אבחון מעבדתי של שחפת

שחפת היא מחלה שקל לאבחן בתנאים מודרניים ובהישגים מדעיים. אבחון מעבדתי של שחפת תופס מקום מרכזי בין שיטות אבחון אחרות, שני רק לשיטות בדיקה באמצעות צילומי רנטגן.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

בדיקת דם קלינית

בחולי שחפת, שינויים בבדיקת הדם הכללית אינם פתוגנומוניים. בצורות מוגבלות ונמוכות פעילות של שחפת, היפוכרומיה של אריתרוציטים במספר תקין אופיינית. בחדירות מסיביות או דלקת ריאות קייסית, עם לימפדניטיס קייסית נרחבת, נזק ספציפי למעי, כמו גם עם דימומים ריאתיים או לאחר ניתוח גדולים, נצפים אריתרופניה ומיקרוציטוזיס, אוליגוכרומזיה ופוליכרומזיה. מקרוציטוזיס, ובמיוחד פויקילוציטוזיס, נתקלים בתדירות נמוכה בהרבה, בדרך כלל עם אנמיה חמורה. מספר הרטיקולוציטים בשלב המפוצה של שחפת נע בין 0.1 ל-0.6%, בשלב התת-מפצה - בין 0.6 ל-1.0%, ובשלב הלא מפוצה, 1% מהרטיקולוציטים אופייניים.

במקרים מסוימים של שחפת, ניתן לראות לויקוציטוזיס בינוני (עד 15 אלף לויקוציטים), בתדירות נמוכה יותר לוקופניה, המתרחשת ב-2-7% מהמקרים בחולים עם צורות מוגבלות וקלות של התהליך וב-12.5% בשחפת ריאתית הרסנית ומתקדמת.

לרוב, מתרחשים שינויים בנוסחת הלויקוציטים. נצפות נויטרופיליה יחסית ומוחלטת כאחד, עם שינוי מתון בנוסחת הלויקוציטים שמאלה לכיוון הפרומיאלוציטים. מיאלוציטים נצפים לעיתים רחוקות מאוד במקרים של שחפת לא מסובכת. עלייה במספר הנויטרופילים עם גרגיריות פתולוגית בהמוגרמה של חולה שחפת תמיד מעידה על משך התהליך: בחולים עם שחפת קשה, כמעט כל הנויטרופילים מכילים גרגיריות פתולוגית. כאשר התפרצות שחפת שוככת, השינוי הגרעיני חוזר לנורמה במהירות יחסית. הגרגיריות הפתולוגית של נויטרופילים נמשכת בדרך כלל זמן רב יותר משינויים אחרים בהמוגרמה.

תכולת האאוזינופילים בדם ההיקפי משתנה גם היא בהתאם לשלב התהליך ולמצב האלרגי של האורגניזם. מספרם יורד לאנאאוזינופיליה בהתפרצויות קשות וממושכות של המחלה, ולהיפך, עולה במהלך ספיגת חדירות ותפיחה פלאורלית, כמו גם בצורות מוקדמות של שחפת ראשונית.

רוב צורות השחפת הראשונית מלוות בלימפופניה, שלעיתים נצפית במשך מספר שנים גם לאחר הצטלקות של שינויים ספציפיים. שחפת משנית בשלב האקוטי, בהתאם לחומרת התהליך, יכולה להיות מלווה במספר תקין של לימפוציטים או בלימפופניה.

בין הבדיקות להערכת תהליך השחפת, מקום מיוחד תופס קביעת קצב שקיעת כדוריות הדם האדומות (ESR), שהוא חשוב בהערכת מהלך תהליך השחפת ובזיהוי צורותיו הפעילות. עלייה ב-ESR מצביעה על נוכחות של תהליך פתולוגי (זיהומי ודלקתי, מוגלתי, ספטי, המובלסטוזיס, לימפוגרנולומטוזיס וכו') ומשמשת כאינדיקטור לחומרתו, אך ערכי ESR תקינים אינם תמיד מצביעים על היעדר פתולוגיה. האצת שקיעת כדוריות הדם מתאפשרת על ידי עלייה בתכולת הגלובולינים, הפיברינוגן, הכולסטרול בדם וירידה בצמיגות הדם. האטת שקיעת כדוריות הדם אופיינית למצבים המלווים בהמוריכוז, עלייה בתכולת האלבומינים וחומצות מרה.

ההמוגרמה של חולי שחפת משתנה במהלך הטיפול. ככל שההתערבות הטיפולית מוצלחת יותר, כך השינויים ההמטולוגיים נעלמים מהר יותר. במקביל, יש לזכור את השפעתן של תרופות אנטיבקטריאליות שונות על ההמטופויאזה. הן גורמות לעיתים קרובות לאאוזינופיליה, במקרים מסוימים - ללויקוציטוזיס, ולעתים קרובות יותר ללויקופניה עד לאגרנולוציטוזיס ותגובה לימפואידית-רטיקולרית. ניטור המטולוגי שיטתי וניתוח נכון של הנתונים המתקבלים חיוניים להערכת המצב הקליני של המטופל, הדינמיקה של התהליך ויעילות הטיפול.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

ניתוח שתן קליני

במקרה של שחפת בדרכי השתן, בדיקת שתן היא שיטת האבחון המעבדתית העיקרית. ניתן לראות לויקוציטוריה, אריתרוציטוריה, פרוטאינוריה, היפואיזוסטנוריה, מיקובקטריוריה שחפתית ובקטריוריה לא ספציפית.

לויקוציטוריה היא התסמין השכיח ביותר של שחפת בדרכי השתן לפני כימותרפיה ספציפית, והיא נעדרת רק במקרים חריגים, כגון מחיקה מוחלטת של לומן השופכן. מבחן נצ'יפורנקו (קביעת מספר הלויקוציטים ב-1 מ"ל של שתן) מסייע להעריך בצורה אובייקטיבית יותר את מידת הלויקוציטוריה בנפרו-שחפת, ובמקרים מסוימים לאתר אותה באמצעות בדיקת שתן כללית תקינה. עם זאת, יש לקחת בחשבון שלויקוציטוריה יכולה להופיע בדלקת פיאלונפריטיס חריפה וכרונית, דלקת שלפוחית השתן, דלקת השופכה, אבנים בכליות ובשופכנים.

אריתרוציטוריה, כמו לויקוציטוריה, נחשבת לאחד הסימנים המעבדתיים הנפוצים ביותר לשחפת גניטורינארית. תדירות ההמטוריה תלויה בשכיחות התהליך; היא עולה ככל שהתהליך השחפתי ההרסני בכליה מתפתח. אריתרוציטוריה ללא לויקוציטוריה אופיינית יותר לשלבים המוקדמים של שחפת כלייתית. המטוריה, הגוברת על לויקוציטוריה, היא טיעון חשוב לטובת שחפת כלייתית כאשר מבדילים אותה מפיאלונפריטיס לא ספציפית.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

בדיקת דם ביוכימית

בשחפת, שינויים בכמה מדדים ביוכימיים תלויים בעיקר בשלב התהליך, בסיבוכים ובמחלות נלוות שונות. בחולים עם שחפת לא פעילה של הריאות ואיברים אחרים, סך החלבון ושברי החלבון בסרום הדם אינם משתנים וקובעים את תכולתם התקינה.

בצורות חריפות של המחלה, כמו גם בהחמרה והתקדמות של צורות כרוניות של שחפת, מקדם האלבומין-גלובולין יורד.

חשיבות משמעותית בהערכת המצב התפקודי והנזק האורגני לכבד בשחפת ובסיבוכיה היא קביעת רמות הבילירובין הישיר והסך הכללי, אספרטט אמינוטרנספראז (AST), אלנין אמינוטרנספראז (ALT) בסרום הדם. קביעה דינמית של רמת האמינוטרנספראזות. בילירובין בטיפול בחולי שחפת, במיוחד בצורותיה החמורות, הוא מרכיב חובה בבדיקה הביוכימית של חולי שחפת ומתבצעת מדי חודש.

הערכת המצב התפקודי של הכליות כוללת קביעת קריאטינין בסרום וחישוב קצב הסינון הגלומרולרי באמצעות נוסחת קוקקרופט-גו. חישוב קצב הסינון הגלומרולרי באמצעות מבחן רברג נותן תוצאות פחות מדויקות.

המטרה העיקרית של מחקרים ביוכימיים דינמיים של חולי שחפת היא לפקח על מהלך התהליך, גילוי בזמן של תופעות לוואי של תרופות ותיקון הולם של הפרעות הומאוסטזיס מתפתחות.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

יישום שיטות מחקר ביוכימיות בשחפת חוץ-ריאתית

האינדיקטור האינפורמטיבי ביותר נחשב לתכולת חומצה טוברקולוסטארית בנוזלים ביולוגיים, אולם קביעתו קשורה לקשיים טכניים (הצורך להשתמש בכרומטוגרפיית גז וספקטרומטריית מסה).

למדוד את פעילות אדנוזין דאמינאז - אנזים הנקבע בנוזלים: סינוביאליים, פריקרדיאליים, מיימת או מוחי-שדרתיים, מבטיח. היצרנים העיקריים של אדנוזין דאמינאז הם לימפוציטים ומונוציטים. קביעת פעילות אדנוזין דאמינאז בנוזלים ביולוגיים מקלה על אבחון של סינוביטיס שחפתית, שחפת של בלוטות הלימפה, דלקת קרום המוח שחפתית וסרוזיטיס שחפתית.

חלק מהאינדיקטורים הביוכימיים, בשל חוסר הספציפיות שלהם, נקבעים רק בנוזלים ביולוגיים הקרובים לנגע. רמת האינדיקטורים נמדדת בתגובה למתן תת עורי או תוך-עורי של טוברקולין (בדרך כלל לפני מתן התרופה ו-48 ו-72 שעות לאחר מכן). לאחר מכן, מחושבת מידת העלייה ברמת הסמן (באחוזים) ביחס לרמה ההתחלתית.

באופן אופטימלי, פעילות האנזים הספציפי לאיבר טרנסמידינאז נקבעת בשתן; הופעתו נצפית בנזקי כליות ממקורות שונים. מחקר הטרנסמידינאז מוצדק רק בתנאים של מתן תת עורי של טוברקולין על מנת להחריף את התהליך הדלקתי המקומי. פעילות הטרנסמידינאז נקבעת בשתן בתחילה וב-24-72 שעות לאחר מתן 50 TE טוברקולין. עלייה של פי 2 או יותר בפרמטוריה מאפשרת ב-82% מהמקרים להבדיל בין שחפת פעילה של הכליות להחמרה של פיאלונפריטיס כרונית.

במקרה של שחפת באיברי המין הנשיים, ריכוזי ההפטוגלובין והמלונדיאלדהיד בדם נקבעים בתנאי בדיקת טוברקולין פרובוקטיבית. טוברקולין מנוהל תת עורית במינון של 50 TE ומחקר ביוכימי חוזר מתבצע לאחר 72 שעות. במקרה של אטיולוגיה שחפתית, מידת העלייה ברמת ההפטוגלובין היא לפחות 28%, ורמת המלונדיאלדהיד היא 39% ומעלה. קביעת פעילות אדנוזין דיאמינאז בנוזל הצפק המתקבל מכיס דאגלס משמשת גם כן. הניקור נבדק שוב 72 שעות לאחר מתן תוך-עורי של טוברקולין במינונים של 0.1 TE ו-0.01 TE באזור הקרנה של איברי המין הפנימיים על דופן הבטן הקדמית. עלייה בפעילות אדנוזין דיאמינאז ב-10% ומעלה בהשוואה לערך ההתחלתי מצביעה על תהליך שחפתי.

במקרה של נזק לעיניים, נבדקת התגובה המוקדית המתרחשת בעין בתגובה לגירוי אנטיגן. במקרה זה, התפתחות של תגובה חדה המלווה בירידה בתפקודי הראייה אינה רצויה. מאחר והערכת תגובות מוקדיות מינימליות היא לעתים קרובות קשה, מומלץ להתמקד במקביל במידת העלייה בהפטוגלובין או אדנוזין דיאמינאז בסרום הדם כדי לבסס את המסקנה.

יש לבצע את כל המחקרים הביוכימיים בשילוב עם שיטות אחרות.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

חקר מערכת קרישת הדם

הרלוונטיות של לימוד מצב מערכת קרישת הדם בפתיזיולוגיה נובעת מנוכחות המופטיזיס או דימומים ריאתיים במספר חולים עם שחפת ריאתית, כמו גם מסיבוכי קרישת דם בטיפול כירורגי בשחפת. בנוסף, קרישת דם תוך-וסקולרית סמויה הנלווית באופן טבעי משפיעה על מהלך המחלה ועל יעילות הכימותרפיה.

בחולים עם שחפת ריאתית עם מרכיב דלקתי דומיננטי, נצפית ירידה בפעילות נוגדת הקרישה של הדם. בחולים עם שכיחות נמוכה של נזק ריאתי ספציפי עם מרכיב דלקתי פרודוקטיבי דומיננטי, קרישת דם תוך-וסקולרית מתבטאת באופן זניח. בחולים עם שחפת ריאתית עם המופטיזיס ודימומים ריאתיים, מצב מערכת קרישת הדם שונה: בחולים עם אובדן דם קל בשיא ההמופטואה או מיד לאחר הפסקתה, נצפית עלייה חדה ביכולת הקרישה של הדם עקב התגברות בולטת של תהליכי יצירת תרומבין תוך שמירה על קרישה "מבנית" מוגברת. בחולים עם אובדן דם מסיבי, נצפית ירידה בפוטנציאל הקרישה עקב ירידה בריכוז הפיברינוגן, פעילות פקטור XIII וספירת טסיות דם. בשלב הטיפול הכירורגי בחולים עם צורות מוגבלות של שחפת ריאתית, לא מתרחשות הפרעות משמעותיות במערכת ההומאוסטזיס. בחולים עם תהליכים נרחבים, בעת ביצוע כריתת פנאומונוקטומיה או כריתת פלאורופנאומונוקטומיה, מתפתחת לעיתים קרובות תסמונת DIC, שיכולה ללבוש צורה של "מחלה שנייה".

כדי לנטר את מצב מערכת קרישת הדם בחולים עם שחפת ריאתית, יש צורך לקבוע את זמן התרומבופלסטין החלקי המופעל (APTT), פיברינוגן, זמן תרומבין, מדד פרותרומבין, כמו גם זמן דימום וזמן קרישת דם.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

מחקרים הורמונליים

תצפיות ניסיוניות וקליניות מודרניות מצביעות על נוכחות שינויים במצב ההורמונלי בדלקת שחפתית ספציפית של הריאות. הוכח כי תיקון תפקוד לקוי של מערכות בלוטת יותרת המוח-יותרת הכליה, בלוטת יותרת המוח-בלוטת התריס ותפקוד הלבלב בשילוב עם טיפול אנטי-שחפתי תורמים להפעלת פיברוגנזה ותהליכי תיקון במוקד הדלקת הספציפית.

_{המצב התפקודי של מערכת בלוטת יותרת המוח} -בלוטת התריס נשפט על ידי תכולת הטרייודותירונין (T3), התירוקסין (T4) והורמון מגרה בלוטת התריס (TSH) של בלוטת יותרת המוח בסרום הדם _. נקבע כי תת-פעילות של בלוטת התריס תת-קלינית מזוהה ב-38-45% מהחולים בשחפת ריאתית, והיא מאובחנת לרוב בצורות מפושטות וסיביות-חלליות של התהליך. בצורות אלו, רמות T3 ו-T4 יורדות בצורה החדה ביותר _, וחוסר _איזון של הורמונים אלה מתרחש בצורה של עלייה ביחס _T4/ T3.

תפקוד קליפת האדרנל מוערך על ידי רמת הקורטיזול בסרום, והתפקוד האנדוקריני של הלבלב מוערך על ידי ריכוז האינסולין האימונו-ריאקטיבי. בשלב האקוטי של מחלה זיהומית, הצורך בקורטיזול ואינסולין אנדוגני עולה. היפר-אינסולינמיה מצביעה גם על עמידות לאינסולין של רקמות הגוף, האופיינית לכל תהליך דלקתי פעיל, ובפרט תהליך ספציפי. קביעת תפקוד הגלוקוקורטיקואידים של בלוטות האדרנל בשחפת ריאתית פעילה מאפשרת לנו לזהות נוכחות של היפרקורטיקום אצל רוב החולים. ריכוזי קורטיזול תקינים בדם אצל חולה עם דלקת זיהומית בתקופה האקוטיים צריכים להיחשב כחוסר יחסי של תפקוד הגלוקוקורטיקואידים של קליפת האדרנל, שיכול לשמש בסיס לטיפול חלופי במינונים נאותים של גלוקוקורטיקואידים.

כמעט שליש מחולי שחפת ריאתית סובלים מרמת אינסולינמיה נמוכה המתקרבת לגבול התחתון של הנורמה, בעוד של-13-20% יש היפר-אינסוליניזם משמעותי. הן היפו-אינסוליניזם יחסי והן היפר-אינסוליניזם הם גורמי סיכון גבוהים להתפתחות הפרעות בחילוף החומרים של פחמימות בדרגות חומרה משתנות. שינויים אלה בפעילות התפקודית של תאי B בלבלב דורשים ניטור קבוע של גליקמיה בחולים עם שחפת ומניעה בזמן של סוכרת. בנוסף, זה משמש כהצדקה נוספת להתאמת השימוש במינונים פיזיולוגיים של אינסולין בטיפול המורכב בשחפת.

באופן כללי, הירידה ברמות הורמוני בלוטת התריס, חוסר האיזון שלהם, היפרקורטיזולמיה והיפר-אינסוליניזם בולטים ביותר בחולים עם מהלך חמור של תהליך השחפת, עם נגעים ריאתיים נרחבים ותסמינים בולטים של הרעלת שחפת.

אבחון מיקרוביולוגי של שחפת

מחקרים מיקרוביולוגיים נחוצים לזיהוי חולי שחפת, אימות האבחון, ניטור ותיקון כימותרפיה, הערכת תוצאות טיפול, במילים אחרות, מרגע רישום חולה שחפת ועד להסרתו מהרישום.

כל התוכניות והפרויקטים האפידמיולוגיים מבוססים על הערכת מספר מפרישי החיידקים, דבר שאי אפשר לעשות ללא שימוש בשיטות מעבדה לאיתור מיקובקטריה של שחפת. בבחינת המשיכה של האוכלוסייה הלא מאורגנת, אחוז מפרישי החיידקים מגיע ל-70 ומעלה, מה שהופך את שיטות המעבדה לאמצעי יעיל למדי לזיהוי חולי שחפת בקרב קבוצת אוכלוסייה זו.

שיטות מיקרוביולוגיות מסורתיות לאבחון שחפת הן מחקרים בקטריוסקופיים ומחקרים תרביתיים. שיטות מודרניות כוללות גידול מיקובקטריות שחפת במערכות אוטומטיות ו-PCR. עם זאת, כל השיטות הללו משולבות בהכרח עם שיטות בקטריולוגיות קלאסיות.

איסוף חומר אבחוני

יעילותן של בדיקות מעבדה תלויה במידה רבה באיכות חומר האבחון. עמידה בכללי איסוף, אחסון והובלת חומר אבחון ויישום מדויק של אלגוריתם בדיקת המטופל משפיעים ישירות על התוצאה ומבטיחים בטיחות ביולוגית.

מגוון חומרים משמשים לבדיקת שחפת. מאחר ששחפת ריאתית היא הצורה הנפוצה ביותר של זיהום שחפתי, החומר העיקרי לבדיקה נחשב לכיח וסוגים אחרים של הפרשות מעץ הנשימה הטרוכיאו-ברונכיאלי: הפרשות מדרכי הנשימה העליונות המתקבלות לאחר שאיפת אירוסול: מי שטיפת סימפונות; שטיפות סימפונות-אלוואולריות; חומר המתקבל במהלך ברונכוסקופיה, ביופסיה טרנס-קנית ותוך-ריאתית: שאיבת סימפונות, מריחות גרון, אקסודטים, מריחות פצעים וכו'.

יעילות המחקר עולה אם מתבצע איסוף מבוקר של חומר מהמטופל. לשם כך, מוקצה חדר מאובזר במיוחד או נרכשים תאים מיוחדים. איסוף חומר הוא הליך מסוכן, לכן יש לאסוף חומר למחקר בהתאם לכללי בטיחות הזיהום.

חומר לבדיקת Mycobacterium tuberculosis נאסף בבקבוקונים סטריליים עם פקקים מהודקים היטב כדי למנוע זיהום הסביבה ולהגן על החומר שנאסף מפני זיהום.

בקבוקונים לאיסוף חומר אבחוני חייבים לעמוד בדרישות הבאות:

• חייב להיות עשוי מחומר עמיד בפני פגיעות;
• אמור להינמס בקלות בעת חימום באוטוקלב;
• שיהיה בנפח מספיק (40-50 מ"ל):
• בעל פתח רחב לאיסוף כיח (קוטר לא פחות מ-30 מ"מ);
• להיות קל לטיפול, שקוף או שקוף למחצה, כך שניתן יהיה להעריך את כמות ואיכות הדגימה שנאספה מבלי לפתוח את המכסה.

כדי להשיג תוצאות מחקר אופטימליות, יש לעמוד בתנאים הבאים:

• יש לאסוף חומר לפני תחילת הכימותרפיה;
• יש לאסוף את החומר למחקר לפני האכילה או נטילת תרופות בבוקר;
• לצורך המחקר, מומלץ לאסוף לפחות 3 דגימות כיח בבוקר. הכיח נאסף במשך 3 ימים רצופים;
• יש להעביר את החומר שנאסף למעבדה במהירות האפשרית:
• במקרים בהם לא ניתן לספק את החומר למעבדה באופן מיידי, הוא מאוחסן במקרר בטמפרטורת אוויר של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ-48 שעות;
• בעת הובלת החומר, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשלמות הבקבוקים.

ליחה שנאספה כהלכה היא בעלת אופי רירי או מוגלתי. הנפח האופטימלי של חלק הליחה הנבדק הוא 3-5 מ"ל.

איסוף ליחה מתבצע תחת פיקוחו של עובד בריאות. האחראים על איסוף ליחה חייבים לוודא כי מקפידים על כללים מסוימים:

• יש להסביר למטופל את מטרת הבדיקה ואת הצורך להשתעל לא רוק או ריר מהאף והלוע, אלא את תוכן החלקים העמוקים של דרכי הנשימה. ניתן להשיג זאת כתוצאה משיעול פרודוקטיבי המופיע לאחר מספר (2-3) נשימות עמוקות. כמו כן, יש להזהיר את המטופל שעליו לשטוף תחילה את פיו במים רותחים כדי להסיר את החלק העיקרי של המיקרופלורה הצומחת בחלל הפה ושאריות מזון המסבכות את בדיקת הליחה;
• העובד הרפואי המעורב באיסוף ליחה, בנוסף לחלוק וכובע, חייב לעטות מסכה, כפפות גומי וסינר גומי;
• כשהוא עומד מאחורי המטופל, מומלץ לו להחזיק את הבקבוק קרוב ככל האפשר לשפתיו ולהפריד מיד את הליחה לתוכו בזמן שהוא משתעל, תוך כדי שהוא צריך לוודא שזרימת האוויר מופנית הרחק מעובד הבריאות:
• לאחר השלמת איסוף הליחה, על עובד הבריאות לסגור בזהירות את הבקבוק עם המכסה ולהעריך את כמות ואיכות הליחה שנאספה. לאחר מכן, הבקבוק מתויג ומוכנס לקופסה מיוחדת להובלה למעבדה.

אם המטופל אינו מייצר ליחה, אז בלילה שלפני כן ובשעות הבוקר המוקדמות ביום איסוף החומר, יש לתת לו מכייח: תמצית שורשי המרשמלו (מוקלטין), ברומהקסין, אמברוקסול וכו' - או להשתמש בשאיפה מגרה, תוך שימוש בציוד המותקן בחדר לאיסוף ליחה. החומר שנאסף בדרך זו אינו כפוף לשימור ויש לבדוק אותו ביום האיסוף. כדי למנוע "דחייתו" במעבדה, יש לרשום הערה מיוחדת בהפניה.

אם לא מבוצעים בדיקות מיקרוביולוגיות במוסד נתון, יש להעביר את חומר האבחון שנאסף למעבדה באופן מרכזי, ובלבד שהחומר נשמר במקרר או עם חומרים משמרים בין משלוחים. החומר מועבר למעבדה בקופסאות הובלה הניתנות לחיטוי בקלות. יש לצרף כל דגימה עם תווית מתאימה, ולכל האצווה יש לצרף טופס נלווה מלא.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

אופני ותדירות בדיקת חולים

במהלך הבדיקה הראשונית, המכונה אבחון, של חולה לשחפת, יש צורך לבדוק לפחות 3 מנות של כיח שנאספו תחת פיקוח של צוות רפואי במשך יומיים או 3, מה שמגביר את יעילות המיקרוסקופיה.

בדיקות סקר ראשוניות לשחפת צריכות להתבצע על ידי כל המוסדות הרפואיים והאבחוניים של מערכת הבריאות. לאחרונה, על מנת להגביר את יעילות הבדיקה הראשונית, אורגנו מרכזי מיקרוסקופיה המבוססים על מעבדות אבחון קליניות, המצוידות במיקרוסקופים וציוד מודרניים להבטחת בטיחות מפני מגפות.

מוסדות לטיפול בשחפת משתמשים בתוכנית סקר המספקת בדיקה של כיח או חומר אבחוני אחר לפחות 3 פעמים תוך 3 ימים. במהלך הטיפול, בדיקות מיקרוביולוגיות מתבצעות באופן קבוע לפחות פעם בחודש בשלב הכימותרפיה האינטנסיבית. במעבר לשלב המעקב, המחקרים מתבצעים בתדירות נמוכה יותר - במרווחים של 2-3 חודשים, בעוד שתדירות המחקרים מצטמצמת לשניים.

מאפייני איסוף חומר אבחוני לשחפת חוץ-ריאתית

מאפיין של חומר פתולוגי בצורות חוץ-ריאתיות של שחפת הוא הריכוז הנמוך של שחפת מיקובקטריה בו, הדורש שיטות רגישות יותר של מחקר מיקרוביולוגי, בעיקר שיטות של זריעה על מצע מזין.

במקרה של שחפת גניטורינארית, שתן הוא החומר הנגיש ביותר לבדיקה. איסוף השתן צריך להתבצע על ידי אחות שהוכשרה במיוחד.

איברי המין החיצוניים נשטפים במים וסבון או בתמיסה חלשה של אשלגן פרמנגנט. הפתח החיצוני של השופכה מטופל בזהירות. החלק האמצעי של שתן הבוקר נאסף בבקבוק סטרילי: אצל גברים - באופן טבעי, אצל נשים - באמצעות קטטר. שתן מאגן הכליה נאסף במבחנות סטריליות במהלך צנתור של כליה אחת או שתיים, במקרה האחרון - בהכרח בנפרד מכל כליה. כמות קטנה של שתן זה עוברת צנטריפוגה, והמשקע נבדק.

אצל גברים, זרע, דקירות אשכים והפרשות הערמונית עוברות צנטריפוגה כדי לקבל משקע. עם כל לוקליזציה של תהליך ספציפי באזור איברי המין אצל גברים, עיסוי הערמונית יכול לקדם את שחרור ההפרשות המכילות מיקובקטריה של שחפת.

דם וסת נאסף מנשים על ידי שאיבה או באמצעות כובע קפקא. החומר המתקבל מנקה את הדם האדום-ציטי על ידי שטיפה במים מזוקקים ולאחר מכן צנטריפוגה. המשקע נבדק.

הפרשות מתעלת צוואר הרחם נאספות בכלי כלשהו או בכובע קפקא, כלומר, רצוי לצבור 1-2 מ"ל של חומר פתולוגי.

חומר שהתקבל במהלך התערבויות כירורגיות בכליות, באיברי המין, ביופסיות, גירוד רירית הרחם, עובר הומוגניזציה. לשם כך, הוא מונח במכתש סטרילי ונמעך היטב בעזרת מספריים סטריליות. חול נהר סטרילי מוסיף לתרחיף המתקבל בכמות השווה למסה שלו, לאחר מכן מוסיפים 0.5-1.0 מ"ל של תמיסת נתרן כלורי איזוטונית והכל נטחן עד שנוצרת מסה רכה בעזרת תמיסת נתרן כלורי איזוטונית (4-5 מ"ל). לאחר מכן, המסה נותנת לשקוע למשך 1-1.5 דקות, והנוזל העליון נבדק.

שחפת של עצמות ומפרקים. הדקירה (מוגלה ממורסות) המתקבלת באמצעות מזרק סטרילי מונחת במיכל סטרילי ומועברת מיד למעבדה. בעזרת פיפטה סטרילית, שהורטבה מראש בתמיסת נתרן כלורי איזוטונית סטרילית, נלקחים 2-5 מ"ל של מוגלה, מועברים לבקבוק עם חרוזים ומוסיפים עוד 2-3 מ"ל של תמיסת נתרן כלורי איזוטונית. הבקבוק נסגר בפקק ומנער במטלית במשך 8-10 דקות. התרחיף ההומוגני נבדק.

בצורות פיסטוליות של שחפת אוסטאוארטיקולרית, מוגלה נלקחת מהפיסטולה. הפרשה שופעת נאספת ישירות למבחנה. במקרים של הפרשה מוגלתית דלה, צינור הפיסטולה נשטף בתמיסת נתרן כלורי איזוטונית סטרילית, והשטיפות שנאספו במבחנה או בחתיכת טמפון ספוגה במוגלה נשלחות לבדיקה.

חומר כירורגי המתקבל במהלך התערבויות כירורגיות בעצמות ובמפרקים עשוי להיות מורכב מגושים מוגלתיים-נמקיים, גרגירים, רקמת צלקת, רקמת עצם, רקמת קרום סינוביאלי ומצעים אחרים. עיבודו מתבצע כמו במקרה של שחפת כלייתית.

בדיקה מיקרוביולוגית של נוזל סינוביאלי בתמיסת נתרן ציטרט 3% (ביחס של 1:1) למניעת קרישה מתבצעת מיד לאחר הניקוב.

שחפת של בלוטות הלימפה. מוגלה המופקת במהלך ניקוב בלוטות הלימפה נבדקת באותו אופן כמו מוגלה ממורסות. רקמת בלוטות הלימפה המתקבלת במהלך התערבויות כירורגיות וביופסיות נבדקת כמו בצורות אחרות של שחפת.

מחקר הצואה עבור Mycobacterium tuberculosis מתבצע לעתים רחוקות ביותר עקב היעדר כמעט מוחלט של תוצאות חיוביות.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

מיקרוסקופיה של מיקובקטריה

מיקרוסקופיית כיח היא שיטה מהירה, פשוטה וזולה יחסית, שיש להשתמש בה בכל המקרים בהם קיים חשד לשחפת. בנוסף, מחקר זה מבוצע כדי להעריך את יעילות הכימותרפיה ולאשר החלמה או כישלון טיפול בהיעדר תוצאות תרבית.

שתי שיטות לבדיקה מיקרוסקופית משמשות:

• שיטת מיקרוסקופיה ישירה, כאשר מכינים כתם ישירות מחומר האבחון;
• שיטה למיקרוסקופיה של משקעים שהוכנו מחומר שטופל בחומרי חיטוי למחקר תרבותי.

השיטה הראשונה משמשת במעבדות בהן מתבצעים רק מחקרים מיקרוסקופיים (מעבדות אבחון קליניות של הרשת הרפואית הכללית).

התוצאות הטובות ביותר של בדיקה מיקרוסקופית מתקבלות על ידי ריכוז החומר האבחוני (לדוגמה, על ידי צנטריפוגה).

על מנת לזהות את חיידק השחפת (Mycobacterium tuberculosis) בהסתברות של 50% באמצעות מיקרוסקופיה, 1 מ"ל של כיח חייב להכיל יותר מ-5,000 תאים מיקרוביאליים. כיח מחולים עם צורות ריאתיות של שחפת מכיל בדרך כלל מספר משמעותי של חיידקים חזקים בחומצה, מה שמאפשר לזהות אותם באופן אמין באמצעות בקטריוסקופיה. ניתן להגביר את הרגישות האבחנתית של שיטה זו על ידי בדיקת מספר דגימות כיח מחולה אחד. תוצאה שלילית בבדיקה בקטריוסקופית אינה שוללת את אבחנת השחפת, מכיוון שהכיח של חלק מהחולים מכיל פחות Mycobacterium ממה שניתן לזהות באמצעות מיקרוסקופיה. הכנה לקויה של מריחות כיח יכולה גם היא להיות סיבה לתוצאה שלילית בבדיקה בקטריוסקופית.

השיטה הנפוצה ביותר לגילוי חיידקי מיקובקטריה עמידים לחומצה במריחה היא צביעת זיהל-נילסן. השיטה מבוססת על חדירת קרבול פוקסין לתא מיקרוביאלי דרך ממברנה הכוללת שכבת שעווה-ליפידים, עם השפעה בו זמנית של חימום ופעולת איכול חזקה של פנול. דהיית צבע לאחר מכן של המריחה עם תמיסה של 25% של חומצה גופרתית או אלכוהול הידרוכלורי 3% מובילה לדהיית צבע של כל המבנים שאינם עמידים לחומצה. האלמנטים המפושטים של המריחה נצבעים בתמיסה של 0.3% של כחול מתילן. חיידקים אינם תופסים צבעי אנילין קונבנציונליים, וכתוצאה מכך חיידקים עמידים לחומצה נצבעים באדום פטל, ומיקרובים ואלמנטים תאיים אחרים נצבעים בכחול.

כדי לבחון מריחות שנצבעו לפי שיטת זיהל-נילסן, יש להשתמש במיקרוסקופ דו-עיני אור עם עדשת טבילה (הגדלה פי 90 או 100) ועינית עם הגדלה פי 7 או 10. נבדקים 100 שדות ראייה, המספיקים לגילוי מיקובקטריה בודדת במריחה. אם תוצאת בדיקה כזו שלילית, מומלץ לבחון 200 שדות ראייה נוספים לאישור. התוצאות נרשמות, המציינות את מספר המיקובקטריות החומציות (AFB) שזוהו.

בנוסף לשיטה זו, צביעת פלואורוכרום משמשת למיקרוסקופיה זוהרת, המאפשרת השגת התוצאות הטובות ביותר. השימוש בשיטה זו מגביר את יעילות המיקרוסקופיה ב-10-15%. כאשר מטפלים במיקובקטריה בצבעים זוהרים (אורמין, רודמין וכו'), חומרים אלה נקשרים גם למבנים דמויי השעווה של התא המיקרוביאלי. כאשר תאים צבועים מוקרנים במקור אור מעורר (ספקטרום מסוים של קרינה אולטרה סגולה), הם מתחילים לזהור בכתום או אדום בוהק על רקע שחור או ירוק כהה. בשל הבהירות והניגודיות הגבוהות של התמונה הנראית, ניתן להפחית את ההגדלה הכוללת של המיקרוסקופ פי 4-10, מה שמרחיב את שדה הראייה ומקצר את זמן הצפייה בתכשיר. יחד עם זאת, בשל עומק השדה הגדול משמעותית, ניתן להגביר את נוחות המחקר.

בעת שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי, צפייה באותו אזור של כתם אורכת זמן קצר משמעותית מאשר מיקרוסקופ אור של מריחות צבועות לפי זיהל-נילסן. אם מיקרוסקופיסט צופה בכ-20-25 מריחות כאלה במהלך יום עבודה, אז בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא יכול לבחון יותר מ-60-80 דגימות בו זמנית. מיקרוסקופיסטים מנוסים יודעים שצביעת תאים בתערובת של אורמין ורודאמין היא במידה מסוימת ספציפית למיקובקטריה חומצית, שבמקרה זה יש להן מראה של מקלות זהובים. ספרופיטים צבועים בירקרק.

יתרון חשוב נוסף של שיטת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה הוא היכולת לזהות מיקובקטריות שעברו שינוי שאיבדו את תכונותיהן עמידות לחומצה תחת השפעת מספר גורמים שליליים, בפרט כימותרפיה אינטנסיבית, ולכן אינן מזוהות על ידי צביעת זיהל-נילסן.

החסרונות של שיטת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה כוללים את העלות הגבוהה יחסית של המיקרוסקופ ותפעולו. עם זאת, במעבדות מרכזיות או גדולות אחרות, שבהן עומס העבודה עולה על הנורמה של שלושה טכנאי מעבדה העובדים עם שלושה מיקרוסקופים קונבנציונליים, זול יותר להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה אחד במקום זאת.

לשיטות בקטריוסקופיות יש ספציפיות גבוהה למדי (89-100%). כ-97% מהתוצאות החיוביות המתקבלות בכל שיטת מיקרוסקופיה מאושרות בבירור על ידי תוצאות הזריעה.

יש לציין כי בדיקה מיקרוסקופית של כתם של חומר פתולוגי אינה מאפשרת לקבוע את מין המיקובקטריה העמידה לחומצה שהתגלתה. השיטה המיקרוסקופית מאפשרת להסיק מסקנה רק לגבי נוכחות או היעדרות של מיקרואורגניזמים עמידים לחומצה בתכשיר, דבר המוסבר על ידי קיומם בטבע של מספר רב של מיקרואורגניזמים עמידים לחומצה שאינם שחפתיים הדומים מורפולוגית למיקובקטריה של קומפלקס השחפת.

הערכת תוצאות המיקרוסקופיה מתבצעת ביחידות כמותיות למחצה.

על מנת שניתן יהיה להשוות את התוצאות של שיטות מיקרוסקופיות שונות, מוצגים מקדמים אמפיריים. לדוגמה, כדי להשוות את תוצאות כתם צבוע בצבעים פלואורסצנטיים עם נתוני מחקר מיקרוסקופ אור (בהגדלה פי 1000), יש לחלק את מספר המיקובקטריות החומציות שזוהו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי במקדם המתאים: בהגדלה פי 250 של המיקרוסקופ - ב-10, בהגדלה פי 450 - ב-4, בהגדלה פי 630 - ב-2.

מאפייני מיקרוסקופיה בשחפת חוץ-ריאתית

מבוצעת מיקרוסקופיה ישירה, כמו גם מיקרוסקופיה של מריחות שהוכנו לאחר העשרה עם צביעה שלאחר מכן לפי Ziehl-Neelsen או צבעי פלואורסצנט. מיקרוסקופיה ישירה של מריחות אינה יעילה עקב ריכוז נמוך של מיקובקטריה בחומר, ולכן רציונלי יותר להשתמש בשיטות העשרה. צנטריפוגה היא היעילה ביותר. אם החומר הביולוגי צמיג, נעשה שימוש בצנטריפוגה עם הומוגניזציה והנזלה בו זמנית של החומר, המבוצעת באמצעות צנטריפוגות במהירות גבוהה עם כוח צנטריפוגה של 3000 גרם ותמיסות היפוכלוריט. שיטות העשרה אחרות, כגון מיקרופלוטציה, אינן בשימוש כיום עקב היווצרות אירוסולים מסוכנים ביולוגית.

[ 37 ]

שיטת תרבית לאבחון שחפת

שיטת הזריעה, או שיטת התרבית, רגישה יותר ממיקרוסקופיית מריחה ויש לה מספר יתרונות על פני האחרונה. היא מאפשרת לזהות כמה עשרות מיקובקטריות חיות בחומר הנבדק ובעלת ערך אבחוני גבוה. זה חשוב במיוחד בבדיקת חומר מחולים שאובחנו לאחרונה או טופלו ומפרישים מספר קטן של מיקובקטריות.

בהשוואה למיקרוסקופיה, מחקר תרבית מאפשר להגדיל את מספר חולי השחפת שזוהו ביותר מ-15-25%, וכן לאמת שחפת בשלבים מוקדמים יותר, כאשר המחלה עדיין ניתנת לטיפול בקלות. יתרון חשוב מאוד של מחקר תרבית נחשב לאפשרות להשיג תרבית פתוגן, שניתן לזהות ולחקור אותה ביחס לרגישות לתרופה, ארסיות ותכונות ביולוגיות אחרות.

החסרונות של שיטות הגידול כוללים את משך הזמן שלהן (תקופת ההמתנה לחומרים מגיעה ל-10 שבועות), עלות גבוהה יותר ומורכבות עיבוד חומר אבחוני.

עקרונות הטיפול טרום זריעה בחומר אבחוני

לא ניתן להשתמש בשיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונליות לביצוע בדיקות שחפת. זאת בשל העובדה שמיקובקטריה של שחפת גדלה לאט מאוד, ורוב הדגימות הקליניות מכילות מיקרואורגניזמים ופטריות פיוגניים ונרקבים הגדלים במהירות. גידולם המהיר על מצע עשיר בחומרי הזנה מפריע להתפתחות המיקובקטריה ואינו מאפשר לבודד את פתוגן השחפת, לכן יש לטפל מראש בחומר האבחון לפני הזריעה. בנוסף, מיקובקטריה המשתחררת מדרכי הנשימה של המטופל מוקפת בדרך כלל בכמות גדולה של ריר, מה שמקשה על ריכוזה. בהקשר זה, לפני זריעת כיח וחומרים דומים אחרים, יש לנזל אותם ולחטא אותם.

לכל חומרי הניקוי והחומר לניקוי זיהומים יש השפעה רעילה פחות או יותר בולטת על חיידקי מיקובקטריה. כתוצאה מהטיפול, עד 90% מהחיידקים עלולים למות. על מנת לשמר חלק מספיק מאוכלוסיית החיידקים המיקובקטריאליים, יש צורך להשתמש בשיטות טיפול עדינות המאפשרות, מצד אחד, לדכא מיקרואורגניזמים פיוגניים ונרקבים הגדלים במהירות, ומצד שני, לשמר באופן מקסימלי את הכדאיות של חיידקי מיקובקטריה הקיימים בחומר.

בהתאם לחומר, להומוגניות שלו ולרמת הזיהום שלו, משתמשים בחומרי חיטוי שונים לטיפול טרום זריעה: עבור כיח - תמיסת נתרן הידרוקסיד 4%, תמיסות טריסודיום פוספט 10%, בנזלקוניום כלוריד טריסודיום פוספט, NALC-NaOH (N-אצטיל-L-ציסטאין-נתרן הידרוקסיד) עם ריכוז NaOH סופי של 1%, עבור שתן וחומרים נוזליים אחרים - תמיסת חומצה גופרתית 3%, עבור דגימות מזוהמות, חומרים המכילים שומן - תמיסת חומצה אוקסלית עד 5%. בנוסף, במקרים מסוימים, משתמשים באנזימים ובחומרים פעילי שטח (דטרגנטים). השימוש ב-Tween ובחומרי ניקוי אחרים מלווה במוות נמוך יותר של תאים מיקובקטריאליים (40-50% שורדים). עם זאת, ניתן להשתמש בהם רק עבור חומרים נוזליים. NALC-NaOH, המיוצר בערכות, הוא הנפוץ ביותר בעולם. שיטה זו מאפשרת לבודד יותר מ-85% מאוכלוסיית תאי המיקובקטריאלים. ניקוי חומרים מוצקים המכילים רקמות קשה יותר, מכיוון שקשה לנחש את מידת הפיזור של החומר במהלך ההומוגניזציה. לדוגמה, עיבוד ביופסיות של בלוטות הלימפה מלווה לעיתים קרובות בתדירות מוגברת של זיהום עם פלורה זרה. במקרה זה, ניתן להשתמש ב-1% אטוןיום.

חומר לא הומוגני עובר הומוגניזציה באמצעות חרוזי זכוכית בנוכחות חומרי חיטוי. חומרים נוזליים עוברים צנטריפוגה מקדימה ורק המשקע עובר עיבוד.

טכניקת זריעה ודגירה

לאחר עיבוד מקדים, החומר עובר צנטריפוגה, מה שגורם לשקיעה של המיקובקטריה ולהגדלת תכולתן במשקע ("העשרת משקע"). המשקע המתקבל מנוטרל ומוחדר על פני מצע תזונתי צפוף או מבחנות עם מצע נוזלי (חצי נוזלי). מריחות לבדיקה מיקרוסקופית מוכנות מהמשקע הנותר. טכניקת הזריעה חייבת למנוע זיהום צולב של חומר האבחון.

לצורך פרשנות קלינית אמינה של תוצאות המחקר המיקרוביולוגי, יש להקפיד על הכלל הבא: יש לבצע מחקרים מיקרוסקופיים ותרבותיים במקביל מאותה דגימה של חומר אבחוני.

המבחנות המוזרקות ממוקמות בתרמוסטט בטמפרטורה של 37 ^מעלות צלזיוס למשך יומיים במצב אופקי. זה מבטיח ספיגה אחידה יותר של החומר לתוך המצע התזונתי. לאחר יומיים, המבחנות מועברות למצב אנכי ונאטמות הרמטית באמצעות פקקי גומי או סיליקון כדי למנוע מהמצע המוזרק להתייבש.

הגידולים נשמרים בתרמוסטט בטמפרטורה של 37 ^מעלות צלזיוס למשך 10-12 שבועות עם בדיקה שבועית קבועה. הפרמטרים הבאים נרשמים בכל בדיקת בקרה:

• תקופת צמיחה ניתנת לצפייה ויזואלית מיום הזריעה;
• קצב גדילה (מספר CFU);
• זיהום התרבית בפלורה או פטריות מיקרוביאליות זרות (מבחנות כאלה מוסרות);
• אין צמיחה נראית לעין. הצינורות נשארים בתרמוסטט עד לבדיקה הבאה.

מדיה מזינה

מגוון מצע הזנה משמש לגידול מיקובקטריה: מוצק, נוזלי למחצה, נוזלי. עם זאת, לאף אחד ממצעי ההזנה הידועים אין תכונות המבטיחות את גידול כל תאי המיקובקטריה. בהקשר זה, כדי לשפר את היעילות, מומלץ להשתמש בו זמנית ב-2-3 מצע הזנה בעלי הרכבים שונים.

כמדיום סטנדרטי לבידוד ראשוני של פתוגן השחפת וקביעת רגישותו לתרופה, ארגון הבריאות העולמי ממליץ על מצע לוונשטיין-ינסן. זהו מצע ביצים צפוף עליו מתקבלת גדילת מיקובקטריה ביום ה-20-25 לאחר זריעת חומר חיובי בקטריוסקופית. זריעת חומר שלילי בקטריוסקופית דורשת תקופת דגירה ארוכה יותר (עד 10-12 שבועות).

בארצנו, מצע הביצים Finn-II שהוצע על ידי ER Finn הפך נפוץ. הוא שונה בכך שבמקום L-אספרגין, הוא משתמש בנתרן גלוטמט, אשר מפעיל מסלולים אחרים לסינתזה של חומצות אמינו במיקובקטריה. הצמיחה מופיעה במצע זה מוקדם יותר, ותדירות בידוד המיקובקטריה גבוהה ב-6-8% מאשר במצע Lowenstein-Jensen.

כדי להגביר את יעילות האבחון הבקטריולוגי של שחפת חוץ-ריאתית, מומלץ לכלול מצע Finn-II שעבר שינוי בקומפלקס מצע התזונה. כדי להאיץ את הצמיחה, מוחדר בנוסף 0.05% נתרן תיוגליקולט למצע התזונה Finn-II, מה שמפחית את ריכוז החמצן. כדי להגן על מערכות האנזימים של מיקובקטריה מתוצרים רעילים של חמצון שומנים, מוחדר נוגד החמצון α-טוקופרול אצטט למצע התזונה Finn-II בריכוז של 0.001 מיקרוגרם/מ"ל. חומר האבחון זורע בשיטה הסטנדרטית.

במעבדות נגד שחפת ברוסיה, נעשה שימוש גם בשינויים אחרים של מדיה מזינה צפופה: מדיה מזינה "נוביה" שהוצעה על ידי ג'.ג'. מורדובסקי, מדיה מזינה A-6 ו-A-9 שפותחה על ידי ו'.א. אניקין, וכו'.

בשל העובדה שבמהלך כימותרפיה, נגרם נזק למערכות מטבוליות שונות של התא המיקובקטריאלי, חלק מאוכלוסיית המיקובקטריאלים מאבדת את היכולת להתפתח כרגיל על גבי מצע תזונתי קונבנציונלי וזקוקה למצע תזונתי מאוזן אוסמוטית (נוזלי למחצה או נוזלי).

הערכה ורישום תוצאות תרבית חומרי אבחון

זנים וסוגים מסוימים של מיקובקטריה גדלים לאט, צמיחה עשויה להופיע אפילו עד היום ה-90. מספר התרבויות הללו קטן, אך זה מאלץ את הזריעה להישמר בתרמוסטט במשך 2.5-3 חודשים.

תרבויות אלימות של Mycobacterium tuberculosis גדלות בדרך כלל על מצע ביצים מוצק כמושבות בצורת R בגודל ובמראה משתנים. המושבות יבשות, מקומטות, בצבע שנהב ומעט פיגמנטיות. על מצע אחר, מושבות Mycobacterium tuberculosis עשויות להיות לחות יותר. לאחר טיפול כימותרפי או במהלך טיפול, ניתן לבודד מושבות חלקות עם צמיחה לחה (צורות S).

בעת בידוד תרבויות, משתמשים במערכת של מחקרים מיוחדים כדי להבחין בין מיקובקטריה של שחפת לבין מיקובקטריה לא-שחפתית וספרופיטים מהירי חומצה.

תשובה חיובית ניתנת לאחר בדיקה מיקרוסקופית חובה של כתם מהמושבות הגדלות, צבועות לפי שיטת זיהל-נילסן. במקרה של גידול מיקובקטריה, נמצאים מוטות אדומים בהירים בכתם, הנמצאים בנפרד או בקבוצות, ויוצרים אשכולות בצורת לבד או צמות. בתרבויות צעירות, במיוחד אלו שבודדו מחולים שטופלו בכימותרפיה במשך זמן רב, מיקובקטריה נבדלת על ידי פולימורפיזם בולט, עד לנוכחות של וריאנטים קצרים, כמעט קוקואידיים או מוארכים הדומים לתפטיר פטרייתי, יחד עם צורות בצורת מוט.

עוצמת הגדילה של חיידקים נקבעת לפי הסכימה הבאה: (+) - 1-20 CFU במבחנה (הפרשה חיידקית נמוכה); (++) - 20-100 CFU במבחנה (הפרשה חיידקית בינונית); (+++) - >100 CFU במבחנה (הפרשה חיידקית בשפע). באבחון מעבדתי של שחפת, לא מספיק לתת תשובה המציינת האם זוהו חיידקים בשיטה מסוימת או לא. כמו כן, יש צורך במידע מפורט על נפח ואופי אוכלוסיית החיידקים, הרכבה ותכונותיה. נתונים אלה הם המאפשרים לפרש נכון את מצב התהליך, לתכנן טקטיקות ולהתאים את הטיפול במהירות.

בשנים האחרונות הוצעו מצע גידול מבוסס אגר עם תוספי גידול שונים ושימוש בתערובת גז מיוחדת כדי להאיץ את גדילת המיקובקטריה. כדי להשיג את גדילת המיקובקטריה במצעים אלה, נוצרת במהלך הגידול אטמוספרה עם תכולה מוגברת של פחמן דו-חמצני (4-7%). למטרה זו נעשה שימוש באינקובטורים מיוחדים של CO2 _. עם זאת, מערכות גידול אוטומטיות של מיקובקטריה זכו לפיתוח הגדול ביותר: MGIT-BACTEC-960 ו-MB/Bact.

אחת ממערכות כאלה היא מערכת MGIT (צינור המציין גדילה של מיקובקטריה), שהיא פיתוח היי-טק ומיועדת לאבחון בקטריולוגי מואץ של שחפת ולקביעת רגישות מיקובקטריה לתרופות קו ראשון ולתרופות קו שני מסוימות. MGIT מיועדת לשימוש כחלק ממכשיר VASTEC-960. מיקרואורגניזמים מגודלים במבחנות מיוחדות עם מצע תזונתי נוזלי המבוסס על מצע Middlebrook-7H9 שעבר שינוי. כדי לעורר את צמיחת המיקובקטריה ולדכא את צמיחת המיקרופלורה הזרה, משתמשים בתוסף MGIT Growth Supplement ובתערובת של תרופות אנטיבקטריאליות PANTA.

רישום גידול מיקרואורגניזמים מתבצע באופן אופטי. הוא מבוסס על פלואורסצנציה, המתרחשת כאשר מיקובקטריות צורכות חמצן במהלך גידולן. צבע פלואורוכרום תלוי חמצן נמצא בתחתית מבחנה מיוחדת ומכוסה בשכבת סיליקון. רביית המיקובקטריות מובילה לירידה בכמות החמצן במבחנה ולירידה בריכוזה, מה שגורם לעלייה בפלואורסצנציה, אשר הופכת לגלויה כאשר המבחנה מוקרנת באור אולטרה סגול ונרשמת אוטומטית על ידי חיישני פוטו המובנים במכשיר VASTES-960. עוצמת האור נרשמת ביחידות גידול (GU). נתוני הגידול מוזנים אוטומטית למחשב, שם ניתן לשמור אותם. ניתוח ממוחשב של עקומות גידול יכול לספק מידע על נוכחות של מאגרי מיקובקטריות שונים, כולל כאלה שאינן שחפתיות, וגם מסייע בהערכת תכונות הגידול של המיקובקטריות.

כתוצאה מהכנסתן של מערכות כאלה, זמן גדילת המיקובקטריה קוצר משמעותית, עם ממוצע של 11 ימים ב-VASTEC-960 ו-19 ימים ב-MB/Bact לעומת 33 ימים במצע תזונתי צפוף סטנדרטי. יש לציין כי מערכות אלו דורשות כוח אדם מוסמך ביותר. זריעת החומר על מצע נוזלי מלווה בהכרח בזריעה על מצע לוונשטיין-ינסן, אשר ממלא תפקיד של גיבוי במקרים בהם מיקובקטריה של שחפת אינה גדלה על מצע אחר.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

קביעת רגישות לתרופות של מיקובקטריות

קביעת הספקטרום ומידת הרגישות של מיקובקטריה לתרופות נגד שחפת היא בעלת חשיבות קלינית רבה, כמו גם להערכה אפידמיולוגית של התפשטות שחפת עמידה לתרופות. בנוסף, ניטור עמידות לתרופות מאפשר לנו להעריך את יעילות התוכנית נגד שחפת בכללותה, בהיותה אינדיקטור בלתי נפרד לעבודת כל מרכיבי האמצעים נגד שחפת.

תדירות ועיתוי של בדיקות רגישות לתרופות:

• לפני תחילת הטיפול, פעם אחת כדי לקבוע את אסטרטגיית הטיפול והטקטיקות:
• כאשר מבודדים תרביות מחומרים שונים מחולה (ליח, BAL, שתן, אקסודטים, נוזל מוחי שדרתי וכו'), נבדקים כל הזנים המבודדים:
• בסוף השלב האינטנסיבי של הטיפול בהיעדר דינמיקה קלינית ורדיולוגית:
• אם יש צורך לשנות את משטר הטיפול במקרה של:
  • היעדר שליליות של כיח;
  • תרבית מחדש לאחר שליליות של כיח;
  • עלייה חדה בכמות ה-AFB במריחה לאחר ירידה ראשונית. ידוע היטב כי זנים של Mycobacterium tuberculosis בעלי רגישות שונה לתרופות מבודדים מחומר מחולה עם שחפת. רגישות הזנים לתרופות נגד שחפת עשויה להיות שונה בספקטרום התרופות, במידת ההתפתחות, בתדירות ובמהירות התפתחות העמידות.

מידת העמידות לתרופות של Mycobacterium tuberculosis נקבעת בהתאם לקריטריונים שנקבעו, המתמקדים במשמעות הקלינית של העמידות ותלויים בפעילות האנטי-שחפתית של התרופה, בפרמקוקינטיקה שלה, בריכוזה בנגע, במינון הטיפולי המרבי וכו'.

קביעת הרגישות לתרופות של מיקובקטריה מתבצעת כיום באמצעות שיטות מיקרוביולוגיות:

• ריכוזים מוחלטים (שיטת דילול על מצע תזונתי מוצק או נוזלי),
• פרופורציות,
• מקדם ההתנגדות.

בדרך כלל, עמידות מתבטאת בצורה של צמיחה ויזואלית של מושבות של מיקובקטריה שחפת, אולם קיימות שיטות המעוררות צמיחה בשלבים המוקדמים של חלוקת תאים מיקובקטריאליים בצורה של תגובות צבע. שיטות אלו מפחיתות את זמן הבדיקה מ-3-4 לשבועיים.

שיטת הריכוז המוחלט, המומלצת על ידי ועדת הכימותרפיה של ארגון הבריאות העולמי, הפכה נפוצה ברוסיה כשיטה מאוחדת. מנקודת מבט מתודולוגית, זוהי הפשוטה ביותר, אך דורשת סטנדרטיזציה גבוהה ודיוק של הליכי מעבדה. בדיקת הרגישות לתרופות מורכבת מסט של מבחנות עם מצע תזונתי שעבר שינוי בתרופות נגד שחפת. הסט מורכב מ-2-3 מבחנות עם ריכוזים שונים של כל אחת מהתרופות בהן נעשה שימוש, מבחנת בקרה אחת עם מצע ללא התרופה, ומבחנה אחת המכילה 1000 מיקרוגרם/מ"ל נתרן סליצילט או 500 מיקרוגרם/מ"ל חומצה פרניטרובנזואית לגילוי גדילה של מיקובקטריה שאינה שחפתית.

כדי להכין סט של מצע עם תכשירים, יש להשתמש במצע לוונשטיין-ינסן שעבר שינוי (ללא עמילן), אשר מוזג לתוך צלוחיות. כמות מסוימת של המדילול המתאים של התרופה נגד שחפת מוסיפה לכל אחת מהצלוחיות. תוכן הצלוחיות מעורבב היטב, מוזג למבחנות ומקריש במצב נוטה למשך 40 דקות בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס. מומלץ להקריש את המצע במכשיר קרישה חשמלי עם בקרת טמפרטורה אוטומטית. מצע עם תרופות נגד שחפת

ניתן לאחסן את השורה הראשונה במקרר בטמפרטורה של 2-4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד, ואת השורה השנייה - לא יותר משבועיים. אחסון של מדיה עם תרופות בטמפרטורת החדר אינו מקובל. בעת הכנת תמיסות של תרופות נגד שחפת, הפעילות שלהן נלקחת בחשבון, תוך חישוב הריכוז עם התאמה למשקל המולקולרי של החלק הלא ספציפי של התרופה, טוהר וכו'. כדי לקבוע את רגישות התרופה, משתמשים רק בחומרים טהורים מבחינה כימית.

עקרון השיטה הוא לקבוע את ריכוז התרופה נגד שחפת המדכאת את גדילתם של חלק משמעותי מאוכלוסיית המיקובקטריה. כאשר היא מבוצעת כהלכה, לשיטה זו אמינות טובה.

לפני ביצוע הבדיקה, יש לוודא שהתרבית המבודדת של Mycobacterium tuberculosis אינה מכילה מיקרופלורה זרה. מכינים תרחיף הומוגני המכיל 500 מיליון גופים מיקרוביאליים ב-1 מ"ל (תקן עכירות אופטית 5 יחידות) מתרבית המיקובקטריה בתמיסת נתרן כלורי 0.9%. את התרחיף המתקבל מדולל בתמיסת נתרן כלורי 0.9% (1:10) ומוסיפים 0.2 מ"ל מהתרחיף לכל מבחנה של סט מצע התזונה. מבחנות הבדיקה המוזרקות ממוקמות בתרמוסטט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ונשמרות אופקית למשך 2-3 ימים כך שהמשטח המשופע של מצע התזונה יוזרק באופן אחיד בתרחיף Mycobacterium tuberculosis. לאחר מכן מבחנות הבדיקה מועברות למצב אנכי ומודגרות במשך 3-4 שבועות. התוצאות נרשמות לאחר 3-4 שבועות.

מאחר שהזמן שלוקח לבודד את הפתוגן מחומר קליני על גבי מצע תזונתי הוא לפחות 1-1.5 חודשים, ניתן לקבל את תוצאות קביעת הרגישות לתרופות באמצעות שיטה זו לא לפני 2-2.5 חודשים לאחר זריעת החומר. זהו אחד החסרונות העיקריים של השיטה.

תוצאות בדיקת הרגישות לתרופות של מיקובקטריאלים מתפרשות על סמך קריטריונים מסוימים. במדיום מוצק, תרבית נחשבת רגישה לריכוז התרופה הכלולה במדיום אם מספר מושבות המיקובקטריאליות שגודלו במבחנה נתונה עם התרופה אינו עולה על 20 עם צמיחה שופעת במבחנה בקרה ללא תרופות. רק אם יש יותר מ-20 מושבות, התרבית נחשבת עמידה לריכוז נתון. בפועל, כאשר מתקבלות תוצאות צמיחה במבחנות הקרובות ל-20 CFU, יש צורך להודיע ליחידה הקלינית שהרגישות או העמידות במקרה זה הן גבוליות, שכן לעיתים הדבר יכול להסביר את הדינמיקה הלא ברורה של האינדיקטורים הקליניים.

עבור תכשירים שונים, נקבע ריכוז מסוים שבו נצפית ריבוי של חלק קריטי מאוכלוסיית המיקובקטריאלים. ריכוזים אלה נקראים "קריטיים". גודל הגדילה של אוכלוסיית המיקובקטריאלים על מצע מזין כאשר התכשיר בריכוז קריטי משמש כקריטריון ליציבות.

בפרקטיקה הפתיזולוגית המקומית, בעת קביעת עמידות לתרופות, הם אינם מוגבלים לקביעת ריכוזים קריטיים בלבד. זאת בשל העובדה שהגדרה מורחבת של רמת העמידות לתרופות של הפתוגן מאפשרת לרופא לגבש בצורה נכונה יותר טקטיקות כימותרפיה, תוך שימוש בידע על ההשפעה המחזקת של שילובי תרופות, לצפות עמידות צולבת או להשתמש בתרופות יעילות יותר מקבוצת התרופות נגד שחפת בשימוש.

שיטת הריכוז המוחלט היא הפשוטה ביותר, אך גם הרגישה ביותר לשגיאות שנעשות ביישומה. אמינה יותר, במיוחד בקביעת רגישות לתרופות קו שני, ונפוצה יותר מחוץ לרוסיה היא שיטת הפרופורציה. היא לוקחת בחשבון את חסרונותיה של שיטת הריכוז המוחלט, אך היא דורשת יותר עבודה.

השיטה דומה מאוד לשיטת הריכוז המוחלט. הכנת מבחנות עם תרופות זהה לזו בשיטת הריכוז המוחלט. עם זאת, מינון הזרעים של תרחיף שחפת מיקובקטריום מופחת פי 10, מה שמבטל את תדירות העמידות הספונטנית של חלק מזני שחפת מיקובקטריום לתרופות כגון אתמבוטול, פרותיונאמיד, קפראומיצין. כביקורות, משתמשים ב-2 או 3 מבחנות עם מינון זרעים השווה לזו שבמבחנות, מדוללות ברצף פי 10 ו-100. הקריטריון לעמידות הוא שיעור הגדילה הנצפית ויזואלית של שחפת מיקובקטריום. עבור תרופות קו ראשון, הקריטריון לעמידות הוא גדילה עודפת של 1% מהאוכלוסייה ההתחלתית, עבור תרופות קו שני - גדילה של 1% או יותר מ-10% מההתחלתי, בהתאם לריכוז הקריטי שנבחר.

בשנת 1997, קבוצת העבודה של ארגון הבריאות העולמי ושל האיגוד הבינלאומי נגד שחפת בנושא גילוי עמידות לתרופות נגד שחפת ביצעו התאמות לקריטריונים אלה, והציעו להתייחס למיקובקטריות הגדלות על מצע ביצי לוונשטיין-ינסן הצפוף בריכוזים הבאים כעמידות:

• דיהידרוסטרפטומיצין - 4 מיקרוגרם/מ"ל;
• איזוניאזיד - 0.2 מיקרוגרם/מ"ל:
• ריפמפיצין - 40 מק"ג/מ"ל:
• אתמבוטול - 2 מק"ג/מ"ל.

בשנת 2001 הוצעו ריכוזים קריטיים עבור תרופות קו שני הבאות (עבור שיעור קריטי של 1%):

• קפראומיצין - 40 מק"ג/מ"ל;
• פרוטיונמיד - 40 מק"ג/מ"ל;
• קנמיצין - 30 מיקרוגרם/מ"ל;
• ויומיצין - 30 מיקרוגרם/מ"ל;
• ציקלוסרין - 40 מק"ג/מ"ל;
• חומצה אמינוסליצילית - 0.5 מק"ג/מ"ל;
• אופלוקסצין - 2 מק"ג/מ"ל.

תוצאות הגידול מוערכות לאחר 4 שבועות כמקדימות ולאחר 6 שבועות של טיפוח כסופיות.

לקביעת רגישות התרופה לפיראזינאמיד, הנמצא בשימוש נרחב בכימותרפיה מודרנית נגד שחפת, הריכוז הקריטי המומלץ הוא 200 מיקרוגרם/מ"ל. עם זאת, עדיין אין שיטה מקובלת לקביעת עמידות לתרופה זו על גבי מצע תזונתי מוצק, מכיוון שפעילותה האנטיבקטריאלית מתבטאת רק בסביבה חומצית (pH <6), שקשה מבחינה טכנית לשמור עליה. בנוסף, תרבויות קליניות רבות של Mycobacterium tuberculosis נרתעות מגידול על גבי מצע ביצים עם סביבה חומצית.

על מנת להעריך את איכות תוצאות קביעת הרגישות לתרופות של מיקובקטריה, מומלץ לשלוט בכל אצווה חדשה של מדיום לוונשטיין-ינסן על ידי קביעה מקבילה של הרגישות של זן המוזיאון הסטנדרטי H37Rv. בנוסף, ישנם קריטריונים מיקרוביולוגיים מסוימים שיש לעמוד בהם כדי שהשיטות יניבו תוצאה ניתנת לשחזור היטב ופרשנות נכונה. אלה כוללים את הכדאיות של תרבית מיקובקטריה של שחפת, הכללים להשגת תרחיף ותרחיף הומוגניים, הכללים לבחירת תרבית מיקובקטריה של שחפת וייצוגיות מסת החיידקים שנבחרה. אמינות קביעת העמידות לתרופות פוחתת עם הפרשה חיידקית ירודה ביותר.

לאחרונה, שיטת קביעת הרגישות לתרופות באמצעות מערכות אוטומטיות הוכרה כמבטיחה. המתקדמים ביותר בתחום זה הם פיתוחים המבוססים על VASTEC MGIT-960. במקרה זה, נקבעת הרגישות לתרופות של מיקובקטריה בשחפת על סמך שיטת פרופורציה שונה. במהלך הקביעה, מושווה קצב הגדילה של מיקובקטריה בשחפת במבחנה הבקרה ובמבחנות עם תרופות. כדי לקבוע רגישות לסטרפטומיצין, איזוניאזיד, ריפמפיצין ואתמבוטול, נעשה שימוש בתוספי העשרה ואנטיביוטיקה הכלולים בערכת SIRE. כדי לקבוע רגישות לפיראזינאמיד, נעשה שימוש בערכת PZA. במהלך הבדיקה, מבחנות עם תרופות מחוסנות בתרחיף של מיקובקטריה בשחפת, וכן מבחנות בקרה עם דילול פי 100 של התרחיף עבור כל התרופות, למעט פיראזנאמיד, שם דילול התרחיף הוא פי 10. הקריטריון ליציבות הוא מדד גדילת מיקובקטריה של 100 GU כאשר הגדילה במבחנת הבקרה מגיעה ל-400 GU (ראה "שיטות תרבותיות לבידוד מיקובקטריה"). התוצאות נרשמות ומפורשות באופן אוטומטי ונקבעות על ידי התוכנית שהוזנה או נבחרה.

הריכוזים הסופיים במבחנה עם מצע הזנה נוזלי משמשים כריכוזים קריטיים. נכון לעכשיו, פותחו ריכוזים קריטיים הן עבור תרופות קו ראשון והן עבור חלק מתרופות קו שני. יש לציין כי קביעת הרגישות של מיקובקטריה של שחפת לציקלוסרין וחומצה אמינוסליצילית מתבצעת רק על מצע הזנה של ביצים.

פרוטוקול מפורט לעבודה עם המערכת המתוארת מאפשר בדיקת רגישות לתרופות הן על תרבית מבודדת (עם מצע תזונתי צפוף) והן באמצעות גידול ראשוני של מיקובקטריה במבחנה MGIT. האפשרות האחרונה מפחיתה משמעותית את הזמן הנדרש לביצוע מחקרי תרבית, ומאפשרת קבלת תוצאות מלאות על תרבית מיקובקטריה של שחפת (כולל מידע על רגישות לתרופות) תוך 3 שבועות מאיסוף החומר, בעוד שהשיטה המסורתית יכולה לספק זאת רק עד החודש השלישי. תוצאות בזמן, כאשר המטופל נמצא בשלב האינטנסיבי של הטיפול, יכולות לפצות על העלות הגבוהה יחסית של המחקרים.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

בידול של מיקובקטריה

בהתחשב בכך שמדיה התזונתית המשמשת אינה סלקטיבית לחלוטין, בידול נוסף של המיקובקטריה המבודדת נחשב חובה. הצורך בבידול מיקובקטריה נובע ממספר מאפיינים של תהליכים פתולוגיים הנגרמים על ידי נציגי הסוג: מהלך ותוצאה שונים של שחפת ומיקובקטריוזיס, נוכחות של עמידות טבעית לתרופות מסוימות נגד שחפת.

מקובל כי הזיהוי הראשוני של מיקובקטריה של קומפלקס M. tuberculosis ממיקובקטריה שאינה שחפתית מתבצע על פי המאפיינים הבאים: קצב גדילה על מצע תזונתי צפוף, היווצרות פיגמנט, מורפולוגיה של המושבה, נוכחות עמידות לחומצה וטמפרטורה אופטימלית לגדילה.

למרבה הצער, אין שיטת מעבדה אחת שיכולה להבחין באופן מהימן בין מיקובקטריה של קומפלקס M. tuberculosis לבין מיקובקטריות אחרות בעלות חומצה; עם זאת, שילוב של הסימנים שתוארו לעיל עם תוצאות של מספר בדיקות ביוכימיות המפורטות להלן מאפשר זיהוי של מיקובקטריה של קומפלקס M. tuberculosis בהסתברות של עד 95%.

כדי להבדיל בין מיקובקטריה של קומפלקס M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii ואחרות) לבין מיקובקטריה שאינה שחפתית הגדלה לאט, נעשה שימוש בבדיקות ביוכימיות בסיסיות כדי לזהות את נוכחות הסימנים הבאים:

• יכולת לייצר חומצה ניקוטינית (בדיקת ניאצין):
• פעילות ניטרט רדוקטאז;
• קטלאז תרמוסטביל;
• גידול על מצע עם נתרן סליצילט (1 מ"ג/מ"ל).

כבדיקה נוספת, ניתן להשתמש גם בבדיקות גדילה על מצע המכיל 500 מיקרוגרם/מ"ל חומצה פארא-ניטרובנזואית או 5% נתרן כלורי.

מעבדות בקטריולוגיות רבות מזהות מיקרואורגניזמים אלה רק ברמה המורכבת, הנובעת מיכולותיהן המוגבלות של המעבדות ומיכולותיהן המתודולוגיות של מומחים.

ברוב המקרים בפועל, הבדיקות הבאות מספיקות כדי להבדיל בין M. tuberculosis לבין M. bovis: ניאצין, ניטרט רדוקטאז, פיראזינמידאז ורישום גדילה על מצע המכיל 2 מיקרוגרם/מ"ל תיופן-2-קרבוקסיל חומצה הידרזיד. נלקח בחשבון כי מיקובקטריה של קומפלקס M. tuberculosis מאופיינת במערכת המאפיינים הבאה:

• צמיחה איטית (יותר מ-3 שבועות);
• טמפרטורת גידול בטווח של 35-37 ^מעלות צלזיוס;
• היעדר פיגמנטציה (צבע שנהב);
• צבע חומצי בולט;
• בדיקת ניאצין חיובית;
• בדיקת ניטרט רדוקטאז חיובית;
• היעדר קטלאז תרמוסטביל (68 ^מעלות צלזיוס).
• חוסר צמיחה על מצע לוונשטיין-ינסן המכיל:
  • 1000 מיקרוגרם/מ"ל נתרן חומצה סליצילית,
  • 500 מק"ג/מ"ל חומצה פארא-ניטרובנזואית,
  • 5% נתרן כלורי:
• גידול בנוכחות 1-5 מיקרוגרם/מ"ל חומצה תיופן-2-קרבוקסילית.

הרלוונטיות של בידול מיקובקטריה מבודדת תגדל משמעותית עם העלייה בתדירות רישום מקרי HIV/איידס הקשורים לשחפת או מיקובקטריוזיס. נכון לעכשיו, אין ודאות מוחלטת לגבי מוכנותן של מעבדות אזוריות מעשיות לבצע כראוי נפח עבודה זה.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

אבחון אימונולוגי של שחפת

ישנן מספר תופעות אוניברסליות, תכשירים ובדיקות אימונולוגיות שהתגלו בתחילה ספציפית בשחפת או במודל של תגובה חיסונית למיקובקטריה. אלה כוללים BCG וטוברקולין, תופעה כמו DST עורי (בדיקות טוברקולין - תגובות פירקה ומנטו), התגובה למתן תת עורי של טוברקולין לבעלי חיים רגישים (תופעת קוך). חלק מהנוגדנים הראשונים במחלות זיהומיות התגלו גם בשחפת. כמובן, ככל שההבנה של מנגנוני החסינות נגד שחפת ובקרתם הגנטית מעמיקה יותר, כך השימוש בשיטות ותכשירים אימונולוגיים המשפיעים על החסינות יכול להיות רחב יותר לפתרון בעיות מעשיות של פתיזולוגיה.

הבעיה המעשית החשובה והמורכבת ביותר כיום נחשבת לגילוי שחפת בתהליך של סינון המוני של האוכלוסייה. עם זאת, למרות דיווחים רבים על "הצלחות" (על חומר מוגבל), אין שיטה אימונולוגית (ניתנת לשחזור "בכל ידיים") או תרופה המתאימה למטרות אלה.

שיטות אימונולוגיות, ובפרט מחקרים סרולוגיים (קביעת אנטיגנים, נוגדנים) ומבחני פרובוקציה של שחפת, נמצאים בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית.

שיטות סרולוגיות, הקובעות אנטיגנים ונוגדנים בסביבות שונות של הגוף, נמצאות במקום הראשון מבין המחקרים האימונולוגיים המשמשים באבחון דיפרנציאלי.

הספציפיות של קביעת נוגדנים למיקובקטריה שחפת תלויה באנטיגנים המשמשים בניתוח החיסוני. הוצע מספר משמעותי של אנטיגנים, הראשון שבהם הוא טוברקולין PPD:

• PPD ותכשירים מורכבים אחרים מנוזל תרבית;
• מתפרק קולי;
• תמצית טריטון ותכשירים מורכבים אחרים של דופן תא;
• 5-אנטיגן (דניאל);
• אנטיגן 60 (קוקיטו);
• ליפואראבינומאנן;
• גורם חוט (טרהלוז-6,6-די-מיקולאט);
• גליקוליפידים פנוליים וגליקוליפידים אחרים;
• ליפופוליסכרידים;
• אנטיגן הקושר פיברונקטין;
• חלבונים (לרוב רקומביננטיים); 81,65,38,34,30,19,18,16,15.12 קילו-דגלונים וכו'.

כתוצאה משנים רבות של מחקר על ידי מדענים רוסים וזרים, זוהו הדפוסים העיקריים של היווצרות נוגדנים ויעילות האבחון הסרולוגי של שחפת: ככל שהאנטיגן מורכב יותר, כך הרגישות גבוהה יותר והספציפיות של הבדיקות נמוכה יותר. הספציפיות משתנה במדינות שונות בהתאם לזיהום האוכלוסייה ב-M. tuberculosis ובמיקובקטריה שאינה שחפתית, לחיסון BCG וכו'. אצל ילדים, האינפורמטיביות של הסרודיאגנוסטיקה נמוכה יותר מאשר אצל מבוגרים. בשחפת ראשונית (לרוב ילדים), קביעת IgM אינפורמטיבית יותר; בשחפת משנית - IgG. אצל אנשים נגועים ב-HIV, האינפורמטיביות של הסרודיאגנוסטיקה בקביעת נוגדנים מצטמצמת. יעילות קביעת הנוגדנים תלויה במספר "רגעים קליניים": פעילות התהליך (נוכחות או היעדר "בידוד" של מיקובקטריה, נוכחות חללי ריקבון, מידת החדירה), שכיחות התהליך, משך מהלך התהליך.

רגישות שיטת אימונו-אבחן אנזימי (EIA) היא כ-70%. יעילותו הלא מספקת של המחקר נובעת מסגוליותו הנמוכה. בעבר, נשקלו האפשרויות של שימוש בבדיקות סקר סרולוגיות בקבוצות בסיכון גבוה, בפרט בקרב אנשים עם שינויים בריאות לאחר שחפת.

כדי להגביר את הספציפיות של בדיקת ELISA, מחפשים אנטיגנים ספציפיים יותר, כולל כאלה המתקבלים בהנדסה גנטית: ESAT-6 וכו' (ראה לעיל). השימוש באנטיגנים ספציפיים לחלוטין (38 kDa, ESAT) מגביר את הספציפיות, אך מפחית משמעותית את רגישות הניתוח. יחד עם ELISA (מערכות בדיקה מעבדתיות ניסיוניות, כגון ערכת Pathozyme ELISA), מוצעות גם ערכות אימונוכרומטוגרפיות עם סינון רוחבי (Mycodot), כמו גם בדיקות דומות אחרות (ניתוח נקודות ממברנה) עם הערכה ויזואלית של תוצאת הבדיקה. בעת ביצוע בדיקות אלו, הניתוח אורך 10-30 דקות; הן אינן דורשות ציוד מיוחד, הן דורשות הערכה ויזואלית של התוצאות, הקשורה לסובייקטיביות מסוימת. לשיטות אלו יש מאפייני רגישות וספציפיות בערך זהים (70% ו-90-93%, בהתאמה) כמו ל-ELISA המסורתי.

לשימוש בשיטות ניתוח חיסוני יש ערך מסוים כשיטה נוספת הנלקחת בחשבון במכלול השיטות המשמשות באבחנה המבדלת של שחפת, במיוחד באבחון צורותיה החוץ-ריאתיות. שיטת ELISA יעילה ביותר באבחון דלקת קרום המוח השחפתית בבדיקת נוזל השדרה. במקרה זה, רגישות הניתוח היא 80-85%, והספציפיות היא 97-98%. יש מידע על יעילות קביעת נוגדנים ל-Mycobacterium tuberculosis בנוזל הדמעות באבחון דלקת ענביה שחפתית.

אינדוקציה של סינתזת גמא אינטרפרון במבחנה

גמא אינטרפרון (IFN-γ) הוא גורם להגנה חיסונית ספציפית, המתממש על ידי הפעלת מערכות האנזימים של מקרופאגים. אינדוקציה של סינתזת IFN-γ על ידי לימפוציטים T רגישים נגרמת על ידי האינטראקציה שלהם עם אנטיגנים מיקובקטריאליים.

גם אנטיגנים מסוג טוברקולין PPD וגם אנטיגנים ספציפיים המתקבלים בהנדסה גנטית משמשים כאנטיגנים, ובפרט אנטיגן ESAT-6 (אנטיגן מופרש מוקדם בעל משקל מולקולרי של 6 kDa) ו-CFP-10 (חלבון תסנין תרבית, 10 kDa). אנטיגנים מהונדסים גנטית או רקומביננטיים נעדרים בתאי חיסון BCG ובמיקובקטריה אחרת. בעת שימוש בטוברקולין, תוצאות בדיקת האינדוקציה IFN-γ דומות לתוצאות בדיקת העור של טוברקולין (קורלציה ישירה). בעת שימוש באנטיגנים מהונדסים גנטית, תוצאות הבדיקה ספציפיות יותר ואינן תלויות בחיסון BCG קודם. בבדיקת אנשים מחוסנים שלא היו במגע עם זיהום בשחפת, הספציפיות של הבדיקה היא 99%. רגישות הבדיקה בקרב חולי שחפת נעה בין 81 ל-89%.

פותחו בדיקות ואבחון המבוססים על גידול לטווח קצר של תאי דם מלאים או תאים חד-גרעיניים המבודדים מדם עם אנטיגנים של מיקובקטריה של שחפת במבחנה, ולאחר מכן קביעת ריכוז IFN-γ או ספירת מספר הלימפוציטים מסוג T המסנתזים IFN-γ. ריכוז האינטרפרון המסונתז במבחנה נקבע על ידי ELISA תוך שימוש בנוגדנים חד-שבטיים הקושרים IFN-γ. לאחר מכן, באמצעות כיול של IFN-γ סטנדרטי, נקבע ריכוזו במבחנה או בבארות הצלחת.

במבחן אליספוט, מספר תאי ה-T המסנתזים IFN-γ נספר על פני שטח של צלחת מצופה בנוגדנים ל-IFN-γ.

מפתחי טכנולוגיית האבחון האינדוקטיבית IFN-γ in vitro, שאושרה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי, טוענים כי הבדיקה אינה יכולה להבדיל בין זיהום שחפת סמוי לבין שחפת פעילה. לכן, באזורים עם שיעור זיהום גבוה, לבדיקה אין ערך אבחוני ישיר. עם זאת, בארצנו, ניתן להשתמש בה כדי להבדיל בין זיהום שחפת אצל ילדים לבין אלרגיה לאחר חיסון, וכן כדי להעריך את רמת החסינות הספציפית במהלך הטיפול.

נכון לעכשיו, נחקרת מערכת בדיקה מקומית לקביעת האינדוקציה של סינתזת IFN-γ על ידי אנטיגנים ספציפיים לשחפת במבחנה.

מצב חיסוני ומהלך שחפת, אימונוקורקציה

במהלך הטיפול בשחפת, מתרחשים שינויים באנטיגמיה ובמצב מערכת החיסון אצל אנשים.

הנתונים על שינויים בתפרשות וברקמות סותרים במידה רבה. הדבר היחיד שניתן לציין בצדק מלא הוא שגרנולומות שחפתיות, ככלל, מכילות מספר משמעותי של לימפוציטים מסוג T מופעלים.

הגיוני להתעכב על שתי נקודות נוספות הנחוצות להבנת תפקידם של מנגנונים אימונולוגיים בטיפול בשחפת בבני אדם:

• לחולי איידס שכיחות גבוהה במיוחד של פיתוח עמידות לתרופות מרובות;
• במקרה של עמידות לתרופות מרובות (ובהיעדר זיהום HIV), הפרעות חיסוניות (בעיקר חסינות של תאי T) משמעותיות במיוחד.

בשחפת, נעשה שימוש נרחב בשיטות שונות של אימונוקורקציה: ראשית, מדובר בתרופות הפועלות בעיקר על חסינות תאי T ועל מערכת הפגוציטים המונונוגרעינית (הורמוני תימוס, איזופון, ליקופיד, פוליאוקסידוניום וכו'), כמו גם מיקובקטריה שלמה (מוחלשת) ומרכיביה.

אבחון ביולוגי מולקולרי של שחפת

שיטות ביולוגיה מולקולרית באבחון מחלות זיהומיות כוללות בעיקר שיטות המבוססות על מניפולציה של חומרים גנומיים של פתוגנים חיידקיים וויראליים על מנת לזהות חומר גנטי ספציפי - מקטעי DNA עם רצף נוקלאוטידים ספציפי למין או זן נתון של פתוגן, לניתוח רצפי DNA ספציפיים בגנים הקובעים את רגישות הפתוגן לתרופות מסוימות, וכן לניתוח הפעילות התפקודית של גנים מסוימים של הפתוגן. שיטות ביולוגיות מולקולריות הפכו נפוצות במחקר מדעי ויישום מעשי באבחון וניטור של זיהומים חיידקיים וויראליים שונים לאחר גילוי תגובת שרשרת הפולימראז בשנת 1985 על ידי קארי מוליס (כלת פרס נובל 1989).

עקרונות ויכולות של שיטת תגובת שרשרת פולימראז

PCR מאפשר הגברה (הכפלה) של רצף נוקלאוטידים (קטע של DNA של פתוגן) במבחנה תוך מספר שעות פי מיליונים. ביצוע התגובה בנוכחות שרשראות DNA בודדות קובע את הרגישות הגבוהה במיוחד של הניתוח.

רצף הנוקלאוטידים של מקטעים מסוימים בשרשרת ה-DNA קובע את הייחודיות הגנטית של המיקרואורגניזם, מה שמסביר את הספציפיות הגבוהה של PCR.

חשיבותה של שיטה זו לגילוי וחקר מאפייני Mycobacterium tuberculosis נובעת מהמאפיינים הביולוגיים של המיקרואורגניזם, אשר גדילתו איטית מאוד: זמן ההכפלה של ה-DNA של Mycobacterium tuberculosis במהלך גידולם הוא 12-24 שעות.

העיקרון של שיטת ה-PCR הוא הגברה - כפל מרובה, מיליוני פעמים, של מקטעים של רצף DNA ספציפי במיקרו-נפח של מבחנה עם חזרה מחזורית של שלושת שלבי התגובה הבאים, שכל אחד מהם מתרחש במשטר טמפרטורה שונה:

• שלב א' - דנטורציה של DNA דו-גדילי בעת חימום עם סטייה של שרשראותיו;
• שלב II - קשירה משלימה (הכלאה) של פריימרים (אוליגונוקלאוטידים ראשוניים) עם קטעי הקצה של שרשראות של מקטע DNA ספציפי לחלוטין שנבחר להגברה;
• שלב III - השלמת שרשרת מקטעי ה-DNA באמצעות DNA פולימראז תרמו-יציב.

לצורך הגברה, מבחנה חייבת להכיל מולקולות של DNA מטריקס. ארבעה סוגים של טריפוספטים דאוקסינוקלאוזידים (נוקלאוטידים) המכילים את הבסיסים החנקניים המתאימים: אדנין (A), תימין (T), גואנין (G), ציטוזין (C); אוליגונוקלאוטידים (פרימרים) סינתטיים באופן מלאכותי המורכבים מ-18-20 זוגות בסיסים; אנזים תרמו-יציב, DNA פולימראז, עם טמפרטורה אופטימלית של 68-72 ^מעלות צלזיוס, ויוני מגנזיום.

הספציפיות של PCR תלויה בבחירת מקטע ה-DNA. בהתאם לכך, מסונתזים אוליגונוקלאוטידים של פריימרים צידיים. הספציפיות של ההכלאה והשלמת שרשרת ה-DNA נקבעת על ידי עקרון ההשלמה של זוגות הבסיסים החנקניים הבאים: אדנין-תימין, גואנין-ציטוזין.

כדי לקבוע את הגנום של מיקובקטריה קומפלקס השחפת, מטרת ההגברה היעילה ביותר ברוב מערכות הבדיקה היא מקטע ה-DNA IS6110, אשר ברוב זני מיקובקטריה של שחפת יש מספר משמעותי (10-20) של חזרות בגנום, מה שמבטיח, יחד עם ספציפיות, רגישות גבוהה של הניתוח. במקביל, תוארו זני מיקובקטריה של שחפת עם מספר קטן של חזרות או היעדר מקטע IS6110.

הפקת מולקולות DNA מדגימה ביולוגית

כדי לבצע PCR, יש לבודד את מולקולות ה-DNA של הפתוגן מהחומר הביולוגי בנפח מינימלי, עם כמות מינימלית של DNA לא ספציפי ומעכבים שונים של האנזים - DNA פולימראז.

הכנת הדגימה חייבת להתבצע בתנאים המונעים זיהום צולב של הדגימות הנחקרות עם מולקולות DNA מבודדות. זה דורש טיפול מקדים של החדר באור אולטרה סגול, רצפות ומשטחי עבודה של שולחנות ומכשירים - עם תמיסות המכילות כלור. כמו כן, יש להשתמש בכפפות נקיות, מבחנות חד פעמיות וקצוות לפיפטות אוטומטיות.

כדי לבודד את ה-DNA של Mycobacterium tuberculosis מדגימות קליניות (נוזל מוחי שדרתי, שטיפת סימפונות) שאינן מכילות מספר רב של לויקוציטים, פסולת תאית או מלחים, מספיק לצנטריפוגה של הדגימה ב-3-4,000 סיבובים לדקה, להוסיף 20-30 מיקרוליטר של תמיסת 2% של Triton X-100 למשקע ולחמם ב-90 ^מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

הכנת דגימת כיח דורשת הנזלה יעילה, בדרך כלל באמצעות 4% נתרן הידרוקסיד ו-N-אצטיל-L-ציסטאין (NALC) במינון של 50-80 מ"ג לדגימה, בהתאם לצמיגות הדגימה. יש להכין את תמיסת ה-NALC באופן מיידי, או להוסיף אבקת NALC יבשה ישירות לדגימה. לאחר ההנזלה, יש לצנטריפוגה של הדגימות במשך 15 דקות במהירות של 3,500-4,000 סל"ד (3,000 גרם) במבחנות עם מכסה הברגה של 50 מ"ל, כלומר באותם תנאים המומלצים להכנת כיח לפני תרבית.

כדי להפיק DNA משקעים, נעשה שימוש לרוב בשיטה המבוססת על שימוש בתמיסה של 5-6 מולרים של גואנידין איזותיוציאנט כמגיב ליזציה וחלקיקי סיליקון מיקרופורוזיים ("אדמה דיאטומית") הסופחים מולקולות DNA. לאחר מכן, חומרים לא ספציפיים, כולל מעכבים אפשריים, נשטפים בתמיסה של 2.5 מולרים של גואנידין איזותיוציאנט ותמיסת אתנול, ולאחר מכן מולקולות ה-DNA נספגות במים, ודגימות אלו משמשות לביצוע PCR. כדי לפשט את טכנולוגיית מיצוי ה-DNA, "אדמה דיאטומית" מוחלפת לעתים קרובות בחלקיקים מגנטיים מצופים בתחמוצת סיליקון. במקרה זה, משתמשים במעמד מגנטי מיוחד למיקרו-צינורות כדי להשקיע את החלקיקים במקום צנטריפוגה.

ברוסיה פותחה שיטה מקורית להפרדה אימונומגנטית של מיקובקטריה ולאחר מכן מיצוי של DNA פתוגן. לצורך הפרדה אימונומגנטית של מיקובקטריה של שחפת, משתמשים בחלקיקי פרו-פרו בגודל 3-5 מיקרומטר, מצופים בתחמוצת סיליקון, שאליהם מחוברים נוגדנים פוליקלונליים (ארנבת) למיקובקטריה של שחפת באמצעות קשר כימי. דגימות כיח לאחר ליזיס אלקליין מנוטרלות בתמיסת Tris-HCl חומצית ומודגרות עם סופח אימונומגנטי. לאחר מכן, החלקיקים האימונו-פרו-פרו נאספים באמצעות מוט מגנטי עם קצה מתחלף, מועברים למיקרו-צינור ומשקעים. מוסיפים 20-30 מיקרוליטר של תמיסת Triton X-100 2% ומחוממים במשך 30 דקות ב-90 ^מעלות צלזיוס. הנוזל העליון משמש כמטריצת DNA לניתוח PCR.

בעיה קשה היא מיצוי DNA של שחפת מיקובקטריום מדגימות ביופסיה. לצורך ליזיס ביופסיה, משתמשים באנזים פרוטאינאז K בריכוז סופי של 200-500 מ"ג/ליטר בטמפרטורה של 56 ^מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, הוא מופק באמצעות אחת השיטות הידועות. עודף DNA לא ספציפי בניתוח PCR של דגימות ביופסיה גורם לעיתים קרובות לעיכוב התגובה, דבר המחייב מיצוי DNA חוזר.

שיטות לגילוי תוצאות

לאחר השלמת התגובה, מזוהים שברי ה-DNA המוגברים של הפתוגן באמצעות שיטות שונות.

שיטת אלקטרופורזה בג'ל ידועה היטב. במקרה זה, מקטע ה-DNA המתקבל מזוהה על ידי בקרה חיובית המכילה את מקטע ה-DNA הספציפי הרצוי, או על ידי גודל ידוע מראש (מספר זוגות נוקלאוטידים) של המקטע, אשר נקבע באמצעות סמן מולקולרי סטנדרטי.

בנוכחות צבע ספציפי - אתידיום ברומיד, הכלול ב-DNA דו-גדילי, קטע ה-DNA המסונתז מתגלה כפס הזוהר תחת השפעת אור אולטרה סגול.

גודל מקטע ה-DNA, שנקבע על ידי אלקטרופורזה בהתבסס על המרחק שעבר מתחילת המחקר, חייב להתאים לסמן משקל מולקולרי ידוע או לבקרה חיובית.

שיטות אחרות לקביעת תוצאות PCR מבוססות על הכלאה של תוצרי PCR חד-גדיליים עם אוליגונוקלאוטיד משלים - גלאי DNA המסומן בביוטין, ולאחר מכן גילוי באמצעות תגובה אנזימטית על ידי, למשל, קשירת צמד סטרפטבידין-פוספטאז אלקליין לביוטין.

בהתבסס על סוג זה של גילוי, נוצרו מנתחי PCR שבהם גילוי תוצאות ה-PCR מתבצע באופן אוטומטי כתוצאה מקריאת הצפיפות האופטית בדגימות לאחר התרחשות התגובה האנזימטית.

החסרונות של שיטות אלו כוללים את האפשרות של זיהום תוך-מעבדתי עם שברי מולקולות DNA קצרים למדי. כאשר מולקולות אלו חודרות לדגימות שנבדקו לאחרונה, הן הופכות למטריצה עבור PCR ומובילות לתוצאות חיוביות שגויות.

בהקשר זה, כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות, ננקטו כללים מחמירים להפרדה ובידוד חדרים: להפקת DNA מדגימות ביולוגיות; חדרים לגילוי תוצאות (אלקטרופורזה) מהאזור הנקי. חדרים אלה מייצגים אזור של זיהום אפשרי. אזור מבודד נוסף הוא חדר נקי להכנסת דגימות ה-DNA הנבדקות למבחנות עם תערובת התגובה ל-PCR. ולבסוף, ההנחה היא שיש להוציא את המכשיר העיקרי - מגבר ה-DNA - לחדר נפרד, אולי משרדי.

כדי למנוע זיהום על ידי תוצרי תגובות קודמות - אמפליקונים, חלק ממערכות בדיקת ה-PCR מכילות דאוקסינוקלאוזיד אורידין במקום דאוקסינוקלאוזיד תימידין, אשר נבנה במיקום המתאים במהלך סינתזת שרשרת in vitro, כלומר, התימין הבסיסי החנקני הקיים ב-DNA המקורי מוחלף באורציל. גליקוזילאז DNA אורציל שנוסף לתערובת התגובה של החומר המנותח הורס רק מקטעים מזהמים בדאוקסיורידין, אך לא את ה-DNA המנותח המקורי המכיל דאוקסיתימידין. חימום לאחר מכן ב-94 ^מעלות צלזיוס מנטרל אנזים זה ואינו מפריע להגברה ב-PCR.

קיימת מערכת בדיקה המבוססת על הגברה איזותרמית של rRNA, שעבורה מתבצעים תחילה שעתוק הפוך וסינתזה של מולקולות DNA, אשר בתורן מהוות את המטריצה לסינתזה שלאחר מכן של מולקולות RNA. אמפליקונים של RNA מזוהים באמצעות גלאי DNA צבוע באקרידין במהלך הכלאה בתמיסת צינור תגובה. לשיטה זו, בנוסף לרגישות הגבוהה, יש יתרון של ביצוע הניתוח במבחנה אחת, מה שמונע זיהום. לדברי המחברים, הרגישות של שיטה זו בדגימות נשימה מגיעה ל-90% עם ספציפיות של 99-100%.

שיטות גילוי חדשות מיושמות ב-PCR בזמן אמת. שיטות אלו נבדלות בעיקר בכך שה-PCR וגילוי תוצאותיו מתבצעים בו זמנית במבחנה סגורה אחת. זה לא רק מפשט טכנולוגית את שיטת הניתוח, אלא גם מונע זיהום של שטחי המעבדה והדגימות על ידי תוצרי PCR קודמים.

ב-PCR בזמן אמת, התוצאות מזוהות על ידי פלואורסצנציה הנובעת מהכלאה של גלאי DNA פלואורוגני עם מקטע DNA ספציפי המוגבר במהלך PCR. מבנה גלאי ה-DNA הפלואורוגני בנוי באופן כזה שהסמן הפלואורסצנטי משתחרר כתוצאה מתגובה אנזימטית או מתרחק ממולקולת מכבה הפלואורסצנציה רק לאחר הכלאה ספציפית עם מולקולת ה-DNA הרצויה המוגברת במהלך PCR. ככל שמספר המולקולות המוכלאות עם הגלוי עולה, העלייה בפלואורסצנציה לרמה ניתנת לזיהוי היא פרופורציונלית למספר המולקולות של התוצר המוגבר. מכיוון שמספר מולקולות מקטע ה-DNA מוכפל במהלך כל מחזור PCR, מספר המחזורים שממנו מזוהה הפלואורסצנציה וגדלה הוא ביחס הפוך למספר מולקולות ה-DNA בדגימה המקורית. אם מכניסים לתגובה מספר ריכוזים ידועים שונים של מולקולות של המקטע המתאים של DNA של שחפת מיקובקטריום ככייל, אזי ניתן לחשב את מספר גנומי ה-DNA בחומר הנחקר באמצעות תוכנת מחשב.

כל דגימה סטנדרטית משוכפלת. הקריטריון הכמותי הוא המספר המינימלי של מחזורי PCR הנדרשים להופעת פלואורסצנציה ניתנת לזיהוי ולגדילתה. ציר האבססיסה הוא מספר המחזורים; ציר האורדינטה הוא ערך הפלואורסצנציה. ריכוזי ה-DNA הם ביחס הפוך למספר המחזורים הנדרשים להופעת פלואורסצנציה. החלונות בעמודה הימנית (21-32) מציגים את מספרי המחזורים עבור הריכוזים המתאימים. ההבדלים בין ריכוזים פי 10 של מקטעי DNA 10 ² -10 ⁶ מ"ל הם 3.2-3.4 מחזורים. עבור שני חולים, ריכוזי מקטעי IS6110 היו כ-10 ³ /מ"ל ו-10 ⁴ /מ"ל. בהתחשב במספר החזרות (6-20) של המקטעים המנותחים בגנום של Mycobacterium tuberculosis, מספר Mycobacterium tuberculosis בדגימות הקליניות הוא כ-100 ו-1000 תאים, בהתאמה.

יישום PCR באבחון שחפת

שיטת ה-PCR משמשת במידה רבה לאבחון מהיר של שחפת - גילוי Mycobacterium tuberculosis בדגימות קליניות: כיח, שטיפות סימפונות, תרבית פלאורלית, שתן, נוזל מוחי שדרתי, דקירות אוסטאוליזה, שאיבות של מערכת המין הנשית וביופסיות שונות. במחקר בהולנד של כ-500 דגימות של כיח ושטיפות סימפונות מ-340 חולים עם אבחנה מאושרת של שחפת ריאתית, נחקרה הרגישות ההשוואתית של שיטות ה-PCR, התרבית ומיקרוסקופ המריחה. רגישות הניתוח הייתה 92.6, 88.9 ו-52.4% בהתאמה. הספציפיות של כל השיטות הייתה כ-99%.

נערכה השוואה בין יעילות גילוי Mycobacterium tuberculosis באמצעות מיקרוסקופיית מריחה, זריעה על מצע Lowenstein-Jensen, מערכת הבדיקה VASTES וניתוח PCR. PCR הדגים רגישות של 74.4%, מיקרוסקופיה - 33.8%, זריעה על מצע מוצק - 48.9% ו- VASTES - 55.8%. זמן הגילוי הממוצע לזריעה על מצע Lowenstein-Jensen הוא 24 ימים. VASTES - 13 ימים, PCR - יום אחד.

כמו כן נדון הפוטנציאל לשימוש ב-PCR כשיטה רגישה ומהירה לניטור יעילות הטיפול בשחפת.

גילוי DNA של Mycobacterium tuberculosis בשיטת PCR עם כימותרפיה יעילה נקבע לאורך תקופה ארוכה יותר - בממוצע 1.7 חודשים בהשוואה להפרשה חיידקית שנקבעה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ו-2.5 חודשים בהשוואה לבדיקה בקטריולוגית.

אבחון צורות חוץ-ריאתיות של שחפת

חשיבות ה-PCR כשיטה רגישה גדולה במיוחד עבור צורות חוץ-ריאתיות, שכן דווקא בצורות אלו שיטות קליניות ורדיולוגיות ושיטות בקטריולוגיות מסורתיות לקביעת Mycobacterium tuberculosis בחומרי אבחון אינן יעילות.

בבדיקת דגימות שתן, תוצאות ניתוח ה-PCR היו חיוביות ב-16 מתוך 17 חולים עם שחפת פעילה של מערכת השתן ושליליות ב-4 חולים עם שחפת כלייתית לא פעילה ו-39 חולים עם מחלות שאינן שחפתיות של מערכת השתן.

הודגמה יעילות ניתוח PCR במחקר שאיבת מח עצם בחולים עם חום ממקור לא ידוע עם חשד לאופי שחפתי של המחלה. לצורך אבחון לימפדניטיס שחפתית בילדים, נחקרו 102 שאיבות ניקוב ודגימות ביופסיה של 67 ילדים עם חשד ללימפדניטיס שחפתית. התקבלו תוצאות חיוביות: ב-PCR בזמן אמת - 71.6%, מיקרוסקופ פלואורסצנטי - 46.3%, מחקר תרבית - 41.8%. במחקר של 50 ביופסיות של בלוטות לימפה בחולים עם מחלת שריטות חתול, כל התוצאות היו שליליות. לפיכך, הודגמה ספציפיות של 100% של ניתוח PCR. באותה עבודה, הוצגה האפשרות לאתר M. avium בביופסיה ניקוב של בלוטות לימפה.

אבחון שחפת באיברי המין הנשית בבעיות פוריות ידוע כאחת הבעיות האבחוניות הקשות ביותר. תוצאות חיוביות התקבלו בבדיקות PCR של ביופסיות רירית הרחם, שאיבות רירית הרחם ודגימות נוזל דאגלס ב-14 (56%) מתוך 25 חולות שנבדקו לפרוסקופית עם חשד לשחפת. מיקרוסקופיית משטח ובדיקות תרבית הניבו תוצאה חיובית אחת ו-2, בהתאמה. מקרים אלה היו גם חיוביים ל-PCR. רוב תוצאות ה-PCR החיוביות היו במקרים עם מאפיינים אופייניים לשחפת על פי בדיקה היסטולוגית; מספר קטן יותר היה במקרים עם חשד לשחפת על פי לפרוסקופיה. רק תוצאה חיובית אחת של PCR התקבלה בהיעדר נתונים לפרוסקופיים לשחפת.

בעת אבחון צורות חוץ-ריאתיות של שחפת, לרופאים יש לעתים קרובות שאלה לגבי האפשרות לזהות את הפתוגן בעת בדיקת דגימות דם בשיטת PCR. נתוני הספרות מצביעים על כך שגילוי DNA של Mycobacterium tuberculosis מדגימות דם אפשרי בצורות מתקדמות של זיהום HIV. DNA של Mycobacterium tuberculosis זוהה רק בשחפת כללית של איברים שונים בחולים עם כליה מושתלת ודיכוי חיסוני.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

זיהוי מינים של מיקובקטריה

שיטת ה-PCR יכולה להיות יעילה למדי לזיהוי מהיר של מיקובקטריה של קומפלקס השחפת וכמה סוגים של מיקובקטריה שאינה שחפתית לאחר קבלת הגידול הראשוני שלה. במקרה זה, השימוש ב-PCR יכול לחסוך 7-10 ימים הנדרשים לזיהוי תרבית לאחר מכן של תוצאה חיובית. מחקר ה-PCR הוא פשוט מאוד מבחינה טכנית, מכיוון שהוא אינו דורש הכנת דגימה מורכבת של חומר קליני כדי להשיג רגישות גבוהה. בבדיקת 80 תרביות חיוביות במערכת בדיקה כזו (MB BacT. מתוצרת Organon), כל תוצאות ניתוח ה-PCR החיוביות היו ספציפיות לחלוטין ובוצעו תוך יום אחד. כדי לזהות סוגים אחרים של מיקובקטריה כאשר הם מתקבלים בתרבית, ה-DNA של הפתוגן עובר הכלאה עם גלאי DNA ספציפיים המסומנים באקרידין, והזנים מזוהים על ידי הופעת כימילומינסנציה באמצעות כימילומינומטר או על רצועות ניטרוצלולוז עם הערכה ויזואלית לאחר ההכלאה. ערכה זו מזהה מספר מוגבל של מינים: קומפלקס Mycobacterium tuberculosis, M. avium, קומפלקס M. avium, M. kansasii ו-M. gordonae.

א. טלנטי ועמיתיו פיתחו גם שיטה פשוטה וזולה יחסית לזיהוי מינים של מיקובקטריה חשובה קלינית, המבוססת על PCR וטיפול לאחר מכן בשני אנזימי הגבלה (אנזימים בעלי יכולת לחתוך מולקולת DNA בנקודות ספציפיות). במקרה זה, מקטע DNA המקודד לחלבון הלם חום (65 kDa) מוגבר, ולאחר מכן מקטע ה-DNA המתקבל ב-PCR, בגודל 439 זוגות נוקלאוטידים, מטופל בנפרד עם שני אנזימים - Bste II ו-Нае III. לאחר מכן, באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז, שני התוצרים המתקבלים מנותחים, תוך קביעת גודלם (מספר זוגות הנוקלאוטידים) באמצעות קבוצה של מקטעי DNA סטנדרטיים (סמני DNA מולקולריים) באורך של 100 עד 1000 זוגות נוקלאוטידים. בכל אחד מהמינים המוגדרים (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) נמצאים 2 או 3 מקטעי DNA בגדלים שונים עבור כל אנזים הגבלה. שילוב מקטעי ה-DNA המתקבלים בגדלים שונים מאפשר להבדיל מינים אלה זה מזה.

טכנולוגיה למיקרו-מערכי DNA ביולוגיים נמצאת בפיתוח שתסייע בזיהוי יותר מ-100 מינים של מיקובקטריה במחקר יחיד.

זיהוי מינים יכול להתבצע גם באמצעות הגברת PCR של האזור המשתנה של 16S rRNA ולאחר מכן ריצוף האמפליקונים בהשוואה למבנה הראשוני המתאים, המאפשר זיהוי של יותר מ-40 מינים של מיקובקטריה.

ניתן להשתמש ב-PCR גם לזיהוי מינים בתוך קומפלקס המיקובקטריום של שחפת, כולל הבחנה בין M. bovis לבין M. bovis BCG. פעולה זו נעשית על ידי ניתוח נוכחות או היעדרות של גנים מסוימים באזורים הגנומיים RD1, RD9 ו-RD10. RD1 נעדר ב-M. bovis BCG, אך קיים במינים אלימים, כולל M. bovis.

קביעת רגישות לתרופות של Mycobacterium tuberculosis באמצעות PCR

משימות השיטות הגנטיות המולקולריות לקביעת רגישות או עמידות לתרופות של Mycobacterium tuberculosis מצטמצמות לזיהוי מוטציות ברצפי נוקלאוטידים מסוימים של גנים ידועים. השיטות העיקריות מבוססות על קריאה ישירה (ריצוף) של רצפים אלה לאחר הגברה, או על הכלאה של מקטעי DNA המסומנים בביוטין המוגברים במהלך PCR באמצעות גלאי DNA. שתי האפשרויות כוללות זיהוי החלפות ברצפי נוקלאוטידים אשר, בעת שימוש בגלאי DNA, מובילות להיעדר או לאי הכלאה שלמה על קרום ניטרוצלולוזה באמצעות קוניוגט אנזים (סטרפטאבידין-פוספטאז אלקליין) - שיטת LIPA-Rif-TB.

השיטה למדידת פלואורסצנציה בגלאי DNA מקובעים מקומית על גבי מיקרו-אזורים המשלימים מוטציות ידועות באזורי גנים שהוגברו על ידי PCR האחראים לרגישות או עמידות לתרופות נקראת שיטת המיקרוביו-צ'יפס. האלגוריתם הבסיסי לביצוע מחקר זה הוא כדלקמן. לאחר בידוד DNA מדגימה קלינית או מתרבית מיקובקטריאלית, יש לבצע PCR כדי להגביר את המקטעים המתאימים של הגן groB האחראי לרגישות לתרופה לריפמפיצין, או את הגנים katG ו-inhA המקודדים חלבונים מיקובקטריאליים האחראים לרגישות לאיזוניאזיד. תוצאות ה-PCR מוערכות באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז, המאשרת את קבלת מקטעי ה-DNA המתאימים באורך הרצוי. לאחר מכן, מתבצע סבב שני של PCR כדי להחדיר תווית פלואורסצנטית ל-DNA. תוצאות ה-PCR מאושרות שוב על ידי אלקטרופורזה בג'ל. לאחר מכן, מתבצעת הכלאה (דגירה למשך הלילה) ולאחר מכן שטיפה של החומר המתקבל על גבי שבב ביולוגי, שהוא מספר רב של שרשראות DNA קצרות (גששים) המקובעות על צלחת זכוכית קטנה, המשלימות את רצפי הנוקלאוטידים של מיקובקטריה שחפתית מסוג רגיש לתרופה בנקודות של מוטציות אפשריות, כמו גם את רצפי המוטנטים האחראים לעמידות לתרופות. מיקום גלאי ה-DNA על הצלחת מוגדר בקפדנות, ורמת הפלואורסצנציה הנצפית במהלך ההכלאה נקבעת לקביעת התוצאה באמצעות מכשיר קריאה מיוחד. בהקשר זה, תוצאות הניתוח נקבעות באמצעות תוכנת מחשב מיוחדת.

בשנים האחרונות פותחו שיטות חלופיות לקביעת רגישות התרופה של Mycobacterium tuberculosis המבוססות על טכנולוגיית PCR בזמן אמת, המאפשרות ביצוע מחקרים אלה במצב מבחנה סגורה.

איור 13-13 מציג את תוצאת ניתוח התרביות הקליניות של Mycobacterium tuberculosis בקביעת עמידות לתרופות לריפמפיצין באמצעות PCR בזמן אמת: 218 - דגימת בקרה (רגישה לריפמפיצין); 93 - בקרה חיובית למוטציה Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - בקרה חיובית למוטציה Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - דגימות ניסיוניות. תוצאת חישוב עקומות ההגברה הקינטיות עבור 4 ערוצים: ערוץ 1: 393 - בקרה חיובית למוטציה Ser-Trp TCG-TGG; ערוץ 2: 4482 - בקרה חיובית למוטציה Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - דגימות ניסיוניות; ערוץ 4: עקומות קינטיות של הגברה של כל הדגימות המשתתפות בניסוי. בקרה חיובית של תגובת ההגברה. מסקנות: הניתוח גילה את המוטציות הבאות הקובעות עמידות לריפמפיצין: בדגימות 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. אותו עיקרון שימש לקביעת עמידות תרופות לאיזוניאזיד על ידי הגנים katG ו-inhA, הקובעים את המוטציות השכיחות ביותר.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

זיהוי זן של Mycobacterium tuberculosis

השיטה הנחקרת ביותר לזיהוי זנים של Mycobacterium tuberculosis היא טכנולוגיה הנקראת פולימורפיזם אורך מקטעי הגבלה (RFLP) המבוססת על פרגמנטציה (הגבלה) של ה-DNA של Mycobacterium tuberculosis על ידי האנזים Pvu II ולאחר מכן הכלאה של המקטעים המתקבלים עם רצפים ספציפיים מסוימים על ה-DNA של האלמנט החוזר שלו IS6110. שונות תוך-ספציפית מתממשת עקב מספר שונה של חזרות IS6110 ומיקומן על ה-DNA, כמו גם מגוון המרחקים בין נקודות תקיפה מסוימות של אנזים ההגבלה (אתרי הגבלה) לבין האלמנט IS6110. טכנולוגיה זו מורכבת מאוד ודורשת עבודה רבה. לאחר טיפול ב-DNA שבודד מתרבית מיקובקטריום השחפת עם אנזים הגבלה, מבוצעת אלקטרופורזה בג'ל, לאחר מכן מועברים מקטעי DNA באורכים שונים לממברנת ניטרוצלולוז, עוברים הכלאה עם מקטעים של האלמנט IS6110, והתוצאות מזוהות באמצעות תגובה אנזימטית. דפוס הפסים הספציפי המתקבל מאפיין את ה-DNA של זן ספציפי של מיקובקטריום שחפת. ניתוח מחשב חושף את הזהות או הקשר בין הזנים. למרות העובדה ששיטת ה-RFLP היא המבדילה ביותר, כלומר היא חושפת את מספר ההבדלים הגדול ביותר בזנים המנותחים, היא אינה יעילה עם מספר קטן (פחות מ-5) של חזרות IS6110, שנצפו בחלק מהזנים. איורים 13-14 מציגים את תוצאות תהליך קביעת סוג ה-RFLP של הזנים.

חלופה עשויה להיות שיטת הספוליגוטיפינג - ניתוח הפולימורפיזם של רצפי DNA של ספייסר - ביניים בין חזרות ישירות של אזור DR. בעת ביצוע ספוליגוטיפינג של זנים, מתבצע PCR עם פריימרים המגבילים את אזור DR, ולאחר מכן נוצרים מקטעים באורכים שונים, אשר מכליאים עם אזורי DNA ביניים משתנים. ניתוח רצפי ספייסר של אזור DR נראה, לדברי החוקרים, פשוט יותר, פרודוקטיבי יותר ומתאים לסינון ראשוני של זנים ולניתוח אפידמיולוגי ראשוני, כמו גם לחקר חומר קליני ישירות.

ברור ששיטה יעילה ונגישה יותר מבחינה טכנולוגית היא VNTR (קיצור של מילים באנגלית), או שיטת קביעת המספר המשתנה של חזרות טנדם מדויקות ב-DNA של שחפת השחפת. שיטה זו מבוססת רק על שימוש ב-PCR ואינה דורשת מניפולציות נוספות. מכיוון שמספר חזרות הטנדם בזנים שונים ובלוקוסים שונים שונה, נקבעים ופרוסות מקטעים בגדלים שונים על גבי האלקטרופורגרם המתקבל של תוצרי PCR. לדברי החוקרים, בעזרת VNTR מושגת מידה גדולה יותר של הבחנה בין זנים מאשר בשיטת RFLP.

תשומת לב רבה הוקדשה בשנים האחרונות להתפשטות זנים של Mycobacterium tuberculosis ממשפחת W-Beijing (המכונים לעיתים זן בייג'ינג), אשר עמידים במידה רבה לתרופות.

דרישות בסיסיות לאיכות המחקר הביולוגי המולקולרי

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

מסמכים רגולטוריים עיקריים לביצוע PCR

צווים של משרד הבריאות של הפדרציה הרוסית: מס' 45 מיום 7.02.2000; מס' 109 מיום 21.03.2003; מס' 64 מיום 21.02.2000. הנחיות: 1.3.1888-04 "ארגון עבודה במהלך מחקר PCR של חומר נגוע בחומרים ביולוגיים פתוגניים מקבוצות פתוגניות III-IV"; 1.3.1794-03 "ארגון עבודה במהלך מחקר PCR של חומר נגוע במיקרואורגניזמים מקבוצות פתוגניות I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "חיטוי חומר בדיקה נגוע בחיידקים מקבוצות פתוגניות I-IV בעת עבודה בשיטת PCR", 2001. נספח 11 להוראות לשיטות מאוחדות של מחקר מיקרוביולוגי בגילוי, אבחון וטיפול בשחפת.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

סֶגֶל

מחקרים ביולוגיים מולקולריים יכולים להתבצע על ידי רופאי אבחון קליניים, בקטריולוגים, וירולוגים, ביולוגים קליניים, וכן מומחים בעלי השכלה רפואית תיכונית שעברו התמחות והכשרה מתקדמת באופן המקובל.

סידור שטחי המעבדה

נדרשים מתקני המעבדה הבאים:

• אזור עיבוד דגימות - מעבדה המותאמת לעבודה עם גורמים זיהומיים מקבוצות פתוגניות III-IV, בהתאם להנחיות המתודולוגיות 13.1888-04.
• האזור להכנת תערובות תגובת PCR הוא חדר מעבדה המספק הגנה מפני זיהום פנימי במעבדה - אזור "נקי".
• • אם נעשה שימוש באלקטרופורזה או הכלאה לניתוח תוצרי PCR, חדר המעבדה שבו מפורקים שברי ה-DNA המוגברים מצינור ההגברה, ולפיכך, יכולים להיכנס לסביבה, בהתאם לדרישות למעבדות PCR (הנחיות מתודולוגיות 1.3.1794-03, הנחיות מתודולוגיות 1.3.1888-04) חייב להיות מבודד לחלוטין מהחדרים שצוינו בפסקאות הקודמות. יש להימנע מתנועה של כל אדם, ציוד, כל חומר וחפץ מאזור האלקטרופורזה לאזור עיבוד הדגימות ולאזור ה"נקי", כמו גם מעבר אוויר דרך מערכת האוורור או כתוצאה מרוח רוח. אזור זה אינו נדרש לגילוי פלואורימטרי של תוצרי PCR.
• החדר לתיעוד ועיבוד תוצאות מצויד במחשבים ובציוד משרדי נדרש. חדר זה עשוי להכיל ציוד המבטיח זיהוי של תוצרי PCR מבלי לפתוח את המבחנה. - גלאי PCR פלואורסצנטיים ומכשירי מחזור תרמיים ל-PCR בזמן אמת.

דרישות סניטריות ואפידמיולוגיות לעיבוד ראשוני של כיח דומות לדרישות המיקרוביולוגיות הסטנדרטיות לעבודה עם Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

סט שלם של ציוד מעבדה לאבחון PCR

ערכת המעבדה כוללת ציוד לחדרים הבאים.

• חדר הכנת דגימות, מכיל את הציוד הבא: מכסה למינרי מסוג הגנה II "SP-1.2": תרמוסטט במצב מוצק עם מכסה מחומם למבחנות אפנדורף; מיקרוצנטריפוגה ב-13,000 סל"ד; צנטריפוגה ("Vortex"); מקרר עם טווח טמפרטורות מ-20 ^° C- עד 10 ^° C+; פיפטות בעלות נפח משתנה מסדרת "Proline"; משאבה עם בקבוקון מלכודת OM-1; מתקן לפיפטות; מתקן תחנת עבודה 200x0.5 מ"ל; מתקן תחנת עבודה 50x1.5 מ"ל; מדפים לאחסון מבחנות 80x1.5 מ"ל;
• חדר הכנת תערובת תגובה: תא מגן, קופסת PCR ("Laminar-C. 110 ס"מ); צנטריפוגה "Vortex"; פיפטות בנפח משתנה מסדרת "Proline"; מתקן לפיפטות; מתקן תחנת עבודה 200x0.2 מ"ל; מדפים לאחסון מבחנות 80x1.5 מ"ל; מקרר עם טווח טמפרטורות מ-20 ^° C- עד 10 ^° C+;
• חדר אלקטרופורזה: תא אלקטרופורזה אופקי; מקור כוח; מכשיר מעבר לאיור;
• מגבר DNA או מנתח חומצות גרעין (PCR בזמן אמת) עם מחשב ותוכנה; ניתן למקם בכל חדר פנוי. אם משתמשים בטכנולוגיית PCR בזמן אמת, אין צורך בחדר אלקטרופורזה.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

בקרת איכות חיצונית

כדי להבטיח שהן יקבלו תוצאות אמינות באופן אובייקטיבי, מעבדות חייבות להשתתף במערכת של הערכה חיצונית של איכות המחקר המעבדתי.

משתתפי מערכת בקרת האיכות מקבלים: 12 אמפולות עם תרחיפים ליופיליזים של תאי חיידקים, שתיים מהן מכילות E. coli, 3 אמפולות עם מיקובקטריה שחפתית (זן לא פעיל) בריכוז של 10 ² /מ"ל; 3 אמפולות עם תאים מזן דומה בריכוז של 10 ⁴ /מ"ל; 2 אמפולות כל אחת עם מיקובקטריה לא-שחפתית M. avium-intracellulare ו-M. kansasii בריכוז של 10 ⁵ /מ"ל.

הבדיקות הנשלחות להערכת איכות חיצונית עוברות בדיקה מקדימה בשתי מעבדות בלתי תלויות בעלות ניסיון רב בתחום זה.

[ 85 ], [ 86 ]