LIF בלבד, אך גם קשורה לקרום, וכן למקטעי פלדה מסיסים (SIF). פפטידים אלה מיוצרים על ידי תאים סומטיים של עוברי הומוזיגוטים עבור מוטציה פלדה, ואחד מהם הוא ליגנד של פרוטו אונקוגן cKit.

תאי נבט ראשוניים של יונקים ובני אדם הם ממוצא extragonadal והם המקור להתפתחות המשובטים של קו תא המין. החל קו תאי ניבט קדמוני, כמו גם את כל הרקמות של עובר המזודרם extraembryonic נותן epiblast (האאקטודרם עיקרי) עובר מוקדם שיש ארגון מבני פסיפס. הסרת microsurgical של חלקים שונים של העובר מוקדם הקימה אזור לוקליזציה epiblast של שיבוט של מבשרי מחויב של תאים נבט העיקרי. בעזרת rhxamine dextran, אשר שימש כסמן תא, נקבע כי מבשרי התאים המיניים העיקריים ממוקמים באזור epiblast הפרוקסימלי, ליד ectoderm חוץ עובריים. קו התא המינית הראשוני עולה מתוך 45 תאים שיבוט, הקצאת אשר מתרחשת ממש בתחילת gastrulation. אז ההפרדה המשובשת מתרחשת, ובמהלך gastrulation, תאים המין הראשוני להיכנס מזודרם extraembryonic ו נמצאים בבסיס הניצן אלנטואה, מאחורי הלהקה הראשית. משם תאים הנבט העיקרי נודדים לקראת סוף הגחון של endodervix endocervix ולאחר מכן להעביר באופן פעיל לאורך mesentery, מאכלסים את רולר גניטלי בסוף ההגירה. בתהליך ההגירה, כמו גם ב 2-3 הימים הראשונים של לוקליזציה בגנום, תאי המין העיקריים מתרבים באופן פעיל ועוברים שמונה מחזורי שכפול. אם בתחילת ההגירה יש כ 50 תאים נבט העיקרי, ציסטות הרבייה של עוברי העכבר של התפתחות של 12 יום, מספר תאי המין הראשוני עולה על 25,000.

הדמיון התפקודי של ESCs ותאים ניבטים בראשיתי מדגים אינטגרציה מלאה של האחרון במסה התאית של הבלסטוציסט החלפה ופיתוח הבא מלא של העובר, הרקמות אשר מורכב רק צאצאי תאים ניבטו בראשיתיים. על פי מאפיינים אחרים בעכברים תאי נבט ראשוניים PGCs היו גם זהה, מראה את היכולת להתמיין כיוונים שונים, ליצירת גופים embryoid במבחנה, A teratomas טופס vivo כאשר מוזרק מתחת לעור לעכברים immunodeficient הדומה עכברים testis teratomas ספונטנית קו 129 / ter.

הוא קבע כי, כאשר הוסיף בינוני LIF, ו membrannosvyazannogo מסיסים SIF מבודדים תאי נבט ראשוניים של 8 ימים עוברים בעכברים לשרוד ולהתרבות בתרבות עבור 4 ימים אבל אז למות. יתר על כן, בתקופה שבה התרבות של המוות נצפו תאי נבט בראשיתי חופף לשלב ההתפתחות של עוברי עכברים (12.5-13.5 ימים), כאשר ניצני העיקרי בתאי הנבט נקבה האשכים להיכנס המיוזה, ובסופו של תאי נבט בראשיתי גברים שעוקבים המיטוטי חסום חלוקה. עם זאת, אם אתה מוסיף לסביבה לא צמיחה רק גורמי LIF ושל SIF, אלא גם של FGF2, תאי נבט ראשוניים להמשיך proliferirovat, ותת-תרבויות נוצרות מושבות תאים יכול להתרבות גם לאחר הוצאתו מן הסביבה של גורמי גדילה (SIF ו FGF). תאים כאלה יכולים להיות מתורבת במשך זמן רב על המצע fibroblast עובריים ללא תוספת של גורם צמיחה מסיס LIF. זה שורות תאים יציבה הנגזרות תאים נבט העיקרי שהוצעו להיקרא תאים נבט עובריים. מונח זה אינו יכול להיחשב מוצלח כאשר EG-תאים בתרבית לא ניתן להשיג תאי נבט עובריים, המסוגלים לבצע את השלבים הבאים של oogenesis או יצירת הזרעונים. זאת בשל העובדה כי קווי EG-תא, למרות שמקורם בתאי נבט הקדמוני, אבל בתרבות של רכישת נכסים של תאי גזע פלוריפוטנטיים עובריים מאבדים את יכולתם לבצע את קו germenativnye. במילים אחרות, בתאי הנבט הראשוני במהלך הטיפוח לאבד גמטות תכונותיהם להפוך מבשרי ותאי פלוריפוטנטיים ESC דמוי.

יצוין כי כאשר עכברים EG immunodeficient מנוהלים, טרטומות לא קמות. ההנחה היא כי אובדן היכולת של תאים אנושיים EG ליזום טרטומות נובעת העובדה כי קווים אלה לא נוצרו ישירות תאים נבט ראשוני תרבותי אבל התקבלו תאים מבודדים גופים עובריים. לכן, ייתכן כי הם צאצאים של תאים pluripotent, אבל כבר מחויבים.

יש לציין כי ישנם הבדלים בסיסיים בין תאים EG ותאי נבט העיקרי. אלה האחרונים לא מאפשרים להשיג עוברי העכבר chimeric, אשר מציין את היעדר יכולת של תאים נבט העיקרי להשתלב המסה תא פנימי או trophectoderm. המאפיינים של אוכלוסיית תאי המין הראשוניים דומים יותר לקווים המחייבים של תאים סומטיים של עוברים מאוחרים יותר, שהכנסתם לתוך הבלסטוציסט גם אינה מובילה להיווצרות עוברי כימריים.

טכניקות שינוי culturing גופי Embryoid שהושגו עם EG-אגרגציה של תאים שמתירים בחירה על תקשורת סלקטיבית לקבל אוכלוסייה אחרת של תאים פלוריפוטנטיים, שנקראו "תאים שמקורם גופי embryoid (תאי שמקורם בגוף Embryoid - EBD-תאים). היכולת של תאים EBD להתרבות במשך זמן רב בתרבות מותר ליצור שורות תאים יציב של תאים מחויבים. שיבוטים של תאים המבטאים מגוון רחב של mRNA וחלבון סמנים של תאים מיוחדים התקבלו. גישה זו כתוצאה הוכיחה כי תאי פלוריפוטנטיים האנושיים המין העיקרי, להבדיל במבחנה לתוך תאים מסוגים שונים: נוירונים, גליה, האנדותל של כלי דם, תאי hematopoietic, שריר, ותאי endodermal.

מקורות חלופיים של תאי גזע עובריים

מקור אלטרנטיבי של קווי ESC אנושיים יכול להיות תאים היברידיים. השרשה לתוך הרחם של geterogenomnoy מבנה פרות pseudopregnant שהושג במהלך המיזוג דרך electroporation fetusa תאי סומטיים אדם עם פרות הביצה, אשר הוסרו בעבר מן pronucleus, מאפשרת לקבל את מסת תאים הפנימית של שלבי התפתחות מלאכותיים העובר טרום השרשה. לשם כך, השלב הראשון של ביצית הפרה עם הגרעין המושתל של התא האנושי.

בשלב השני מופק העובר מתוך הבלסטוציסט וממנו - ESC על פי שיטת תומסון. ראוי לציין כי התוצאות הטובות ביותר על בידוד של קווים ESC באמצעות שיטה זו התקבלו באמצעות גרעינים של תאים פוליקולריים או תאים נבט העיקרי המתמידים בגוף האדם במצב של תרדמה. זאת בשל העובדה כי הביצה פרה שתאי המושתלים אנושיים גרעין neukorochennye צריך פעילות גבוהה הטלומרים telomeazy כי תמנע שיבוטי ESC הזדקנות מוקדמת נגזרים ביצה היברידית (רפין, 2001). זה ידוע כי החשוב ביותר תאיים סמן EGF חלבונים הם Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, אשר שייכים מה שנקרא חלבונים משתנים הכרומטין. משתיקי קול מספקים אריזה קומפקטית במיוחד של ההטרוכרומטין, המונעת היווצרות של לולאות של euchromatin. חבילת הכרומטין מתווכת על ידי חלבונים אלה בקורלציה עם הטוטפוטנטיות של הגנום ESC. עד כה, זה כבר נקבע כי ovules בוגרת של בקר ובני אדם הם רק סוג של תאים מיוחדים המכילים ריכוזים גבוהים של חלבונים משתיק בציטופלזמה. על בסיס זה, פותחה שיטה לייצור ESCs היברידיים על ידי העברת גרעיני תאים סומטיים לא ביצים גרעיניות של פרות. מחקרים ראשוניים במבחנה הראו שהציטופלסמה של תאי הביצה של הפרות משחזרת את הטוטפוטנטיות של הגנום האנושי של תא הגומי הסומטי ב -12-24 שעות של עיבוד.

מעניין במיוחד נתונים על התכונות של פיתוח preimplantation של עוברים אנושיים, אשר מצביעים על החלפת מאוחר יותר של תאים טוטיפוטנטיים על ידי אוכלוסייה של תאים pluripotent מאשר בעכברים. המחקר של התמורות התא הראה כי תאים של המסה הפנימית של התא של הבלסטוציסט האנושי, בנוסף ESCs, גם לייצר תאים trophoblast, אשר מציין את כוחם הכולל.

זה ידוע כי בשלב של בלסטוציסט יש שתי אוכלוסיות תאים שונים שבוצעו. אחד מהם הוא השכבה החיצונית של הבלסטוציסט, trofectoderm, נגזר תאי trophoblast ורכיבים אחרים עובריים. האוכלוסייה השנייה של תאים מקובצים לתוך מסה צפופה, אשר פנייה פני השטח של trophectoderm. אוכלוסיית התא של מסת התאים הפנימיים נגזרת מכל רקמות וחיידקים של איברי העובר. בשלב של blastocyst מאוחר, anoderm עובריים נוספת נוצרת מתוך מסת תאים פנימי epiblast נוצר (ectoderm העיקרי). במקביל, תאים epiblast לשמור pluripotency, בעוד היכולת להבדיל תאים של endoderm חוץ-נבירי מוגבל.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

השגת תאי גזע עובריים אנושיים

עד לאחרונה, היה האמין כי זה היה בלתי אפשרי להשיג ESC מן trophoblast. עם זאת תאי גזע דיפלואידי קו trophectoderm מבודדים הבלסטוציסט במדיום המכיל, במקום LIF ו הפרין FGF2, שמתרבים והופכים תאי גזע. אם תסיר מן בעיצומו של FGF2, התאים trophectoderm להפסיק רבייה, הם מתחילים endoreduplication הכרומוזומים ואלמנטים הסלולר trofektodermalnye התחלפו בהדרגה תאים trophoblast ענק. כנראה, LIF לא לעורר התפשטות של תאים trophectoderm בשל העובדה כי FGF2 מפעילה transsignalizatsii מנגנון כמו FGF2, מחייב לקולטן ציטופלסמית (FGFR2), להפעיל kinase MAP בציטופלסמה - ERK1 ו ERK2. כתוצאה מכך, כאשר שולב התאים של הבלסטוציסט של מסלול אחד איתות (LIF - gpl30 - JAK-קינאז - STAT3) תאי מסת תאים פנימיים הופכים hESCs pluripotent, תוך הפעלת המנגנון השני של איתות transmembrane (FGF2 - FGFR2 - MAP קינאזות ERK1 / ERK2) ב blastocyst, תאי גזע של trophectoderm נוצרים. הבחירה של נתיב האיתות, בתורו, תלויה בפעילות הגן Oct4. הגן השייך זה תחום Pou, הממוקם ב לוקוס t 17 אוטוזומים והוא הביע במהלך oogenesis, ריסוק תקופה כמו גם בתאים של מסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט, ואת בתאי הנבט בראשיתי. הגן Oct4 תפקיד פונקציונאלי הוא קידוד גורם שעתוק הכרחי להתרחשות של תאים פלוריפוטנטיים, בידול dedifferentiation שלהם.

הביטוי של הגן oct4 ב ESC משתנה בהתאם האינטראקציה של גורם שעתוק זה עם cofactors. כיוונית כיוונית של ביטוי oct4 ב blastocysts הראו כי כאשר הפעילות שלה יורדת, מחצית התאים טופס trophectoderm, ואילו עם עלייה ביטוי המושרה של oct4, בעיקר ESC מתרחשת.

בניסוי, ESC לא ניתן להמיר לקו כאשר מטפחים blastomeres טוטפוטינט בשלב של ריסוק, כמו גם בשלב של gastrulation ושלבים מאוחרים יותר של התפתחות עובריים. עכבר ESCs בדרך כלל להקצות ב הריון 3.5-4.5 ימים, אשר תואם את (השכבה האחת של הבלסטוציסט) השישית בשלבים שביעיים (דו שכבתי של הבלסטוציסט - גליל ביצה מוקדם) עובר נורמלי. ברור, רק בתקופה preimplantation את העוברים של עכברים מכילים אוכלוסיות הסלולר שניתן להפוך ESC. כתוצאה מכך, בידוד של קווי ESC אפשרי רק בשלבים מסוימים של embryogenesis. Totitipotent, מנקודת מבט של האפשרות של פיתוח העובר קיימא עם ממברנות עובריים ושליה, הם זיגוטה ואת blastomeres המתעוררים במהלך ריסוק. ההפסד של העוצמה הכוללת של תאים נבטיים מתחיל בשלב מאוחר morula, כאשר נוסף blastomere comminution תלוי במיקום שלהם. מוקדם מורולה blaetomers לשמור על טוטפוטנטיות, כי מניפולציות ניסיוני עם שינויים במיקום שלהם, למשל, היפוך של המיקום שלהם, לא למנוע התפתחות של עובר מלא.

נמצא כי היעילות של שחרורו של ESC בקו מושפע ממצב של blastocysts בזמן explantation שלהם. שימוש blastocysts לאחר סימולציה של שבעה ימים של דיאפאוזה בדרכי המין של עכברים, שעברו כריתה שחלות על 3.5 ימים של הריון שטופלו פרוגסטרון, תורם הפרדה מוצלחת יותר של קווי תאי גזע עובריים. ההנחה היא כי בתנאים אלה מספר blastomeres המרכיבים את המסה הסלולרית הפנימית עולה. זה אפשרי גם כי מחזור התא משתרע רוב blastomeres להיכנס לשלב G0.

יתר על כן, יצירת קווי hESC פלוריפוטנטיים יציבה תלוי עוברים הגנוטיפ: די להבחין בקלות בין קו blastocysts ESCs Murine 129, הוא משמעותי יותר קשה להשיג אותם באמצעות עכברים CS7BL / 6 וכמעט בלתי אפשרי לבודד את קו מן hESCs blastocysts CBA / Ca עכברים. ברור, עוברי מוקדם יש כמה תכונות גנטיות המשפיעים על התפתחות של קו Eur pluripotent. עם זאת, כאשר מבודדים epiblast תרבותי, כמו גם על ידי בחירה סלקטיבית מבדל שורת תאים hESCs מעוברים מוקדמים CBA / Ca עכברים עדיין הוקצו.

טכניקה סטנדרטית מוכחת להשגת קווי ESK מ blastocysts ניתנת מדריכי מעבדה על הטכניקה של הניסוי עם עוברים מוקדמים. קווים ESK ניסיוני ניתן להשיג גם על ידי culturing epiblast מבודדים (ectoderm העיקרי) של 4.5 יום עוברי עכברים עם טכניקה microsurgical מורכבים למדי ותנאי גידול השתנה. המורכבות של הליך זה מוצדקת, שכן תדירות היווצרות של קווי ESC היה הרבה יותר גבוה מאשר בעבודה עם מסת התא הפנימי של הבלסטוציסט.

כדי לבודד את קווי ESC, כל שיבוט מועבר מיקרו היטב, צבירה של 40-60 תאים גדל, הוא שוב התפזר. חזרות מרובות של הליך זה מאפשרת להשיג קו אסק הונצח עם תאי normokariotipnyh קצב התפשטות מקסימלית מצורפים הפלסטיק, אשר דרך מעברי 50-100 לשמור מפוטנציית-על ופעילות טלומרז גבוהה. בתהליך של תמיכה בקווים ESC, זיהום הסביבה או בסרום עם אנדוטוקסינים חיידקיים הוא המסוכן ביותר - אפילו ריכוזי עקבות של אנדוטוקסין במדיום התרבות לגרום מוות מסיבי של תאים נבט בוגרים. עם שליטה קפדנית של צמיחה ליניארית ואת הפיזור בזמן של ESCs בתרבות מסוגלים ביקוע סימטרי, שבו הן תאי הבת להישאר פלוריפוטנטיים ומסוגל לבצע מספר בלתי מוגבל של מחזורי תאים, שמירה על קריוטיפ דיפלואידי ואת העוצמה הכוללת.

בחירה של אוכלוסייה נקייה של ESCs אנושיים יכולה להתבצע לאחר transfection לתוך הגנום שלהם של מולקולות DNA רקומביננטי המכיל גן קידוד לסינתזה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). ביטוי GFP מגדילה עם צמיחה של ESC בתנאים התומכים התפשטות שלהם, ואילו עם הופעת בידול, את רמת הביטוי של הגן הזה מצטמצם, המאפשר בחירה של קווי תאים pluripotent יציב טהור על המדיום סלקטיבית. כאשר מעובדים עם מבחר ה- GFP של ESCs, התדירות של מושבות הוא גדל מאוד, שכן בתנאים של גידולים הבחירה אפקט antiproliferative עוצמה של תאים מובחנים הוא בוטלו.

תרגום של תאי גזע עובריים ממקור אנושי בקנה באמצעות השיטה שלהם הבידוד של העוברים preimplantation (שלב 80-120 תאים), שנותרים לאחר הליך הפריה חוץ גופית. לשם כך, העוברים "מלאכותיים" שהושגו באופן מלאכותי מופצים מכנית בסביבת דלבקו-מחט. לאחר התאים מתויגים עם נוגדנים חד שבטיים סלקטיבית עם תווית ניאון, תאים של embryoblast מבודדים. העובר הוא מפוזרים לתוך תאים בודדים באמצעות תערובת של collaspase disaspase. תאים ניתקו גודלו בינוני מיוחד (80% Delbekko בינוני + 20% בסרום עוברי עגל בנוכחות 500 .mu.g / מיליליטר של IL-6, LIF ו- SCF) על monolayer של פיברובלסטים עובריים מזינים 3 קטעים ראשונים. במקרה זה, ההישרדות וההתרבות של תאי גזע ותאים נתמכת בחשיפה ל- IL-6, LIF ו- SCF. בסביבה כזו, ESCs לגדול על ידי שיבוטים ההשעיה של תאים מגורדים unattached, אשר חייב להיות מנותק על ידי pipetting מרובים עדין. שיבוטים חדשים מופיעים בתרבות ההשעיה ביום 5 - 7. קצב הצמיחה המקסימלי של ESC מושגת על ידי דיסוציאציה חוזרת ונשנית של שיבוטים בשלב של 10-15 תאים. לאחר מכן, כל שיבוט מועבר microcell וגדל לצבירה של 40-50 תאים. ההליך חוזר על עצמו פעמים רבות במעברים, מה שמגדיל את נפח התרבות לצפיפות של 5-10 מיליון תאים לכל 6 ס"מ כוס. באמצעות כזה תומסון passaging היא הייתה מבודדת 10 שיבוטים ESCs אדם אלמוות אשר דרך מעברים 100 לשמר פעילות טלומרז גבוהה, יכולת התפשטות אינטנסיבית ומאפייני פנוטיפי עצמה כוללת מינימאלית, עם בידול בכל 350 שורות התאים מיוחדות המופקות חִיצוֹנִי, meso- - ו endoderm. דיפרנציאציה של האדם ESC התחיל (ב שינוי של המדיום, בנוסף וביטול LIF בסרום) עם קובץ מצורף התא למצע, המציין את הפיתוח של שלד התא וביטוי של קולטנים הדבקה. חשוב כי עם התפשטות בלתי מוגבלת של ESCs האדם, נשמר קריוטיפ רגיל.

השיטה השנייה של בידוד קווי ESC אנושיים מבוססת על שימוש בתאי מין ראשוניים. מחקרים ניסויים הראו כי קו תאים של האיחוד האירופי ניתן לקבל מן לוחות איברי המין של עוברים בן 12.5 של עכברים. עם זאת, במקרים אלה, את התדירות של היווצרות של שורות תאים אב היה נמוך משמעותית מאשר בניסויים עם עוברים מוקדמים. יחד עם זאת, תאי המין העיקריים של גונדות של עוברי עכברים של 13.5 יום גיל הריון הם בדרך כלל מסוגל להפוך קווים.

הקווים היציבים הראשונים של תאים אנושיים pluripotent EG נגזרו gonocytes העיקרי שבודד עובר 5-9 שבועות בן primordia המין. תאים מבודדים היו בתרבית על מצע של פיברובלסטים עובריים בעכבר המומת DMEM בינוני עם סרום עוברי, ולכך נוספו mercaptoethanol, forskolin, כמו גם גורמי גדילה אנושיים רקומביננטי (FGF ו LIF). לאחר 7-12 ימים, מושבות תאיים הופיעו בתרבות, על פי תכונות מורפולוגיות סמנים מולקולריים המתאים תאים EG האדם. לאחר צבירה, תאים אלה יצרו גופים embryoid, פיתוח נוסף של תאים מיוחדים אשר מופיעים מאפיין עבור נגזרות של כל שכבות נבט שלושה. במהלך 10-20 מעברים שורות תאים EG שמר על קריוטיפ נורמלי ולא לאבד pluripotency.

זה גם הוכיח כי ההשפעה המשולבת של LIF, קרום קשורה ו מסיסים פלדה גורמים, כמו גם TGF-b, משנה את התוכנית לפיתוח של תאים נבט העיקרי. במקום לעצור את החלוקות המיטוטיות ולהתחיל להבחין בין אווגנזה או תאי זרע, תאי המין העיקריים ממשיכים להתרבות. לאחר כמה מחזורי מיטוטי נוספים הם הופכים דומים לתאי epiblast, לאבד את המאפיינים של מבשרי תאי נבט, הופכים לתאי EG עובריים pluripotent.

כך, בשנת 1998, הקווים המונצחים של תאים מיניים ראשוניים היו מבודדים תחילה מהיסוד המיני של רקמת הנתיחה האנושית. העובר של תאי נבט האנושי העיקרי מופיעים שק החלמון בשבוע השלישי של הפיתוח, ועל השבועות 4-5th, תאים אלו נודדים לאזור של גבשושית מינית, שם הם יוצרים אוכלוסייה של gonocytes dormantnye העיקרי. במצב הלא פעיל, תאי נבט ראשוניים נשארים בניצן עד הלידה. שורות תאים נבט ראשוניים חולצו מן העוברים 5-9 שבועות בן גבשושית המין העובר לאחזר בד tempore לשעבר הנחשב בתערובת של hyaluronidase IV-V, סוג collagenase ו DNase עבור תשואה תא הגידול הכמותי והאיכותי. תאי נבט ראשיים ברקמת של גבשושית המין העובר מוקף סטרומה (המזנכימה) תאי סרטולי. מטרה פונקציונלית של תאי Sertoli היא הייצור של גורמים אנטי-אפופטוטיים (FAS ליגנד), mitogens, וסוכני אימונוסופרסיבי מגני תאי גזע מינית מן ההתקפה חיסונית על ידי הגוף. בנוסף, microenvironment של stromal של גרגר גניטלי משחק תפקיד חשוב בהתבגרות של gametes. תאי הניבט הראשוניים המבודדים בתרבות נטועות מעל שכבת המזין סטרומה מורכבת פיברובלסטים משלושה קטעים ראשונים עובריים. השילוב היעיל ביותר של mitogens מוכר כמתחם מורכב LIF, FGF ו forskolin (ממריץ היווצרות cAMP). תאים ניבטים הפצת נשק קדמוניים במבחנה דורשים תוספת של סרום עוברי, בנוכחות של gonocytes רבייה עיקרי שיבוטי תרבות מלווה את היווצרות תאים כדוריים, לא חסידים של המצע.

המכון הלאומי האמריקאי לבריאות על בסיס מסכם מידע קיים על השיטות של הקצאת קווי ESC אדם מן blastocysts נעשה מסקנה ראשונית כי ההקצאה המוצלחת של ESC היא ככל הנראה כאשר blastocysts התרבותי עם מסת תאים הפנימיים בנויה היטב (בתאי גזע: התקדמות מדעית כיווני מחקר עתידיים Nat, של בריאות ארה"ב). מנקודת מבט זו, המקור הטוב ביותר של ESCs ליצור קווים הם היום 5 הבלסטוציסט ההתפתחות האנושית, אשר ההקצאה של מסת התאים הפנימית יש להסיר בזהירות trophectoderm. מסת תאים פנימית מבודדת המורכבת בשלב זה של 30-35 תאים חייבת להיות הניצבת על פיברובלסטים עובריים בעכברי מצע, המהווה תנאי וקובע את היווצרותם של מושבות בתרבות hESCs.

ניתוח התכונות הפנוטיפיות של תאי גזע עובריים

מעניין במיוחד הוא ניתוח השוואתי interspic של תכונות פנוטיפי של ESC. נמצא כי מושבות ESC אדם - אשכולות צפופים של תאי אפיתל שטוחים, בעוד עכברי עגל Embryoid מורכבים קונצרן הרופף של תאים מעוגלים. ב ESC האדם, המדד של יחס פלזמה גרעינית נמוך יותר מאשר עכבר ESK. תאי גזע עובריים של קופים יוצרים מושבות תאים שטוחים יותר עם קצוות לא אחידים. בתחילת שיבוטים של פרימטים ESC, תאים בודדים נראים בקלות. ESC המתרבים של כל מיני בעלי החיים שנחקרו אינו מבטא מולקולות MHC של המעמד הראשון והשני. במקביל, ESCs אדם לתת תשובה חיובית נוגדנים TERA 1-60 ו GCTM-2, אשר מעיד על קיומו על קרטין השטח שלהם / proteoglycans כונדרואיטין סולפט, מאפיין של עובריים (teratomas) בתאי גזע -kartsinomnyh. הביטוי hESCs כל מיני גנים Oct4 חיות עולה כי, למרות ההבדלים פנוטיפי ב ESCs האדם והעכבר, כנראה מופעל על ידי אותה קבוצה של גנים האחראים לשמירה על מגוונת" (פרו, 2001). בנוסף, קווי ESC נגזרו חולדות עובריות, חזירים, ארנבות, פרימטים, ובקר, יש מאפייני מורפולוגיים דומים, סט דומה של זיהוי המולקולרי של סמני מנגנון מולקולרי כמעט זהה ליישום התכנית העוברת המאפשר לך להעיף מבט רענן על נושא ההשתלה שלא מבן-מינה .

בניגוד העובר נורמלי in vivo, במבחנת הפצת hESCs אינה מלווה את היווצרות שכבות נבטיות וממשיכה לחסום רקע Nohgenov הומאוטית, דהיינו, ללא organogenesis. מאז גני פילוח לא לתפקד בתרבות hESCs בלתי אפשרי לשחזר תקופות כאלה העוברת כמו פילוח somite הלשוני של הגרעין, ההיווצרות של צק חלמון, allantois איברים על תנאי ו אחרים ורקמות. ESCs התרבות הוקפאו בתחילת הקמתה של 350 שורות הגבלה של תאים מיוחדים. לפיכך, ובתאים בת לשבט PGCs המקומי מרכזי הן עובר מודל רק במהלך ההתפתחות שבו אזורי רקמות שונים נוצרים בשלב אחד שונים מתאים מיוחדים נגזרים, אולם, מן המקדמים משותפים. למרות הרמה המינימאלית של קולטנים על פני השטח של hESCs, הם שומרים את היכולת לבצע תהליכי המוךפו"גנטי שהולכים פרימיטיביים לדמות את חלק הארי של מבנה עובר המוקדם: hESCs תרחיף בתרבות אגרגטים יוצר מבנה דומה הבלסטוציסט או אפילו מאוחר יותר עובר (צילינדרי ביצה). אלה אגרגטים ההשעיה היו כראוי בשם גופים פשוטים ומורכבים.

כאשר מעורבב להתמיין לתאי הגוף השונים Embryoid הביעו בו זמנית על ידי האאקטודרם גנים מוקדם (oct3, FGF-5, קטרי), endoderm (גאטה-4), המזודרם (brachyury), המזודרם קרדיוגני (pkh-2,5), בצינור העצבי (msx3 ) ו hematopoiesis (elkf). באמצעות שילובים שונים של ציטוקינים וגורמי גדילה למיקוד היווצרות תאי שכבת נבט במבחנה בכמה מקרים ניתן היה להשיג גופים embryoid, שהתבטאו רצוי גנים האאקטודרם או המזודרם, אשר פותחת את הדרך אל הדוגמנות של gastrulation והפאזה organogenesis מוקדם.

צמיחה משובטת של hESCs עדויות של חלוקת תאי אסימטרי שבו רק אחד ESC של שיבוט המרכז שומר קיבולת רבייה שאינה מגבילה, ואילו תא הבת האחר מוליד דור ובתאים, בידול כבר מגיע. לכן, שיעור הכפל של שיבוט בפריפריה של הגוף העובר יותר גבוה מאשר במרכז. התאים השוליים של השיבוט הגדל עוברים הבחנה נפרדת ספונטנית, נודדים או מתים על ידי מנגנוני אפופטוזיס. אירועים אלה קובעים את גורלם של השיבוט אם שיעור ההתפשטות עולה על השיעור של הגירה ומות תאים אפופטוטיים, שיבוט בגדלים ממשיכים להגדיל, ייצוב מתרחש עם אפופטוזיס שווה קצב היווצרות של מהירות תא חדשה, רגרסיה - היחס ההפוך של תהליכים אלה. תאי האב מחולקים באופן סימטרי, כלומר, שני תאי הבת נבדלים עוד יותר לתוך שורות תאים מיוחדים. היחס בין תאים ESC / אב משתנה, אבל תמיד את כמות ESC הוא רק חלק קטן של אחוז האוכלוסייה בת האב. לכן, רק pipetting זהירה והתפצלות בזמן של שיבוטים יכול להגדיל את מספר ESCs בתרבות. כדי להשיג את התשואה המקסימלית של ESC, היעיל ביותר היה ההפרדה של שיבוטים בשלב של 10-12 תאים. כיוון ומידת ההבחנה בין תאים בגוף העובר תלוי במיקום שלהם. תאי גוף Embryoid חיצוניים אינם מבטאים את הגן ואת Oct4 לעבור התמיינות בתאי endoderm העיקריים שממנו כך יצרו תאי epithelioid ו endoderm הקרבי extraembryonic הקודקודית. התאים הפנימיים של הגוף העברי להביע את הגן oct4 ולשמור על pluripotency במשך 48 שעות של תרבות. אבל אז הארגון מחדש מורפולוגיים מתרחש בתרבות בשכבה האפיתל מתחילה וביטוי של גנים השולטים בהתפתחות האאקטודרם העיקרי. לאחר מכן מתחיל תהליך של cytodifferentiation הפרעה מלאה עם המראה של סוגי תאים שונים, כי הם נגזרות של כל שלושה גיליונות גרמינל. בתהליך ההתמיינות הספונטנית של התאים בגוף Embryoid להתעורר הראשון אגרגטים סמני endoderm בצורה שברה (ציסטות) צק חלמון. יתר על כן, angioblasts ותאי האנדותל של נימים גדל מופיעים מבנים אלה. בשלבים הסופיים של התמיינות ספונטנית של תאים פנימיים של הגוף Embryoid מפתחת תאים שונים נבדלים סופני, כולל נוירונים, אלמנטים גליה, שריר הלב, מאקרופאגים אריתרוציטים. בשנת קירוב מסוים (בהתחשב ההיפוך המרחבי של גיליונות להרכיב הרקמה העוברית) באמצעות גופי embryoid במבחנה יכולה לחקור תהליכים המוךפו"גנטי שהולכים ולנתח את המנגנונים המולקולריים של תקופה ראשונית cytodifferentiation העוברי, ולבסס את התפקיד של גנים ספציפיים ליישום תהליכים אלה.

לכן, בתוך שיבוט הם תאים שבהם תוכניות גנטיות שונות מתגלות - ESCs, אבות מוקדם אוכלוסיות הבדל. טיפוח ESC על ידי שיטות ירידה של ירידה או תרבות ההמונים ללא שכבת מזין וללא תוספת של LIF במדיום מוביל בהכרח להיווצרות של גופים עובריים. מורפולוגיה של תאים של השכבות החיצוניות והפנימיות של גופים העובר הוא שונה. השכבה החיצונית מורכבת מתאי תהליך גדולים. פני השטח שלהם, מול הסביבה, מכוסה microvilli רבים. השכבה החיצונית של התאים מופרדת מהקרום הבזאלי הפנימי הדומה לקרום הרייכרט, ואילו תאי השכבה הפנימית של הגופים העבריים הם אפיתל גלילי. מבחינה מורפולוגית, השכבה הפנימית, אם כי המכילה תאים רבים המפרידים, מזכירה יותר מושבות ESC לא מובחנות.

תכונות של תאי גזע עובריים אנושיים

היעדרות של אינטראקציות המזנכימה-parenchymal בבית אות רקע חסימת גנים homeosis גורם צמיחה מופרעת של PGCs בתרבות, מאז כרטיסייה זו היא שבורה האיברים על תנאי התשתית להיווצרות. צמיחה מאורגנת והבחנה ספונטנית פרועה של hESCs בתרבות בשל חוסר המזנכימה סימון מסגרת סטרומה של גופים עתידים: במבחנה אפשר ההיווצרות של המיליון hepatocytes, אבל אתה לא יכול לקבל כל פלחים של הכבד, כוללים אלמנטים מבניים ותפקודיים כאלה, כגון הסינוסים, במרחב של תאי Disse ו Kupffer.

הוא האמין כי מגוונת" של ESCs הבין בלעדי בהתפתחות העובר ליצירת רקמות ואיברים של העובר, ואילו כבל ואת השליה הטבור נגזרות trophoblast. מצ"ב קליפת trofektodermalnuyu אסק בעקביות ליצור שיבוטי תא זמניים למימוש תכנית פיתוח של mRNA קומבינטורית מטריקס הטופוגרפית בתפזורת Nohteyaov, אשר מראש את הסדר המרחבי, צורה, מידות, מספר תאים באיבר זמניים ומוחלטים והרכבת parenchyma ביחידה מבנית ותפקודית. במקביל על ESC הוא סוג התא היחיד שבו המנגנון המולקולרי של מימוש הפוטנציאלים שלהם ניתק לחלוטין מהתכנית הגנטית של פיתוח ESCOs עצמם מקופחים האפשרות של אינטראקציה עם תאים אחרים בשל חסימה של שני תפיסות קולטן ומערכות transsignalizatsii. עם זאת, תוצאות ESCs ההפעלה נאותות לידת סוף התכנית הדרגתית העובר פריסה נוצרו לחלוטין ומוכנות לחי extrauterine של אורגניזם מורכב מיליארדי תאים. בזמן הקצר הזה, אבל חוב בלתי נתפס של התרחשות בלתי נמנעת נתיב שטח הסלולר של טעויות המנגנונים המולקולריים המספקים פונקציות חיוניות של תאי, ובשנת התוכניות לשלוט ההתפשטות, הבידול וההתמחות שלהם. לכן, ב pharmacogenomics המודרנית נחשב בנפרד מחל התקנים מולקולריים, ותכנות תא מחלה. והמעש של רוב התרופות החדשות שמטרתן תיקון השם של התוכנית של בידול, פרוליפרציה organogenesis, כמו גם התחדשות של איברים ורקמות. באורגניזם הבוגר באמצעות ESCs ניתן יהיה לשלוט על התנהגות של תאי גזע / ובתאים הושתלו במוח, בכבד, בטחול, במח העצם ובאיברים אחרים של האדם לתקן איברים parenchymal הנמען ניזוק עקב תאים המזנכימה התורם בידול והתמחות השתמר מטריקס. בעיקרו של דבר, התוכנית מפוטנציית-על משיקה אחר ברמת הגנום הביצית, zygotes ו בלסטומרים, אבל תאים אלה טרם ניתן לשבט ו passaged בכמויות הדרושות לצרכי רפואה experiental ומעשי. לכן, ESC הוא מקור ייחודי של מידע גנטי המכיל את מפת הגבלה ליניארי תלת ממדי של העובר ואת הקודים של שורות תאים מתמחים במהלך gastrulation.

כמעט אפשרויות בלתי מוגבלות של רגנרטיבית ESC בשל העובדה כי הגנום שלהם, בניגוד למנגנון הגנטי של תאי סומטיים בדיל, שומר מגוונת". אחד הביטויים של מצב רדום מושרשים מידע גנטי ESCs הוא פנוטיפ מינימום שנקרא - על פני השטח של ESC להביע מספר מצומצם של קולטנים, ולכן פרוסים תוכניות מעט מאוד אינטראקציה מנגנון גרעיני transsignalizatsii של התא עם המיקרו-סביבה שלה. על הרקע של גני התרדמה אחראים ההגבלה של שורות תאים מתמחות והתמיינות של תאים, מופעל רק על 30 של 500 הגנים שמוצריהן לספק תאי תקשורת עם המיקרו-הסביבה שמסביב. באמצעות השיטה של ניתוח סדרה של ביטוי גנים הראה כי בכלליות התיבות בגנום הפונקציונלית ראש ויסות אנרגיה וחילוף חומרים בתאים הסומטיים ESCs בסכום נמוך אחרון שנקבע מאוד של mRNA של קולטנים, G-חלבונים, שליחים משניים, transcriptases, קו-פקטורי ביטוי ודיכוי , כלומר, את המערכת כולה של העברת טרנסממברני של האות הרגולטורית לתוך התא. זאת בשל חוסר או ביטוי נמוך מאוד של גנים transsanalization. במהלך הבידול המושרה בגנום של מבצע ESC 18 הוא הפסיק לתפקד גני סינכרוני עבור גן רקע ההפעלה transsignalizatsii 61 שליטה בסינתזה של קולטנים הידבקות תא, רכיבים תאים מטריקס, הגבלת transcriptases אלמנטי messendzhernyh ומערכת העברת אותות עבור יחידה גרעינית עם קולטנים קרום תא הפלזמה. במקביל חסמו ביטוי גנים האחראים לסינתזה של חלבונים משתיקי, כמו גם ביטוי גנים koingibitorov מתן hESCs בגנום מפוטנציית-על.

סמנים גנטיים נמצאו עבור תאי כל שלושת העלונים. זיהוי שכבת ectodermal תא הנישא על ביטוי גני קטרים, oct3 ו FGF-5, תאי mesodermal - הגן brachyury, זטה-גלובין, endoderm - על ביטוי גני גאטה-4. בהתפתחות העובר נורמלי, במהלך gastrulation נצפתה הגירה פעיל של אוכלוסיות בוגרות של תאי גזע ובתאים, מקומי ייעוד אזורים של עצמות הפנים של הגולגולת, בחלקים מסוימים של המוח, מערכת העצבים ההיקפית, מערכת ההולכה של הלב ורקמות התימוס אשר נוצרות מן שיבוטים שנעקרו תאים. תיוג מוקדם גני התא ניבטו שכבות מקלים על ניתוח טופוגרפי של גירה של ובתאים בעובר המתפתח. הוא נמצא בעיקר כי התאים ביטוי P19 אגרגטים embryocarcinoma של brachyury המזודרם הגן הראשון מתחיל במהלך הפחתה של ביטוי גנים של מפעיל פלסמינוגן רקמות, א-fetoprotein, קרטין 8, קרטין 19, שהם סמנים של אוכלוסיות נודדות מוקדם המזודרם. כתוצאה מכך, ההיווצרות של רקמות ממקור mesodermal מתחילה רק לאחר התהליך של ובתאים mesodermal הגירה ויישוב נקודה.

עם תכונות פנוטיפי מוגבלת מאוד בהעדר רוב חוסם transsignalizatsii ESC בכל זאת להביע כמה מולקולות קולטן שיכול לשמש כדי לזהות אותם. ראוי לציין כי אנטיגנים הם סמנים של ESC בבני אדם וקופים היו נפוצים. משמש לרוב עבור hESCs תיוג שכותרתו נוגדנים לאנטיגנים membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (אנטיגנים השומנים ייחודיים המייצגים GL7 glycolipid מורכבים עם חומצה sialic), כמו גם גליקופרוטאינים פולימר גבוה TRA-1-81, TRA-1-60. יתר על כן, hESCs להביע SSEA-1 אנטיגן עוברי ספציפי phosphatase אלקליין אנדוגניים, כמו גם גורם שעתוק ספציפי Oct4. זה האחרון נדרש לצורך שמירה מנגנוני התפשטות hESCs - גורם שעתוק גנים ספציפיים Oct4 להפעלה של ביטוי גנים גורם 4 צמיחה פיברובלסטים ומייצב איגרוף אחראי שאינם מגבילים DNA בהכפלה בתאים בשלה. החלבונים סמן תאיים החשובים ביותר הם Oct3, Oct4, Tcf ו גראוצ'ו, הקשורים חלבונים של משתיקי הכרומטין.

כמעט מייד לאחר ניסיונות ESCs המתורבתים ארוך טווח, נכשלת האורגניזם הוכן לראשונה על ידי התרבות של תאי גזע שבודדו blastocysts עכבר, ותרבות תא ניבט ראשוני, התחיל שלב מחקרי קיבולת ESC מגוונת" כאשר מנוהלים בשלבים המוקדמים של התפתחות עוברת. זה היה הראה כי בחלק מורולה ו PGCs הבלסטוציסט מסוגל ליצור עבר chimeric שבו צאצאי PGCs התורם זוהו בכל הרקמות סומטיות ואפילו גמטות. לפיכך, בביולוגיה התפתחותית באמצעות ESC scripting "גשר" בין מחקרי ניסויי in vivo ו- in vitro, אשר גדיל משמעותי את האפשרות ללמוד תהליכי סימניות עיקריות רקמות ואיברים, הבידול שלהם organogenesis העוברי.

היא מבוססת היטב כי in vivo במהלך עובר אסק משולב תאי מסה של עובר המוקדם, ונגזרותיהם נמצא כל האיברים והרקמות. ESCs ליישב בעובר chimeric שורה של תאי מין, צאצאי אשר מהווים ביצים מלא זרעונים. תאי גזע עובריים הם clonogenic - היחיד PGCs יכול ליצור זהים גנטיים מושבה של תאים עם סמנים מולקולריים, הכוללים ביטוי גני Oct4 ו phosphatase אלקליין, פעילות טלומרז גבוהה, כמו גם ביטוי של אנטיגנים עובריים ספציפיים.

כדי לחקור את המנגנונים של העובר באמצעות טכניקה של מורולה hESCs chimerization ידי יצירת מבנה ביולוגי, הנמצא מחוץ בלסטומרים tetraploid שכבת PGCs הנמען התורם מנוהלות לתוך. לפיכך, trophoblast נוצר צאצאי tetraploid בלסטומרים הנמען המאפשרת ההשתלה placentation, ו PGCs התורם מתנהג כמו מסת התאים הפנימית, אשר נוצר מקו נבט קיימא של גמטות הגוף ובתאים העיקרי. מחקר ESC ערך טמון לא רק כי, כאשר מניפולציה במבחנה עם הגנום שלהם נשמרת מגוונת", אלא גם בעובדה תוך שמירה היכולת להשתתף היווצרות תאי נבט בראשיתי hESCs של העובר chimeric. ממחקר עולה כי רק צאצא אחד של PGCs המהונדס גנטי ליישב כל העיקריים והחיידקים להרכיב עובר כימרי בד מתקבל על ידי צבירה או coculture של התאים עם עובר 8 תאים. כאשר הושתל ESCs עכברי מורולה טרנספקציה עם גן חלבון פלואורסצנטי ירוק, צאצאי פלורסנט של התאים נמצאו בכל הרקמות חקרו של העובר המתפתח (Shimada, 1999). השתלת ESC ב מורולה יכולה ליצור עכברי קיימא, הגוף אשר מורכב אך ורק של צאצאים תרמו את ESC, אשר פותח הזדמנויות עבור מגוון רחב של אפשרויות שיבוט רפואיות. עכשיו וגישה שיטתית כזו יושמה בהצלחה ללמוד את הבעיות של הביולוגיה ההתפתחותית, בפרט, הוא יכול לנתח את המנגנונים הגנטיים של איון של כרומוזום X או חוסר יציבות אפיגנטית של hESCs. השתלת ESC לתוך העובר מוקדם משמש גם ביוטכנולוגיה בחקלאות, כמו גם בניסויים טיפול גנטי.

השתלות של ESCs מהונדסים גנטית משמשים לבדיקת תאי המטרה של גנים מוטנטיים. מטופח ECS במבחנה משמשים בביוטכנולוגיה ליצור עכברים נוקאאוט. כדי לעשות זאת, על ידי recombination הומולוגיים, הגן להיבדק מוסר מן ESC, ואת התאים חסרים גן מבודד על מדיה סלקטיבית. ואז ESCs נוקאוט מוזרקים לתוך blastocyst או מצטבר עם blastomeres של morula. ובכך עובר מוקדם כימרי שהושג מושתלים לתוך נקבת נמען יילוד עכברים נבחרים בקרב אנשים עם גמטות, nullizigotnymi של הגן הזה. עם טכנולוגיה זו, שורות רבות של עכברים נוקאאוט נוצרו, אשר נמצאים בשימוש נרחב ביולוגיה ניסיונית הרפואה הניסויית. במודלים ביולוגיים אלה נחקרת חשיבותם של גנים מסוימים בהתפתחות עובריים, כמו גם תפקידם במנגנונים של מחלות ומצבים פתולוגיים של האדם. בנוסף, השורות של חיות נוקאוט משמשים בשלב בדיקות פרה קליני של שיטות חדשות של טיפול גנטי. לדוגמה, באמצעות transfection הגן אלל נורמלי לאסק את הגן המוטנטי לנהל תיקן מוטציה ביעילות, מכה במערכת hemopoietic. מבוא של גנים זרים לתוך ESC מאפשר יצירת שורות של חיות מעבדה הומוזיגיים מהונדס בקצב מואץ. עם זאת, יש לציין כי הטכניקה של מחיקת רקומבינציה מכוונת של הגנים כבר עובד באופן אמין לעת עתה רק לגבי ESC של עכברים. שימוש ESCs בעכברי בנוקאאוט כפול מותקן אשכול אזור תפקיד פונקציונלי של גנים על כרומוזום 7 (עותק באזור גנומי 19 דקות אנושיות כרומוזום), ואת החלק הפרוקסימלי של כרומוזום 11 (להעתיק כרומוזום אנושי 5D) - מחיקה גנים אלה עכברים ESK מותר להעריך את הפונקציה של האנלוגים שלהם בבני אדם.

מחקרי פונקצית הקיבולת של גנים עובריים אנושיים, transfection ב גן אשר חיות מעבדה מותרות hESCs ב הצפנה בפרט להבהיר את תפקידו של הגן בלשונית ומגבשות את המזודרם קרדיוגני, גן pax-6 - ב עין עובר. מהווה את הביטוי הראשון של גנים ב teratocarcinoma ESC כרטיס מתרבים בשלה ועכברים הבלסטוציסט אשרו דיכוי מכריע בגני transsignalizatsii אסק. השילוב של ESCs מוטצית 60-80 ו 20-30 תאים של עוברי עכברים טרום השרשה נורמליות מוביל להתפתחות של עבר chimeric שבו סימניות גופים מורכבים תאים תורמים ומקבל, המאפשרת לנו לקבוע את התפקיד של גנים ידועים gastrulation ו organogenesis. המפה פונקציונלית של עוברי עכברי פיתוח גני פרטים מוגדלים של תפקיד כרטיסיית SF-1 גן בבלוטת יותרת הכליה ו primordia גניטלי, גן WT-1 - בגני מש' כליות הכרטיסייה Myod - בלשונית של גנים מהמשפחה שרירי שלד גאטה-1-4 - בתהליך הבשלת ההגבלה יסודות של אריתרו ולימפויזיס.

בימוי הנחה של אללים אימהי ואבהי של גנים ב hESCs באמצעות וקטור recombinase שימש כדי להבהיר את הפונקציות של גנים שונים במהלך העובר והטכנולוגיה מוקדם מיקוד של הגנים האנושיים ידוע ESCs העכבר לתרום לגילוי של גנים מוטנטיים חדש האחראי על התפתחות של מחלות תורשתיות חמורות. שיטת נוקאאוט שימוש מוגדר משמעות לחייב של כמה גנים להנחת רקמות עובריות: גאטה-4 - לאוטם, גאטה-1 - כדי erythroid רקמות hemopoietic, Myod - שרירי השלד, brachyury - עבור הגבלה המזודרם transcriptases hnf3 ו hnf4 - עבור תאי גזע כבד, סמרטוט-2 - סימניות עבור שיבוטים של T ו לימפוציטים מסוג B (רפין, 2001). מחיקה זוגית של גנים ב hESCs פתחה גישה ללימוד התפקיד הפונקציונלי של גנים של שכבות הנבטיות, הפילוח homeosis והשתלות ESC לנוכח האפשרות של השגת עוברים היברידיים interspecific קיימא. עם שיטות משופרות של השתלת PGCs התורם בעובר 8-תא בודד מוכח chimerization כי ברמה התאית של איברים רבים של העובר המקבל. שים לב ניבטי תא נמצאים איברי עכברי נמען אנושיים רקמות לאחר מתן תאי גזע hematopoietic אדם לתוך בלסטוציסט. נמצא כי בשנת עוברי עכברים במהלך ההיווצרות של גופי הדם במחזור hESCs pluripotent. זה אפשרי כי תפקודם הביולוגי הוא בארגון עובריים של מערכת החיסון בעתיד. עם ESC במבחנה לשכפל מודלים נאותים של מחלה גנטית אנושית: גן בדיסטרופין מודלים בנוקאאוט כפול בעכברים של ניוון שרירים דושנו, גן ATM כיבוי (הכרומטין קינאז סנתז אותות שלט) - אטקסיה-teleangektaziyu. במקרה זה, מחלה תורשתית קטלנית בילדים בשל פגמים תיקון DNA מפתחת ניוון של תאי פורקינג במוח הקטן, אשר מלווה לפוף של התימוס עקב מות התאים מתרבים. קליניקה, פתופיזיולוגיה patomorfologija אטקסיה-teleangek- tazii לשכפל באמצעות ההתוודעות אל המידע הגנטי הנורמלי ESC מן מפלצות עכברים מתאימים לאלו בבני אדם. יתרה מזאת אטקסיה-teleangektazii באמצעות PGCs ועכברים בנוקאאוט פתח מודל הניסיון, כמה מחל אנושיויות הומוזיגוטיים תורשתיות קשורות להפרעות פחמימות וחילוף חומרי שומנים, פירוק של חומצות אמינו, הסרת הנחושת בילירובין, אשר גדיל משמעותי את האפשרות של רפואה ניסיונית בניסויים פרה-קליניים של שיטות חדשות לטיפול במחלות רלוונטיות אדם.

[12], [13], [14], [15]

השימוש cytohybrid תא גזע

תאי הכלאיים מתקבלים על ידי פיוזינג תאי סומטיים מ hESCs, הם מודל נאות מבטיח לחקר תאי גזע מגוונת" ו תכנות מחדש של כרומוזומים בתא בדיל. Tsitogibridy מתקבל על ידי המיזוג של ESC עם תאים מובחנים של החיה הבוגרת, מספק הזדמנות ללמוד את הקשר בין הגנום של "גילים" שונים: מפתח מצב ייחודי שבו כרומוזומים ההומולוגיים שמקורם בתאים של שלבים שונים של בידול, ודרגות שונות של בגרות, נמצא באותה הגרעין, שם הם יכולים בקלות transdeystvuyuschimi לשתף אותות רגולטוריים. קשה לחזות כיצד יגיב tsisregulyatornye מערכת אפיגנטיים של כרומוזומים הומולוגיים קיימת במהלך yn פיתוח dividual, בתגובה לאותות transdeystvuyuschih השפעה מן הגנום קשור עוברי. יתר על כן, בתאים ההיברידיים מתרחשת פרדה של כרומוזום הורי המאפשרת לחקור את האינטראקציה של הגנום ברמת כרומוזום נפרדת, דהיינו, פוטנציאל לזהות את החלק של כרומוזומים מסוימים התחזוקה של מגוונת", או להיפך, פלט בידול.

כמו המודל הניסיוני הראשון לחקר האינטראקציה של הגנום של "היסטוריה של פיתוח" שונה המשמש שהושג tsitogibridy ידי מיזוג teratokartsinomnyh פלוריפוטנטיים ו תאי סומטיים בדיל. במקרים מסוימים, תאים היברידיים כאלה שמרו על תכונות pluripotent ברמה גבוהה מספיק. בפרט, היברידי סומטיים vivo ב-תאי teratokartsinomno היו מושרה התפתחות teratomas נכון המכילים נגזרות של כל השלוש השכבות הניבטות, A במבחנה ב בתרבויות השעיה יצרו גופי embryoid. גם בסוג זה של interspecies tsitogibridov ציין את נוכחותו של אנטיגנים העובר במקרים בהם שותף סומטיים המיזוג עם תאים teratocarcinoma היו לימפוציטים או thymocytes. ראוי לציין כי cyto-hybrids שנוצרו על ידי היתוך של תאים teratocarcinoma עם fibroblasts תואמת fibroblasts על פי פנוטיפ.

החשוב ביותר הוא כי בבחינת עובדה מוגמרת כי-teratokartsinomno תאי סומטיים היברידי הופיעו סימני תכנות מחדש הגנום של תאים מובחנים, המאופיינת מחדש של גנים בודדים או שותף סומטיים כרומוזום X הפעיל. לפיכך, התוצאות של מחקר על תאי סוג tsitogibridah teratokartsinomno-סומטיות עולה כי תאי כלאיים קרובות שמרו מגוונת" ו תכנות מחדש של הגנום, ישנם סימנים של השותף סומטי.

בניסויים להשיג תאים עובריים היברידיים intraspecific ידי פיוזינג splenocytes עם חית בוגרת ESCs העכבר למד מאפיינים כגון tsitogibridov, ניתוח פרדה של הכרומוזומים הורים בגנום היברידי מגוונת" העריך. עבור התא ההיברידי interspecific המיוצר על ידי תאי teratocarcinoma היתוך עם תאים סומטיים, מאופיין בדרך כלל על ידי הפרדה נמוכה של כרומוזומים עם קריוטיפ tetraploid או כמעט tetraploid. הרכב כרומוזומלי דומה נצפה ב- cytohybrid על ידי מיזוג של תאי מין ראשוניים עם לימפוציטים. במקביל, התא ההיברידי interspecific שהושג כתוצאה ממיזוג מינק teratokartsinomnyh תא העכבר הלימפוציטים, חל הפרדה אינטנסיבית של הכרומוזומים שותף סומטי.

שלב חדש איכותי בחקר הפרדה של הכרומוזומים הוריים כלאי interspecific בא לאחר הפיתוח של שיטת ניתוח microsatellite באמצעות תגובת השרשרת של פולימראז, לפיה כל כרומוזום עכבר נמצא כמה מאה סמנים, המאפשר להיפלות באופן מהימן בין כל זוג כרומוזומים הומולוגיים בתאים ההיברידיים.

באמצעות מיזוג אסק (באמצעות HM-1 תאים לקויים בפעילות gipoksantinfosforiboziltransferazy, 2n = 40, XY, מבודדים מן זן blastocysts עכבר 129 / 01a) עם splenocytes מעכברי congenic קו DD / C הצליח לקבל את הסט של שיבוטים היברידיים היה מורפולוגית דמיון כדי hESCs. כל השיבוטים בודדו על מצע סלקטיבי, שבו הצמיחה אפשרית רק עם gipoksantinfosforiboziltransferazoy התא הפעיל. ניתוח Electrophoretic חשף את נוכחותם של כל הכפילים וריאנט אללים gipoksantinfosforiboziltransferazy מאפיין עכברים DD / C. באמצעות ניתוח ציטוגנטית, נמצא כי ארבעה היו שלושה שיבוטים היברידיים okolodiploidny להגדיר הכרומוזומים. אחת ליד-tetraploid שיבוט הכיל שתי אוכלוסיות של תאים היברידיים, שאחד מהם היו tetraploid, והשני, הקטן יותר - דיפלואידי.

ניתוח של microsatellite המאפשר להפלות כל זוג כרומוזומים הומולוגיים העכבר 129 / 01a ו- DD / C, ב השיבוטים ההיברידיים עם סט okolodiploidnym הראה כי שיבוטים אירעו שני שותפים סומטיים אוטוזומים חיסול מועדף ברורים. רוב שיבוטי אוטוזומלית HESS2 ו HESS3 היה סמני קו 129 / 01a, כלומר, שותף פלוריפוטנטיים. החריג היה כרומוזום 1 ואני: שיבוטים HESS2 ו HESS3, יחד עם סמנים של תאי HM-1, מספר קטן של סמני נוכחים שותף סומטי. תוצאות אלה עשויות לשקף הפרדה חלקית של כרומוזומים 1 ו ושותף סומטיים עולות בקנה אחד עם נתונים ציטוגנטית כי טריזומיה של כרומוזום המתרחשת 30-40% HESS2 ו שיבוטי תא HESS3. HESS4 שיבוט שונה באופן משמעותי בהרכב כרומוזומליות: אוטוזומים רבים שיבוט זה מקורו בגנום אסק (כרומוזומים 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 ו 17), אבל כרומוזומים 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 ו -19 היו מיוצגים על ידי הומולוגים של שני ההורים. היחס הכמותי של סמני microsatellite כרומוזומים ההומולוגיים אלה התאימו בערך 1: 1. זה מותר המחברים להציע כי homolog אחד נגזר בגנום של ESC והשני - מתאי הבדיל. בחלק subclones של שיבוט HESS4 ציין האסימון רק נוכחות של כרומוזומים 18 ו 19 שותף סומטי. תוצאות המחקר מראות כי תאים לשבט HESS4, בנוסף הפרדה של הכרומוזומים שותף סומטיים, היה חיסול של אחד או שניהם homologs של הגנום פלוריפוטנטיים כרומוזום לעיל, כלומר, חלה הפרדה דו-צדדית של הכרומוזומים של שני ההורים - תופעה יוצאת דופן למדי, משום tsitogibridov הפרדה מאפיין של כרומוזומים בלבד אחד ההורים.

בנוסף, לאחר המעבר ה -20, כל שיבוטים של תאים היברידיים הכילו רק X סמנים כרומוזום של השותף הסומטי, כלומר, שיבוטים, X כרומוזום של ESC הוחלף X כרומוזום של השותף הסומטי. זה אושר על ידי הנתונים הכלאה באתרו באמצעות בדיקה FITC שכותרתו ספציפי עבור X- כרומוזום העכבר: אות חיובי זוהה רק על כרומוזום אחד. יש לציין כי בשלבים מוקדמים יותר של עיבוד (עד המעבר ה -15), על פי נתונים ציטוגנטיים, בתאים רבים היו שני כרומוזומי X. כתוצאה מכך, השימוש בתקשורת סלקטיבית מאפשר לתפעל את ההרכב הכרומוזומלי של תאים היברידיים ולכוון באופן סלקטיבי שיבוטים הנושאים כרומוזומים בודדים של השותף הסומטי על רקע הגנום של ESC.

כתוצאת תכונה ייחודית של הגנום tsitogibridov היא הלוקליזציה של הגנום הורי ליבה אחת, כמובן, מעלה את השאלה של שמירה על המאפיינים של כלאי תא ESC-סומטיות הגנום עוברי פלוריפוטנטיים בתנאים של קשר הדוק עם הגנום של תאים מובחנים. מבחינה מורפולוגית הציטוהיבריד של ESC ותאים סומטיים דומים לקו ההורים של ESC. מגוונת" ההכשרה הראה כי כל שיבוטי okolodiploidnym להגדיר הכרומוזומים הצליחו ליצור בתרבויות השעיה של גופי embryoid שבו הנגזרים של השכבות ניבטו השלוש נוכחיים.

רוב התאים ההיברידיים הכילו את האנטגן ECMA-7, סמן האופייני לעוברים מוקדמים של עכברים, וכן הייתה פעילות גבוהה של פוספטאז אלקליני. הנתונים המשכנעים ביותר על המאפיינים pluripotent גבוהה של תאים היברידיים התקבלו בניסויים כדי להשיג סדרה של chimeras הזרקת מעורבים תאים היברידיים של HESS2 שיבוט. ניתוח של סמנים ביוכימיים הראה כי צאצאי תאים היברידיים התורם היו ברוב רקמות הכימרה. לכן, תאים היברידיים המתקבלים על ידי היתוך של ESC ותאים מובחנים סומטיים לשמור pluripotency ברמה גבוהה, כולל היכולת ליצור chimeras כאשר מוכנס לתוך חלל בלסטוציסט.

שיבוטים HESS2 ו- HESS4 נבדלו באופן משמעותי בהרכב הכרומוזומים ההורים, אך היו להם תכונות pluripotent דומים. אפשר היה להאמין שהגורילות הגנומית ההיברידית מתבטאת בתכונה דומיננטית, אך ייתכן שלא כל הכרומוזומים של הגנום העוברי מעורבים בתהליך של שמירה על יכולת הריפוי. אם הנחה זו נכונה, ניתן לצפות כי חיסול של כמה כרומוזומים של השותף pluripotent מן הגנום היברידומה לא ילווה שינוי במעמד שלהם pluripentent. במקרה זה, ניתוח ההפרדה בין הכרומוזומים ההורים בתאים היברידיים עובריים יאפשר גישה קרובה לזיהוי הכרומוזומים האחראים לשליטה על יכולת הריפוי של תאים עובריים.

סרוב O. Et al (2001) מצאו בקרב צאצאיהם 50 המתקבל צלבים של מפלצות עם עכברים נורמליים, מאלה שהיו להם העכברים הגנוטיפ 129 / 01a, וביצוע העכברים כרומוזום X DD. המחברים רואים את הסיבה לכך בהפחתת pluripotency בתאים היברידיים תחת השפעת הגנום הסומטי. הסבר חלופי עשוי להיות ההשפעה השלילית של טריזומיה על כמה אוטוזומים וחוסר איזון בכרומוזומי מין (XXY נצפו בתאים לפני המעבר ה -15) בתאים היברידיים כאשר הם עברו את המיוזה. זה ידוע כי תאים של XXY לא יכול לעבור דרך המיוזה טופס gametes. טריזומיה גם מסוגלת לגרום לירידה בפעילות התרבית של תאים היברידיים, וכתוצאה מכך היתרון הסלקטיבי בהתפתחות של כימרות יכול להיות שייך לתאי העובר הנמען. מכאן נובע כי כדי להעריך כראוי את הפוטנציאל pluripotent של תאים היברידיים, יש צורך להשיג שיבוטים היברידית עם קבוצה דיפלואידי רגיל של כרומוזומים.

בניסויים Serova O. Et al (2001) הראשון הדגים את האפשרות של תכנות מחדש של כרומוזום X בגנום של תא היברידי תא סומטי. מסקנה זו נובעת המחברים לנתח את הביטוי של מפלצות גן hprt (סמן X-כרומוזום): הנוכחות של אללים וריאנטים hprt DD / C עכברים התגלו בכל הרקמות מנותחות כימרי. יודגש כי לאחר כניסתה של תאים היברידיים בחלל הבלסטוציסט tsitogibridy לנפול בתנאים הלא סלקטיבי והשימור של כרומוזום X בגנום של תאי כלאיים שאומר שזה הפך למרכיב לחייב של הגנום שלו ואינו מפלה בינו לבין השותף פלוריפוטנטיים כרומוזום Y.

מסכם את תוצאות הניתוח של האינטראקציה של גנומים סומטיים ו pluripotent בתאי עובריים היברידיים, המחברים מסיקים כי כמה cytohybrids pluripotency מתבטא תכונה דומיננטית. גנום היברידי מסוגל לתכנת מחדש כרומוזומים בודדים של תאים מובחנים, אשר, עם זאת, אינו שולל את האפשרות של ההשפעה הפוכה של הגנום הסומטי על יכולתו של הגנום העוברי. בטיפוח של תאים היברידיים, אינדוקציה של בידול מתרחשת הרבה יותר מאשר בקו ההורה המקורי של ESC NM-1. השפעה דומה נצפתה ביצירת מושבות ראשוניות: מושבות ראשוניות רבות של תאים היברידיים עובריים להבדיל בשלבים המוקדמים של היווצרות עם הפסדים גדולים של שיבוטים במהלך הבחירה שלהם וכפל.

לפיכך, cytohybrides שנוצרו על ידי היתוך של ESCs עם תאים סומטיים, למרות קשר קרוב עם הגנום של תאים מובחנים, לשמר pluripotency כמאפיין ייחודי של הגנום העוברי. יתר על כן, בתאים היברידיים כאלה, ניתן לתכנת מחדש את הכרומוזומים הפרטניים שמקורם בתאים מפוזרים. עדיין לא ברור עד כמה המאפיינים הממשיים של הגנום העוברי בתאים היברידיים נמשכים, ובמיוחד ביכולתם להשתתף בהיווצרות מסלול עוברי בכימרא. לשם כך, יש צורך להשיג תאים היברידיים עובריים עם קריוטיפ רגיל. בכל מקרה, תאים היברידיים pluripotent עובריים יכולים להפוך מודל גנטי אמיתי לזיהוי הכרומוזומים המעורבים בשמירה על שימור או שליטה שלה, שכן הפרדה דו צדדית של הכרומוזומים ההורים פוטנציאלית מספקת הזדמנות כזו.

לא פחות מושך הוא המחקר של התופעה, אשר א 'סרוב ושותפים (2001) מגדירים כ"זיכרון כרומוזומלי ". בגנום ההיברידית כרומוזומים הומולוגיים הם בשתי תצורות חלופיות: תנאיהם שותף סומטיים פעם בידול עבר, ואילו שותף homologs פלוריפוטנטיים, התהליך הזה רק מתחיל. לכן, שמירה על מאפיינים פלוריפוטנטיים גבוהים של תאים היברידיים עולה כי "פלוריפוטנטיים" תנאיהם תצורה ESC יציבים למדי הגנומים היברידי, למרות ההשפעה של גורמי transdeystvuyuschih הנובעת שותף סומטי. התכונות המתוארות לעיל של הכרומוזומים בגנום הומולוגיים הבדיל תכנות מחדש במהלך הפיתוח של מפלצות לא שולל את האפשרות כי בשלבים הראשונים של היווצרות במבחנה culturing tsitogibridov הם משמרים את מעמדם שלהם שנרכשו במהלך בידול in vivo. על פי נתונים אחרונים, בעת העברת התא ההיברידי העוברי במדיום הלא סלקטיבי שבו קיים הכרומוזומים חיסול אינטנסיבי רק שותף סומטיים, למשל, את הגנום של תאי כלאי מפלת homologs בקלות אחרי התרבות במבחנה 10-15 קטעים. לכן, תאים היברידיים עובריים מייצגים מודל ניסיוני מבטיח לחקר לא רק נכס בסיסי כזה של הגנום העוברי כמו pluripotency, אלא גם חלופות שלה - בידול עוברי.

יעילות טיפולית של השתלת תאי גזע עובריים

לפני ניתוח היעילות הטיפולית של השתלת ESC ונגזרותיהם, אנו מסכמים את החומר הנ"ל. תכונות ESC מבחינת היישום המלא של עובר במבחנה אינן מספיקות בשל פגמים במקרה זה בשל היעדר תאי גזע mesenchymal המתרחשים בגוף באופן אוטונומי עצמאי מן hESCs. העוצמה הגנטית של ESC נמוכה מהפוטנציאל הגנטי של הזיגוטה, ולכן היא אינה מיושמת ישירות לשיבוט העוברים. הפוטנציאל הביולוגי הייחודי של ESC כתאים היחידים שבהם תוכניות הפיתוח נפרסות ברצף מלא נמצא במחקרים על תפקוד הגנים. בעזרת ESC, השילובים הראשונים של אותות המפעילים את הביטוי של גנים מוקדמים ומאוחרים קידוד הפיתוח של שלושה גיליונות עובריים מפוענחים. שימור בגנום מגוונת" של ESCs במבחנה גורם להם כלי ייחודי עבור התחדשות תיקון שיכול לפצות אוטומטית להפסדי התא ניזוק איברים ורקמות. בשנת התגלמות היפותטית אידיאלית ניתן להניח כי "... על השתלת PGCs תורם באורגניזם הנמען מועברים תוכניות ארוזות בצורה מרוכזת כי בתנאים נוחים ממומשות בניית tkani'7 חדש המסוגלת" ... משולב ביעילות לתוך הגוף של הנמען כפי מורפולוגיים, הן פונקציונליים והן פונקציונליים ".

באופן טבעי, בעקבות התפתחות שיטות monodifferentiation של ESC, במחקר vivo של הפעילות הפונקציונלית של תאים שהושגו במבחנה מתוך שיבוט יחיד יחיד החל. שיבוט ESO מתרבים מייצר אוכלוסיות של תאים אב נודדים, כי הם באמת מסוגלים להשתלב באופן פעיל לתוך אזורי נזק רקמות של הנמען, אשר משמש ברפואה פלסטית משובי. זה כבר הוכיחו כי השתלת של נוירונים Dopa ב nigra מהותית מקטין את הביטויים הקליניים של hemiparkinsonianian ניסיוני. השתלות אזוריות של תאי גזע עצביים תורמים מקטינים את מידת ההפרעות המוטוריות הנגרמות על ידי טראומה או חדירה של חוט השדרה והמוח. קיבל את התוצאות החיוביות הראשונות של השתלת תאי גזע במחלות demyelinating. זה נראה כי regenerative- כוח פלסטי של ESCs לפתוח אפשרויות בלתי מוגבלות לשימוש השתלת תאים ברפואה מעשית. עם זאת, כאשר ההשתלה לתוך אזורים ectopic, ESCs להפוך בהכרח לגידולים. כאשר הזרקת תת עורית של ESC ב teratomas עכברים immunodeficient נוצרים. כאשר ההשעיה ESK מושתלת תחת הקפסולה של testis בעכברים סיניגניים, טרטומה נוצרת גם, המורכב רקמות שונות, תאים אשר נגזרים מכל שלושת העלונים עובריים. ב טרטומות כאלה, תהליכי אורגנוזה מופחתת הם נדירים ביותר.

מספר עבודות מספק מידע על תוצאות חיוביות של השתלת נגזרות מוקדמות של ESCOs לבעלי חיים עם הפתולוגיה לשעבר perimental. Neurotransplantation סלולרי באמצעות נגזרות של PGCs מפותחת נוספת בניסוי ואת הניסויים הקליניים הראשונים על תיקון של הפרעות תפקודיות במוח וטראומה חוט השדרה, טיפול syringomyelia וטרשת נפוצה (רפין, 2001). עם כניסתו של ESCs neyronogeneza טכנולוגיה במבחנה, במקום להשתמש בטכניקות השתלת רקמת מוח embryonal שפותחו נגזר של neurospheres, שהושגו מתרבויות של רקמה עצבית עוברית. השתלות השתלה כאלה הרבה יותר הומוגניות ומכילות מבשרי נוירונים ונוירוגליה.

בנוסף המדיום תרבות קבוע עם חומצה רטינואית במינון של 10 מיקרוגרם / מ"ל עבור 6 שבועות בקווים עובריים (teratomas) NTERA-2 -kartsinomy האנושי שנוצר מעל 80% של נוירונים פוסט-המיטוטי. ההומוגניות המוחלטת של האוכלוסייה העצבית מושגת על ידי זרימת מיון שכותרתו סמני immunophenotypic של נוירונים בוגרים שיכול להיפטר מהשרידים teratokartsinomnyh ותאיים בשלה. לאחר השתלת לאזורים שונים של המוח של חיות הניסוי, נוירונים כאלה לא רק לשרוד, אלא גם מובנים רשתות עצביות אזוריות. אצל בעלי חיים עם מודלים ניסיוניים של פגמים מקומיים CNS neurotransplantation מפחית קליני של פתולוגיה אנושית כגון שפעות טראומת craniocerebral, שבץ, מחלות demyelinating, ליקויים בהתפתחות מוח קטנים תורשתיים, בתצהיר מחלות של שומני סוכרים.

כדי לייעל את תהליכי התחדשות במחלות ניווניות של מערכת העצבים המרכזית, מתפתחות טכנולוגיות להכנת oligodendrocytes myelin מ - ESK. השלב הראשון באופן מסורתי כרוך בשגשוג של ESCs עם הכפלת מספר התאים הדרושים להשתלה. בשלב השני, הבידול המכוון של תאים לתוך אוכלוסייה של מבשרי mylegin מייצרים oligodendrocyte מתבצעת, אשר נשלט על ידי אנטיגנים סמן סלקטיבי.

הסיכויים מסוימים נפתחו עבור ESCs נגזרים שימוש כדי לפתח שיטות לתיקון הכשל החיסוני הנגרם על ידי פגמים גנטיים בתהליך ההבשלה של התימוס. במחקרים ב בנוקאאוט (סמרטוט 1) עכברים עם פגם גנטי מושרה - V מנגנון רקומבינציה הפרה (D) לוקוסי גן J TCR, שמוביל לאובדן תפקוד של לימפוציטים מסוג T, נגזר מוקדם השתלת PGCs ב חית התימוס משחזר בשלים של אוכלוסיות נורמליות של שיבוטי חיסון אחראים חסינות סלולרית. ניסויים קליניים של השתלות מתבצעות ב hESCs במבחנה לטיפול באנמיה תורשתית קטלנית בילדים.

התנגדויות להכנסה מהירה של השתלת תאי גזע למרפאה מוצדקות על ידי מספר מצומצם של קווים יציבים של תאי גזע עובריים אנושיים והצורך בהתקנה שלהם. כדי להגדיל את הטוהר של קווים ESC סטנדרטיים, כמו גם תאי גזע בוגרים, שיטה של בחירה קו מבוסס על ניתוח גנטי מולקולרי של חוזרות טנדם קצר של DNA הוא הציע. זה גם הכרחי כדי לבדוק את הקווים ESC לנוכחות של סידורים כרומוזומליים קטנים מוטציות גנטיות, האפשרות הפוטנציאלית של התרחשותם בתנאים של גידול תאים הוא גבוה מספיק. את התזה על בדיקות חובה של נכסים של כל סוגי ESC ותאי גזע pluripotent האזורית מתקדמת, שכן הרבייה שלהם במבחנה יכולה להוביל את המראה של מאפיינים חדשים לא טבועה בתאי גזע של העובר או רקמות סופי. בפרט, זה מותר כי גידול ממושך בתקשורת ציטוקין בקירוב קווי ESK לתאי הגידול, שכן שינויים דומים בדרכים של הרגולציה של מחזורי התא להתרחש עם הרכישה של היכולת לבצע מספר בלתי מוגבל של חטיבות התא. מחברים מסוימים, על בסיס הפוטנציאל להתפתחותם של גידולים, שוקלים השתלות אנושית של נגזרות מוקדמות של תאי גזע עובריים כפזיזות. לדעתם, זה הרבה יותר בטוח להשתמש צאצאי מחויבים של ESC, כלומר, את הקווים של אבותיהם של תאים מובחנים. עם זאת, טכניקה אמינה להשגת שורות תאים אנושיים יציבים המבינים בכיוון הנכון עדיין לא פותחה.

לכן, בספרות יש יותר ויותר נתונים על ההשפעה הטיפולית החיובית של השתלת נגזרות תאי גזע עובריים אנושיים. עם זאת, רבים של עבודות אלה כפופים לתיקון וביקורת. יש חוקרים הסבורים כי תוצאות הניסויים הקליניים המוקדמים הם ראשוניים בטבע, ומראים שרק תאי גזע יכולים להשפיע לטובה על מהלך קליני של מחלה. לכן, יש צורך לקבל נתונים על התוצאות לטווח ארוך של השתלת תאים. כטיעון, שלבי הפיתוח של נוירוטרנסנטולוגיה קלינית ניתנים. ואכן, בספרות, בתחילה נשלט על ידי הפרסום יעילות הגבוה של שברי השתלות המוח של עוברת אצל חולי פרקינסון, אבל אז החל להופיע דיווחים מכחישים יעילות טיפולית של רקמה עצבית עוברית או עובר הושתלה במוחותיהם של חולי.

את הניסויים הקליניים הראשונים הערכת הבטיחות של neuroblast להשתלה - הנגזרת של teratocarcinoma NTERA-2 pgcs, תאים לא בוגרים אשר מתרבים בתרבות נחשפו המוני תא מיליון אחסון 100. חלק מהתאים שהתקבלו כך שימשו כדי לאפיין את הפנוטיפ ולקבוע זיהומים התא, כמו גם כדי לבדוק זיהום אפשרי על ידי וירוסים וחיידקים. ממדיום התרבות הוסר LIF ואת שכבת מזין תאי סטרומה ותנאים שנוצרו עובריים לבידול בבימויו של hESCs לתוך neuroblasts עם שילוב של ציטוקינים וגורמי גדילה. לאחר מכן, נוירובלסטים היו מטוהרים מן התאים טרטוקארצינומה בשלים על סדרן כלוב הזרימה. לאחר טיהור ואפיון השני של פנוטיפ של neuroblasts התאים המושתלים (10-12 מיליון דולר) ההשעיה באמצעות stereotaxy המזרק microcannulas מיוחד בשליטת CT מוזרק לתוך הגרעין basalis של המוח של חולים (החודש השביעי לאחר שבץ המורגי). Odnogodovoy-השתלה שלאחר הקרנת ההשפעות של השתלה של נוירונים באזור לשבץ עולה כי אין תופעות לוואי לא רצויות. כמחצית מהחולים חוו שיפור בתפקוד המוטורי בתקופה שבין 6-12 חודשים לאחר ההשתלה. שינויים קליניים חיובי לוו בגידול אזור שבץ אספקת הדם לאחר השתלה של תאים: עלייה וקליטה הממוצע של טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים שכותרתו פלואורסצנטי 2-deoxyglucose, על פי הגיעו 18%, ובחלק מהחולים - 35%.

עם זאת, המכון הלאומי לבריאות בארה"ב ערך מחקר עצמאי על היעילות הקלינית של ניתוחי עצבים בחולים עם פרקינסון. המטופלים בקבוצה הראשונה הושתלו עם רקמת עצב עובריים המייצרת דופמין, ואילו קבוצת החולים השנייה עברה ניתוח כוזב. התוצאות מצביעות על יעילות קלינית אפסית של השתלות עצבית כזו, למרות העובדה כי נוירונים עובריים לייצור דופמין שרדו במוחם של הנמענים. יתר על כן, לאחר 2 שנים לאחר ההשתלה של רקמה עצבית של העובר ב 15% מהחולים פיתחו דיסקינזיה מתמשך, אשר נעדר בחולים בקבוצת הפלצבו (בתאי גזע: התקדמות מדעית כיווני מחקר עתידיים נט Inst, הבריאות בארה"ב ...). התצפיות על התפתחות נוספת של המחלה בחולים אלו נמשכות.

מחברים יש התולים את הספרות סותרת על ההערכה של נתוני Neurotransplantation יעילות קליניים עם גישה שונה לבחירת קבוצות חולות, בחירה לקויה של שיטות אובייקטיביות להערכת מצבם, והכי חשוב, תנאים שונים של התפתחות רקמת העצבים של העובר וכן בחלקים שונים של המוח שממנו במרקם הופק בגדלים שונים השתלות ותכונות שיטתי של הניתוח.

יצוין כי ניסיונות לכוון השתלות של תאי גזע עובריים פלוריפוטנטיים באזור הסטריאטום במוח של חולדות עם gemiparkinsonizmom גוף הניסיון מלווה התפשטות ESC וההבחנה שלהם לתוך נוירונים דופאמינרגיים. יש להניח כי נוירונים שנוצרו לאחרונה נבנו בצורה יעילה לתוך רשתות עצביות, שכן לאחר השתלת ESC תיקון של חריגות התנהגותיות ואסימטריה המנוע במבחן apomorphine נצפתה. במקביל, חלק מן החיות מתו עקב שינוי של ESK המושתלים בגידול במוח.

מומחים של ארה"ב הלאומית הרפואית האקדמיה, מומחים של המכון הלאומי לבריאות מאמינים כי הפוטנציאל הקליני של hESCs ראוי לתשומת לב רצינית, לעומת זאת, מתעקש על הצורך במחקר מפורט של הנכסים שלהם, את הסיכון לסיבוכים ותופעות לטווח ארוך בניסויים עם מודלים ביולוגיים נאותים של מחל אנושיות (בתאי גזע ואת רפואה משלימה בעתיד האקדמיה הלאומית האקדמיה, תאי גזע ואת כיווני המחקר העתידיים., Nat., של ארה"ב בריאות).

מנקודת מבט זו, חשוב כי ניתוח היסטולוגית ההשוואתי של teratoma ניסיוני מתקבל על ידי השתלת PGCs תרחיף testis עם teratomas שהתפתח עקב עובר ההשתלה מוקדם, שכלל גם בהווה ESC הראה כי אסק קשר למוצאו או האינטראקציה שלהם עם על ידי אלה או תאים אחרים המקיפים באותו אופן להבין את הפוטנציאל הטומוריגני שלהם. זה הוכיח כי teratomas כאלה הוא ממקור משובט, כמו מתוך ESCs גידול עלול להתרחש, מורכב של הנגזרות של כל השלוש השכבות הניבטות (.Rega, 2001). ראוי לציין כי כאשר מושתלים לעכברי immunodeficient המשובטים PGCs עם קריוטיפ נורמלי teratomas יצר מורכב ממגוון של סוגי תאי סומטיים בדיל. נתונים ניסיוניים אלה הם הוכחה מושלמת למוצא המשובש של הטרטום. מנקודת המבט של ביולוגיה ההתפתחותית, הם טוענים שזה לא מרובה של ובתאים מחויבים וזהות תאי גזע פלוריפוטנטיים הוא המקור של נגזרי בדיל מכל השלוש השכבות הניבטות, רכיבי teratoma. עם זאת, בתוצאות השתלת תאי המעשיות של מחקרים אלה, אם לא יעשו, אז סימן אזהרה של סכנה פוטנציאלית, מאז ESC חיסון או תאים ניבטו בראשיתיים ברקמות שונות של עכברי immunodeficient מבוגרים בהכרח גורם להתפתחות של גידולים מתאים הגזע המושתל. ניוון נאופלסטיות ectopically המושתלים ESC מלווה הופעתה של אוכלוסיות לווין של תאים ממוינים - ידי חלקית לבדל בהחלט ESCs מולידם שיבוטים קווים ייעודיים. מעניין, כאשר השתלת ESC לתוך שרירי השלד ליד תאים teratocarcinoma, נוירונים נוצרים לרוב. עם זאת, בניהול PGCs מייס ביצה או הבלסטוציסט מלווה להשתלבות מלאה בתאי הנבט ללא היווצרות של תאים נאופלסטיות. במקרה זה, ESCs בנויים כמעט כל איברים ורקמות של העובר, כולל את המין המיני. חיות אלוופניות אלו הושגו לראשונה על ידי החדרת התאים של טרטוקארצינומה 129 לעוברים מוקדמים בשלבים של 8-100 תאים. בשנת allofennyh אוכלוסיות עכברי geterogenomnyh PGCs תורם נגזרות תא מוכנס מח עצם, מעי, עור, כבד ואיברי מין, המאפשר לך ליצור בניסוי אפילו מפלצות תא interspecies. קטן יותר בזמן העובר המוקדם, כך עולה אחוז התא chimerization, את chimerization בדרגה הגבוהה ביותר שנצפתה מערכת hematopoietic, העור, מערכת העצבים, הכבד והמעי הדק allofennogo העובר. באורגניזם בוגר את chimerization רקמות מקובל מוגן מפני חשיפה למערכת החיסונית של מחסומים gistogematicalkie הנמען: תאי נבט בראשיתי השתלת בתוך parenchyma testis מלווה החדרת תאי גזע מתורם לתוך שכבת germenativny רקמה הנמען. עם זאת, השתלת ESC לתוך איבר מין כימרי היווצרות הבלסטוציסט primordia עם תאים ניבטו בראשיתי תורם הדור אינה מתרחשת. מגוונת" ESC בעת יצירת תנאים מיוחדים ויכול לשמש שיבוט: עכברי השתלת ESC העובר עכבר 8-16 תאים, מיטוזה תא שבו חסם tsitokalazinom, תורם העובר הנורמלי עם התפתחות PGCs התורם עובר.

כתוצאה מכך, חלופה היא השתלה של שיבוט רפואי אלוגנאית ESC מבוססת על השתלת גרעין תא סומטי לתוך ביצית enucleated ליצור מסה תאית של הבלסטוציסט שממנו אז מוקצה קו PGCs תורם הזהה גנטי גרעין סומטי. מבחינה טכנית, הרעיון הזה אינו ריאלי, מאחר ויכולת יצירת קווי hESC מן blastocysts שהושג לאחר השתלת גרעינים סומטיים לתוך תא ביצית enucleated הוכיח שוב ושוב בניסויים בחיות מעבדה (Nagy, 1990; Munsie, 2000). בפרט אצל עכברים הומוזיגוטיים למוטציה rag2, הפיברובלסטים מתקבל על ידי תאים culturing subepidermal רקמות שימשו גרעין התורם מושתלים לתוך בביציות. לאחר ההפעלה, ביציות "זיגוטה" מתורבת עד היווצרות הבלסטוציסט, ממסת התאים הפנימית היא PGCs מבודד ולעמוד בהן לקו עבור התאים nullizigotnyh הגן המוטנטי (rag2 ~ / ~). על ידי recombination הומולוגיים ב ESCs כאלה, מוטציה של גן אחד allelic תוקן. בסדרה של ניסויים הראשון מן hESCs הגן רקומביננטי התאושש גופים embryoid הוכנו, תאים transfected ממנו עם רטרו-וירוס רקומביננטי (HoxB4i / GFP) ואחרי התפשטות ב עכברים שהוזרק וריד rag2 ~ / ~. בסדרה השנייה, בלסטומרים tetraploid צברו עם ESCs מהונדסים גנטית ו מושתלים הנמענים הנשי שלהם. העכברים החיסונים הנולדים שימשו תורמי מוח עצם להשתלה לעכברים מוטנטים. בשתי הסדרות, והתוצאה הייתה חיובית: 3-4 שבועות בכל העכברים של תאי מיאלואידית ו הלימפה בוגרות נורמלים נמצאו מסוגל לייצר נוגדנים. לפיכך, השתלת לתוך גרעין הביצית של תאים סומטיים יכול לשמש לא רק כדי לייצר קווי hESC, אלא גם עבור tsitogenoterapii - תיקון פגמים תורשתיים באמצעות ESC כווקטור להובלה של תיקון המידע הגנטי. אבל בכיוון זה של השתלת תאים, מלבד בעיות bioethical, יש מגבלות. לא ברור עד כמה בטוח להשתלה תהיה משובטת תאים טיפוליים עם גנוטיפ זהה הגנוטיפ של כל מטופל, כי תאים כאלה יכולים להציג מוטציות יוצרות נטייה למחלות מסוימות. ביצי אדם רגילות להישאר אובייקט נגיש, בעוד גם כאשר משתילים גרעין סומטי לתוך ביצית חית enucleated רק 15-25% המהונדסים "זיגוטה" להתפתח לשלב הבלסטוציסט. זה לא נקבע כמה בלסטוציסט נדרש כדי להשיג שורה אחת של ESCs משובטים pluripotent. יש לציין ורמה גבוהה של עלויות פיננסיות הקשורות במורכבות של שיטת השיבוט הטיפולית.

לסיכום, בגנום מגוונת" ESC hypomethylated DNA משולב עם פעילות טלומרז גבוהה שלב במחזור התא קצר C ^, אשר מבטיח כפל אינטנסיבית ואפשרות אינסופי, שבמהלכו PGCs לשמור כרומוזומים דיפלואידי ו "נעורים" סט של תכונות פנוטיפי. צמיחה משובטת של PGCs בתרבות אינה מונעת מהם להתמיין לכל תא מיוחד של האורגניזם בכל התפשטות קו עצירה והוסיפה אותות רגולטורית מתאימים. בידול הגבלת hESCs בתור תא סומטי במבחנה ממומש ללא השתתפות של mesenchyme, עקיפת Nohteyaov, הוא organogenesis וללא היווצרות העובר. ניהול Ectopic של ESC in vivo מוביל בהכרח להיווצרות של teratocarcinomas. ESC השתיל לתוך בלסטוציסט או העובר מוקדם מלווה ושילובם עם הרקמות של העובר וגופי chimerization היציבים שלה.

טכנולוגיות משובי פלסטיק מבוסס על השתלת תאי היא נקודת החיתוך של האינטרסים של חברי בביולוגיה של התא, ביולוגיה התפתחותית, גנטיקה ניסיוני, אימונולוגיה, נוירולוגיה, קרדיולוגיה, המטולוגיה, ובתחומים רבים אחרים של הרפואה ניסיוני המעשי. תוצאות הניסוי החשובות ביותר להוכיח את האפשרות של תכנות מחדש של תאי גזע עם הכיוון של שינוי של הנכסים שלהם, אשר פותחים סיכויים לבקרת תהליכי cytodifferentiation עם גורמי גדילה - עבור התחדשות שריר לב, שיקום של נגעי CNS ונורמליזציה של פונקציה של מנגנון האיון של הלבלב. עם זאת, ESC נגזר השתלת מבוא הנרחבת בפרקטיקה רפואית יש צורך לחקור את המאפיינים של תאי גזע אנושיים ביתר פירוט וניסויים נוספים עם pgcs במודל ניסיוני של מחלות.

סוגיות ביו-אתיות ואת הבעיה של דחיית השתלת תאי אלוגנאית יכולים לפתור את הפלסטיות הנצפית של הגנום של תאי גזע בוגרים אזוריים. עם זאת, המידע הראשוני הוא שכאשר משתילים הכבד מבודדים מאופיין ביסודיות תאי hematopoietic אוטולוגי, אשר יש hepatocytes חדש, המשלב לתוך האוניות כבדות, כעת נבדקים, ביקורת. עם זאת, פרסם נתונים כי ההשתלה של תאי גזע עצביים התימוס היא ההיווצרות של ניבטים חדשים של לימפוציטים מסוג B תורם T-ו, ו השתלת תאי גזע עצביים במוח במוח העצם מובילה להיווצרות של מיאלואידית תורם מתמשך ניבטת hematopoietic ואת ייצור כדוריות דם אדום . כתוצאה מכך, באיברים מבוגרים ניתן לשמר תאי גזע פלוריפוטנטיים מסוגלים תכנות מחדש הגנום של ESC עד אפס מקום.

העובר האנושי נשאר מקור קבלת ESC למטרות רפואיות, אשר קובע מראש את הבלתי נמנע של צומת חדש של בעיות מוסריות, אתיות, מוסריות, משפטיות ודתיות בשלב הלידה של חיי אדם. גילוי ESCs נתן דחיפה חזקה לחידוש של דיונים קשים על איפה הקו בין תאים חיים וחומר, חומר ואישיות שקרים. עם זאת, אין בנורמות אוניברסליות, בכללים ובחוקים הנוגעים לשימוש ב- ESC ברפואה, למרות ניסיונות חוזרים ונשנים ליצור אותם ולקבלם. כל מדינה בחקיקה שלה פותרת בעיה זו בפני עצמה. מצדם, רופאים מרחבי העולם ממשיכים לנסות לפתח רפואה פלסטית משוחזרת מעבר לדיונים אלה, בעיקר באמצעות שימוש בתאי גזע לא עובריים, ורזרבות תאי גזע של אורגניזם מבוגר.

חלק מההיסטוריה של בידוד תאי גזע עובריים

Terato- (עובר) תאים בודדו -kartsinomnye המתרחש זן עכבר teratomas אשכים ספונטני 129 / ter-Sv, קווי עכבר teratomas השחלות ספונטניים סגן / Sv, ומן teratomas, מקור ektopichno היה תאים מושתלים או רקמה עוברית. בין ובכך השיגו terato- קווי עכבר יציבים (עובר) -kartsinomnyh תאים חלקם פלוריפוטנטיים, ואחרים נחשפו בידול רק בתאים מסוג מסוים, וחלקם היה בדרך כלל מסוגל cytodifferentiation.

בזמנו, הדגש היה מחקר שהראה terato- חזרה אפשרי (עובר) תאי -kartsinomnyh כדי פנוטיפ נורמלי לאחר ההקדמה שלהם ברקמת העובר המתפתחת, כמו גם עבודה כדי ליצור terato- גנטית במבחנה שונה (עובר) -kartsinomnyh תאים, בעזרתם של עכברים מוטנטים הושגו עבור מודלים ביולוגיים של הפתולוגיה תורשתית אנושית.

טיפול ההשעיה מותנה שימש לבודד את השורות של תאים עובריים-קרצינומה. בתרבות terato- (העובר) -kartsinomnye תאים, כמו ESCs, לגדול ליצירת גופים embryoid ודורשים יתורגמו קו מחייב ניתוק שמירה מגוונת" על שכבת מזין של פיברובלסטים עובריים או culturing ההשעיה בתקשורת מותנה. Terato- תאים פלוריפוטנטיים (עובר) - קווי קרצינומה גדולים, כדוריים, יש פעילות גבוהה של phosphatase אלקליין, אגרגטים טופס ומסוגלים בידול רב-כיוונית. כאשר הציג לתוך בלסטוציסט נצברים עם morulae, וכתוצאה מכך ההיווצרות של עבר chimeric, באיברים והרקמות השונים אשר נגזר נמצאים terato- (עובר) תאי -kartsinomnyh. עם זאת, הרוב המכריע של עבר chimeric כזה למות ברחם, וכן באיברים לשרוד מפלצות יילוד תאים זרים ולעתים נדירות מזוהות עם צפיפות נמוכה. במקביל את השכיחות של גידולים (fibrosarcoma, ראדומיוסרקומה, וסוגים אחרים של נפיחות ממאירים ולבלב אדנומה) בחריפות מגדילה, וניוון נאופלסטיות קרובה מתרחשת גם עובר chimeric ברחם.

רוב תאי טבורו-עוברי-קרצינומה בסביבת המיקרו-תאי של תאים עובריים רגילים כמעט רוכשים באופן טבעי מאפיינים נויפלסטיים ממאירים. הוא האמין כי ממאירות בלתי הפיך נובע ההפעלה של פרוטו אונקוגנים בתהליך של סידורים מבניים. חריג אחד הוא שורות תאי embriokartsinomnoy SST3, teratoma נגזר testis בעכברים (קו 129 / Sv-ter), אשר מציג יכולת גבוהה להשתלב רקמות ואיברים של העובר ללא ההיווצרות הבאה של גידולים בעכברי chimeric. נגזרות של תאים עובריים-תאים סרטניים בעכברים כימרא למעשה לא להשתתף במבנה של גונוציטים ראשוניים. ברור, הוא מחובר עם תדירות גבוהה של סטיות כרומוזום נפוצות ברוב terato- (עובר) קווי -kartsinomnyh שבו תאים שנצפו כמו aneuploidy או אנומליה כרומוזומלית.

כמה שורות terato- יציבות (עובר) תא אנושי -kartsinomnyh הוכן בתנאי מעבדה, המאופיינת מגוונת", פעילות שגשוג גבוהה ויכולת להבחין בתרבות במהלך צמיחה. בפרט, השורה של תאים אנושיים-עובריים-קרצינומה NTERA-2 שימשה כדי לחקור את המנגנונים של cytodifferentiation עצביים. לאחר השתלה, תאים של הקו הזה באזור subventricular של המוח הקדמי של חולדות יילוד והגירתם נצפו neyronogenez. נעשה אף ניסיונות להשתיל terato- העצבית מתקבלת על ידי תאי culturing (עובר) -kartsinomnoy קו NTERA-2, לחולים עם שבץ, אשר, על פי המחברים, מה שמוביל לשיפור קליני של המחלה. במקרה זה, מקרים של ממאירות של תאים המושתלים של קו עורק-טרטו-קרצינומה NTERA-2 בחולים עם שבץ לא צוין.

אוואנס ומרטין קיבלו את השורות הראשונות של תאי גזע עובריים לא מובחנים מעכברים בתחילת שנות השמונים של המאה הקודמת, כשהם מבודדים אותם ממסת התא הפנימית של הבלסטוציסט, העובר. הקווים ESC מבודד במשך זמן רב השתמר pluripotency ואת היכולת להבדיל סוגים שונים של תאים תחת השפעת גורמים של מדיום תרבות מיוחדת.

המונח "תאי גזע פלוריפוטנטיים עובריים" שייך לירוי סטיבנס כי חקירת השפעת זפת טבק על התדר של התפתחות גידולים הפנתה את תשומת לב אל המופע של teratocarcinoma אשכים הספונטני של ליניארי (129 / v) של עכברים של קבוצת הביקורת. תאי teratocarcinoma אשכים התאפיינו קצב התפשטות גבוה, וכן בנוכחות הנוזל נשאר חלל הבטן עם ההיווצרות של התמיינות ספונטנית של נוירונים, קרטינוציטים, chondrocytes, שריר לב, וכן שברי שיער ועצמות, אבל בלי שום אינדיקציה של רקמות מתאימות הורה cytoarchitectonics. כאשר שותל תרבית תאי teratocarcinoma גדל מחוברות שיבוטי פלוריפוטנטיים המצע וגופי Embryoid יצרו היו רווים אז נתון פרועת ביקוע ספונטני להתמיין נוירונים, גליה, תאי שריר שריר לב. סטיבנס נמצא כי עכבר teratocarcinoma 129 / v מכיל פחות מ 1% של תאים מסוגלים מבחין לתוך מגוון של קו סומטיים מיוחד, ואת עצמו בידול תלוי בגורמים המשפיעים עליהם (נוזל הצפק רכב, המוצרים מתווספים התרבות של תאים או רקמות בוגרים). לירוי סטיבנסון הנחה על הנוכחות בקרב תאי teratocarcinoma ובתאים עובריים לתאי ניבט מינית אושר: ההשעיה embryoblast תאי עוברי preimplantation ברקמות עכבר המבוגר נוצרה teratocarcinoma, ומופרד מהם שורות תאים טהורות לאחר ממשל intraperitoneal לבעלי חי נמען היה מובחנים לתוך הנוירונים, שריר לב ואת kletki סומטיות אחר נגזרות של כל השכבות ניבטו השלוש. בניסויים בהשתלת vivo אסק (המתקבל embryoblast אבל לא trophoblast) ב עוברי עכברים בבית קווים בשלבים שונים לידת 8-32 blastomere הסתיימה של החיה כימרי (ללא היווצרות גידולים) באיברים אשר מזהה רקמות תורם ניבט. Chimerism נצפתה אף בקו של תאי מין.

תאים ניבטו ובתאים ראשיים מבודדים מין ניבט העובר עכבר, מורפולוגיה, פנוטיפ אימונולוגיות מאפיינים פונקציונליים עקבי עם hESCs נגזר teratocarcinoma סטיבנסון embryoblast. בשעת כימרות נולד לאחר מתן hESCs לתוך בלסטוציסט, allofenny morphogenesis האיבר מאופיין תורם לסירוגין פסיפס נמען מבני ויחידות תפקודיות של הכבד, ריאות והכליות. במספר מקרים, היווצרות של crypts מעיים או lobules של הכבד, המורכב בו זמנית של הנמען ותאי התורם, נצפתה. עם זאת, תמיד התממשה ההשתנות של המורפוגנזה על פי התוכנית הגנטית של המינים שאליהם השתייך המקבל, והשימריות היתה מוגבלת רק לרמה התאית.

ואז, נמצא כי ההתפשטות של hESCs ללא cytodifferentiation על תאי המזנכימה מזין נגזר שכבתי (פיברובלסטים עוברי) מתרחשת בנוכחות LIF מחייב בתקשורת המזינה סלקטיבית אשר סלקטיבי לספק הישרדות רק של תאי גזע ובתאים, בעוד הרוב המכריע של אלמנטי הסלולר המיוחדים מת. בעזרת טכניקות אלה 1998 על ידי ג'יימס תומסון הוקצה חמש שורות הונצחו בתאי גזע עובריים ממסת התאים הפנימית של אדם הבלסטוציסט. באותה שנה, ג'ון גרהרט פיתחה שיטה לבודד את הקווים ESC אלמוות מן נשיפה מינית של ארבעה-חמישה שבועות עוברים אנושיים. בשל המאפיינים הייחודיים שלה, רק שנתיים מאוחר עובריים ותאי גזע ותאי גזע רקמות מוחלטות החלה לשמש ברפואה רגנרטיבית ריפוי גנטי.