אבחון מעבדה של שחפת

שחפת היא מחלה שקל לאבחן בתנאים מודרניים ובהישגים מדעיים. אבחון מעבדה של שחפת הוא מרכזי שיטות אבחון אחרות, השני רק רנטגן שיטות המחקר.

[1], [2], [3], [4],

בדיקת דם קלינית

בחולים עם שחפת, שינויים בניתוח הכללי של הדם אינם פתוגנוניים. עם צורות מוגבלות ובלתי פעילות של שחפת, אריתרוציט הוא היפוכרומי בכמות רגילה. כאשר מחלחל מסיבי או דלקת ריאות caseous, בעוד שכיחות של בְּלוּטַת לְשַׁד caseous, נגעים במעי ספציפיים, כמו גם עבור ריאתי גדול או דימום לאחר הניתוח ואת הפתק erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Macrocytosis, ובמיוחד poikilotsitoz להיפגש הרבה פחות לעתים קרובות, בדרך כלל עם אנמיה חמורה. מספר רטיקולוציט ב שחפת צעד פיצוי נע בין 0.1 עד 0.6%, עם subcompensated - מ 0.6 ל -1.0% ו 1% מאופיין רטיקולוציט מפוצה.

כאשר שחפתו במקרים מסוימים תיתכן leucocytosis מתונה (עד 15 אלף של לויקוציטים.), קרינה פחות, אשר מתרחשת 2-7% מחולים עם התרחשות צורות תהליך מוגבלות וקלות וב 12.5% - על ידי שחפת ריאתית הרסנית ומתקדמת .

המשמרות הנפוצות ביותר מתרחשות בנוסחת לויקוציטים. סמן גם נויטרופיליה יחסית ומוחלטת, שינוי מתון של נוסחת לויקוציטים שמאלה לפני פרומיאלוציטים. מיאלוציטים נדירים מאוד במקרה של שחפת לא מסובכת. הגדלת מספר נויטרופילים עם דגנים חריגים חולי שחפת haemogram תמיד מציינת את משך התהליך: בחולים עם שחפת חמורה כמעט כל נויטרופילים מכילים דגנים נורמלים. כאשר פרוץ השחפת נפסק, השינוי הגרעיני מתקרב במהירות לנורמלי. הפירוטיות הפתולוגית של נויטרופילים בדרך כלל נמשכת זמן רב יותר משינויים אחרים בהמוגרפיה.

התוכן של eosinophils בדם ההיקפי גם משתנה בהתאם לשלב של התהליך ואת מצב אלרגי של האורגניזם. מספרם פוחת עד aneozinofiliya ב התפרצות חמורה והממושכת של מחלה, לעומת זאת, גדל ככל מחלחל הספיגה ו תפליט פלאורלי, כמו גם צורות מוקדמות של שחפת עיקרית.

רוב הצורות העיקריות של שחפת ראשונית מלוות בלימפופניה, אשר נצפית לעיתים במשך מספר שנים, גם לאחר הצטלקות של שינויים ספציפיים. שחפת משנית בשלב החמרה, בהתאם לחומרת התהליך, עשויה להיות מלווה במספר נורמלי של לימפוציטים, או לימפופניה.

היא תופסת מקום מיוחד בקביעת מבחנים נוספים שקיעת דם כדי להעריך תהליך שהחוף (ESR) בעל ערך בהערכת תהליך שחפת הזרימה וזיהוי הצורות הפעילות שלה. גידול ESR מעיד על קיומו של תהליך פתולוגי (זיהומיות דלקתיות, ספטי מִתמַגֵל, hemoblastosis, הודג'קין et al.) והיא מעידה על חומרתה, אבל לרמות נורמליות ESR לא תמיד מצביעים בהעדר פתולוגיה. האצה של שקיעת כדורית הוא הקל על ידי עלייה בתכולת globulins, פיברינוגן, כולסטרול בדם וירידה צמיגות של הדם. האטה של שקיעת כדור הארץ אופיינית למדינות המלוות בהמונוקונרטיון, עלייה בתוכן האלבומין וחומצות מרה.

ההמוגרפיה בחולים עם שחפת משתנה במהלך הטיפול. משמרות המטולוגיות נעלמות מהר יותר, כך ההתערבות הטיפולית מוצלחת יותר. עם זאת, יש לזכור את ההשפעה על hemopoiesis של תרופות אנטיבקטריאליות שונות. הם לעיתים קרובות לגרום eosinophilia, במקרים מסוימים - ליקוציטוזיס, ולעתים קרובות leukopenia עד agranulocytosis ותגובה לימפה-רשתי. שליטה המטולוגית שיטתית וניתוח נכון של הנתונים המתקבלים חיוניים להערכת המצב הקליני של המטופל, הדינמיקה של התהליך ואת האפקטיביות של הטיפול בשימוש.

[5], [6], [7], [8], [9],

ניתוח קליני של שתן

עם שחפת של מערכת השתן, urinalysis היא שיטת המעבדה העיקרית אבחון. אתה יכול לצפות lukocyturia, erythrocyturia, proteinuria, hypoisostenuria, mycobacterium שחפת, בקטריריה לא ספציפית.

Leucocyturia - הסימפטום של שחפת הנפוץ ביותר של מערכת השתן לפני כימותרפיה ואין ספציפי רק במקרים חריגים, כגון הכחדה מוחלטת של לומן של השופכן. מבחן Nechyporenko (קביעת מספר leucocytes ב 1 מ"ל של שתן) עוזר יותר אובייקטיבי להעריך את מידת leukocyturia nefrotuberkuloze עם, ובמקרים מסוימים לזהות אותו בדיקת שתן רגילה. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי לוקוציטוריה עלולה להתרחש pyelonephritis אקוטי כרונית, דלקת שלפוחית השתן, דלקת השתן, אבנים כליות השופכן.

אריתרוציטוריה. כמו גם ליקוציטוריה. נחשבים לאחד הסימנים המעבדה השכיחים ביותר של שחפת של מערכת genitourinary. תדירות ההמטוריה תלויה בשכיחות התהליך, היא מתגברת ככל שמתפתח תהליך השחפת ההרסני בכליה. Erythrocyturia ללא leukocyturia אופייני יותר בשלבים הראשונים של שחפת כליות. Hematuria, אשר השולט מעל לוקוציטוריה, הוא טיעון חשוב לטובת שחפת כליות כאשר הוא מובחן pyelonephritis לא ספציפי.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

בדיקת דם ביוכימית

עם שחפת, שינויים בפרמטרים ביוכימיים מסוימים תלויים בעיקר בשלב של התהליך, סיבוכים שונים מחלות במקביל. בחולים עם שחפת לא פעילה של הריאות ואיברים אחרים, כמות החלבון וחלבון הדם בסרום אינה משתנה וקובעת את התוכן הרגיל שלהם.

בצורות חריפות של המחלה, כמו גם עם החמרה והתקדמות של צורות כרוניות של שחפת, מקדם האלבומין גלובולין פוחתת.

Essential בהערכת המצב התפקודי של ניזק כבד אורגניים שחפת וסיבוכיה היא הקביעה הכולל סרום בילירובין הישיר, AST (ACT), aminotransferase אלאנין (ALT). קביעת דינמי של רמת aminotransferases. בילירובין בטיפול בחולי שחפת, בעיקר בצורות חמורות, הוא מרכיב חובה בבדיקה ביוכימית של חולי שחפת ומבוצע מדי חודש.

הערכה של מצב תפקודי של הכליות כוללת את קביעת קריאטינין בסרום ואת החישוב של קצב סינון גלומרולרי על פי הנוסחה Cockcroft-Gault. חישוב קצב סינון גלומרולרי באמצעות מדגם של רברג נותן תוצאות פחות מדויקות.

המטרה העיקרית של מחקרים ביוכימיים דינמיים של חולי שחפת היא לעקוב אחר מהלך התהליך, גילוי בזמן של תופעות לוואי של סמים ותיקון נאות של הפרעות הומאוסטטיות הנובעות.

[17], [18], [19]

יישום שיטות ביוכימיות בחקירה בשחפת אקסטרה - פולמונארית

המדד האינפורמטיבי ביותר הוא התוכן של חומצה tuberculostearic בנוזלים ביולוגיים, אך ההגדרה שלה קשורה קשיים טכניים (הצורך כרומטוגרפיה גז ספקטרומטריית מסה).

מדידה פרוספקטיבית של הפעילות של אדנוזין deaminase - אנזים, שנקבע נוזלים: סינוביאלי, קרום הלב, אדמת השדרה או השדרה. המפיקים העיקריים של adenosine deaminase הם לימפוציטים ומונוציטים. קביעת הפעילות של adenosine deaminase בנוזלים ביולוגיים מקלה על אבחון של שחפת סינוביטיס, שחפת של בלוטות לימפה, דלקת קרום המוח השחפת, שחפת סרוסיטיס.

כמה אינדיקטורים ביוכימיים בשל אי ספציפיות שלהם נקבעים רק נוזלים ביולוגיים, קרוב המוקד פצע. למדוד את רמת האינדיקטורים בתגובה הזרקת תת עורית או תוך העורית של שחפת (בדרך כלל לפני 48 ו - 72 שעות לאחר זה). לאחר מכן, דרגת ההוספה של רמת הסמן (באחוזים) מחושבת ביחס לרמה ההתחלתית.

קביעת אופטימלית בשתן של הפעילות של אנזים ספציפי איבר טרנסאמידאז, המראה של אשר צוין כאשר הכליות של הטבע השונים מושפעים. המחקר של transamidinase מוצדק רק בתנאים של הזרקה תת עורית של שחפת על מנת להחריף את תהליך דלקת מקומי. לקבוע את הפעילות של transamidine בשתן בתחילה 24-72 שעות לאחר כניסתה של 50 TE שחפת. הגדלת הפרמנטיה בשתי פעמים ומעלה מאפשרת ב -82% מהמקרים להבחין בין שחפת פעילה של הכליות כתוצאה מהחרפת דלקת כרונית כרונית (pyelonephritis).

עם שחפת של איברי המין הנשיים, הריכוז של haptoglobin ו dialdehyde malonic בדם נקבעים בתנאים של מבחן שחפת פרובוקטיבי. זריקה מוזרקת תת עורית במינון של 50 TE ו 72 שעות לאחר מכן ביצעו מחקר ביוכימי השני. במקרה של אטיולוגיה של שחפת, מידת העלייה ברמת הפטוגלובין אינה פחות מ -28%, ורמת המלונדיאלדהיד היא 39% או יותר. קביעת הפעילות של adenosine deaminase בנוזל פריטונאלי המתקבל מהחלל דאגלס משמש גם. הנקבים נבדקים מחדש 72 שעות לאחר הזרקת intradermal של שחפת במינונים של 0.1 TE ו 0.01 TE לתוך הקרנה של איברים פנימיים פנימי על דופן הבטן הקדמי. לטובת תהליך שחפת, עלייה בפעילות של אדנוזין deaminase הוא 10% או יותר בהשוואה הראשונית.

כאשר העין מושפעת, התגובה המוקדית המתרחשת בעין בתגובה לגירוי אנטיגני נבדקת. זה לא רצוי לפתח תגובה בולטת, מלווה ירידה תפקודים חזותיים. מאז ההערכה של תגובות מוקד מינימלי הוא לעתים קרובות קשה, עבור האובייקטיביזציה של המסקנה מומלץ להכוות במקביל על מידת הצמיחה בסרום הדם של haptoglobin או אדנוזין deaminase.

כל המחקרים הביוכימיים צריכים להתבצע בשילוב עם שיטות אחרות.

[20], [21], [22], [23],

דם מערכת מחקר קרישה

רלוונטיות של מצב המחקר של מערכת קרישת הדם של שחפת נגרמת על ידי נוכחות של מספר חולים עם haemoptysis שחפת ריאתית או דימום ריאתי, כמו גם סיבוכים hemocoagulation בטיפול כירורגי של שחפת. בנוסף, זרימה סמויה של hemocoaxulation intravascular שמלווה באופן טבעי שחפת משפיע על מהלך המחלה ואת האפקטיביות של כימותרפיה.

בחולים עם שחפת ריאתי עם דומיננטיות של רכיב exodative של דלקת, ירידה בפעילות הדם נוגדי קרישה נצפתה. בחולים עם שכיחות נמוכה של נגע ספציפי בתוך הריאות עם דומיננטיות של מרכיב דלקתי תוך-פרודוקטיבי hemocoagulation הביעו מעט. בחולים עם שחפת ריאתית עם hemoptysis ומערכת קרישת דם מדינת דימום ריאתי הוא שונה: אצל חולים עם אובדן דם נמוך בבית gemoptoe גובה או מייד לאחר הסיום שלה יש עלייה חדה ביכולת קרישה בדם עקב התעצמות חמורה של trombinoobrazovaniya תוך שמירת קרישה "מבנית" מוגברת. בחולים עם איבוד דם מסיבי, ירידה בפוטנציאל הקרישה נצפתה בשל ירידה בריכוז הפיברינוגן. פעילות פקטור XIII, ספירת טסיות. בשלב של טיפול כירורגי, חולים עם צורות מוגבלות של שחפת לא חווים הפרעות משמעותיות קלות עם מערכת הומאוסטזיס. חולים עם תהליך נרחב בביצוע pnevmon- או plevropnevmonektomii קרובות לפתח דסק"ש, אשר יכול לקחת את הטופס של "המחלה השנייה."

כדי לפקח על מצב קרישת דם בחולים עם שחפת ריאתית צריכה להתבצע קביעת זמן thromboplastin חלקית מופעל (aptt), פיברינוגן, זמן תרומבין, מדד פרותרומבין ודימום פעם קרישה.

[24], [25], [26], [27], [28]

מחקר הורמונלי

תצפיות ניסויים קליניים מודרניים מצביעים על נוכחות של שינויים במצב ההורמונלי בדלקת ריאות ספציפית. הוא הוכיח כי התיקון של תפקוד לקוי של כלית יותרת המוח, מערכות-תריס יותרת המוח ותפקוד לבלב בשיתוף עם הטיפול אנטי-TB לתרום הפעלה של fibrogenesis ותיקון בכל דלקת לוקוס ספציפית.

המדינה תפקודית של מערכת היפופיזה-התריס נשפטת על ידי התוכן בנסיוב הדם של triiodothyronine (T ₃ ), תירוקסין (T ₄ ), בלוטת התריס יותרת המוח הורמון מגרה (TSH). נמצא כי היפותירואידיזם תת-קליני מזוהה 38-45% מחולים עם שחפת ריאתית, ולרוב זה מאובחן עם תהליך צורות יופץ פיברו-מחל. תחת אותם בצורות ביותר רמות מופחתות באופן דראמטי של שני T ₃ ו- T ₄, ומגיע לחוסר איזון של הורמונים אלה בצורה של הגדלת היחס של T ₄ / T _ים.

פונקציה ו- Adreno Cortico מוערכת על ידי רמת קורטיזול בנסיוב הדם, ומערכת האנדוקרינית הפונקציה של הלבלב - ריכוז של האינסולין החיסוני תגובתי. בשלב החריף של המחלה המדבקת, הצורך בקורטיזול אנדוגני ואינסולין עולה. Hyperinsulinemia גם מעיד על עמידות האינסולין של רקמות הגוף, אשר אופייני לכל תהליך דלקתי פעיל, בפרט, ספציפי. קביעת פונקציה glucocorticoid של בלוטות יותרת הכליה עם שחפת ריאתי פעיל מאפשר לחשוף את נוכחותו של hypercorticism ברוב המטופלים. רמות נורמליות של ריכוז דם קורטיזול בחולה עם דלקת זיהומית בתקופה האקוטית צריכות להיחשב לכישלון יחסי של פונקציה בסטרואידים של קליפת יותרת הכליה שיכול לשמש כבסיס לקיום מינוני טיפול בתחליפים נאות של גלוקוקורטיקואידים.

כמעט שליש מהחולים עם שחפת ריאות יכולים לקבוע כי רמת insulinemia בהם הוא נמוך למדי מתקרב לגבול התחתון של הנורמה, בעוד 13-20% צופים היפרנסוליניזם משמעותי. הן ההיפו והיפרינסוליניזם היחסי הן גורמי סיכון גבוהים להתפתחות הפרות של חילוף החומרים בפחמימות בדרגות שונות. שינויים אלה בפעילות התפקודית של תאי B של הלבלב דורשים ניטור קבוע של גליקמיה בחולים עם שחפת ומניעת סוכרת. כמו כן. זה מהווה הצדקה נוספת עבור תועלתיות של שימוש במינונים פיזיולוגיים של אינסולין בטיפול מורכב של שחפת.

באופן כללי, רמות נמוכות של הורמוני בלוטת התריס hypercortisolemia חוסר איזון שלהם טווח ההגעה הגדול hyperinsulinism בחולים עם מהלך חמור של תהליך שחפן, עם נזק ריאתי נרחב ותסמינים חמורים של שיכרון שחפת.

אבחון מיקרוביולוגי של שחפת

מחקרים מיקרוביולוגיים נחוצים בזיהוי חולים עם שחפת, אימות האבחון, מעקב ותיקון כימותרפיה, הערכת תוצאות הטיפול, במילים אחרות, מהרגע שהחולה נרשם בשחפת לפני הוצאתו.

כל התוכניות והפרויקטים האפידמיולוגיים מבוססים על הערכה של מספר המפרקים החיידקיים, אשר לא ניתן לעשות זאת ללא שימוש בשיטות מעבדה לאיתור השחפת של mycobacteria. בסקר של האוכלוסייה הלא מאורגנת, אחוז הפולשים החיידקים מגיע ל -70 או יותר, מה שהופך את שיטות המעבדה לאמצעי יעיל מספיק לזיהוי חולי שחפת בקרב קבוצת אוכלוסייה זו.

שיטות מיקרוביולוגיות מסורתיות לאבחון שחפת הן מחקרים בקטריוסקופיים ותרבותיים. שיטות מודרניות לשקול את הטיפוח של שחפת mycobacterium במערכות אוטומטיות, את ההגדרה של PCR. עם זאת, כל השיטות הללו בהכרח לשלב עם שיטות בקטריולוגיות קלאסית.

אוסף חומר אבחון

האפקטיביות של מחקרים במעבדה תלויה במידה רבה באיכות החומר האבחוני. עמידה בכללי האיסוף, האחסון וההובלה של חומר אבחון ויישום מדויק של אלגוריתם הערכת החולה משפיעה ישירות על התוצאה ומבטיחה בטיחות ביולוגית.

עבור בדיקות על שחפת, מגוון של חומרים משמשים. בשל העובדה כי נגעי שחוף הצורה הנפוצה ביותר logkih- TB, החומר הבסיסי למחקר לשקול סוגי ליחה אחרים של tracheobronchial הנתיק: הפרשות בדרכי נשימה עליונות שהושגו לאחר שאיפת תרסיס: כביסות סימפונות; שטיפות ברונכואלוואליות; חומר שהושג על ידי ברונכוסקופיה, ו transtracheal intrapulmonary ביופסיות מן aspirates סימפונות, מטליות וגרון, תפליט מפצעים מריחים אל.

יעילות המחקר גדלה אם מתבצעת איסוף חומר מבוקר מחולה. לצורך כך מוקצה חדר מאובזר במיוחד או רכש מוניות מיוחדות. אוסף החומר הוא הליך מסוכן, ולכן יש צורך לאסוף חומר למחקר, שמירה על הכללים של בטיחות זיהומיות.

החומר לבדיקה על שחפת mycobacterium נאסף בבקבוקים סטריליים עם כובעים הברגים בחוזקה כדי למנוע זיהום הסביבה ולהגן על החומר הנאסף מזיהום.

בקבוקונים עבור אוסף של חומר אבחון חייב לעמוד בדרישות הבאות:

• חייב להיות עשוי מחומר עמיד;
• צריך בקלות להמיס במהלך מעוקר;
• להיות נפח מספיק (40-50 מ"ל):
• יש פתח רחב עבור אוסף כיח (בקוטר לא פחות מ -30 מ"מ);
• להיות קל, שקוף או שקוף, כך שתוכל להעריך את כמות ואיכות המדגם שנאסף מבלי לפתוח את המכסה.

כדי להשיג תוצאות מחקר אופטימליות, יש לציית לתנאים הבאים:

• איסוף החומר לפני תחילת הכימותרפיה;
• חומר עבור המחקר יש לאסוף לפני צריכת הבוקר של מזון ותרופות;
• עבור מחקר זה רצוי לאסוף לפחות 3 דגימות של ליחה בבוקר. לאסוף כיח במשך 3 ימים רצופים;
• יש למסור את החומר שנאסף למעבדה בהקדם האפשרי:
• במקרה שבו אי אפשר מיד להעביר את החומר למעבדה, הוא מאוחסן במקרר בטמפרטורת אוויר של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 48- שעות;
• בעת הובלת החומר, יש צורך לעקוב מקרוב אחר שלמות של צלוחיות.

כיח שנאסף נכון הוא רירי או mucopurulent. הנפח האופטימלי של כיח שנבדק הוא 3-5 מ"ל.

כיח נאסף תחת פיקוחו של איש מקצוע רפואי. אנשים האחראים על איסוף כיח צריך לעקוב אחר יישום כללים מסוימים:

• יש צורך להסביר למטופל את מטרת המחקר ואת הצורך להשתעל לא רוק או ריר הלוע, אלא התוכן של מערכת הנשימה העמוקה. זה יכול להיות מושגת כתוצאה של שיעול פרודוקטיבי המתרחשת לאחר כמה (2-3) נשימות עמוקות. כמו כן יש להזהיר את המטופל כי הוא צריך לשטוף את פיו עם מים רותחים, כדי להסיר את החלק העיקרי של microflora גדל בחלל הפה ואת שאריות מזון לעכב את בדיקת כיח;
• עובד רפואי המשתתף באוסף כיח, בנוסף לחלוק רחצה וכובע, חייב ללבוש מסכה, כפפות גומי וסינר גומי;
• העומד מאחורי המטופל, מומלץ להשאיר את הבקבוק קרוב ככל האפשר לשפתיו ולפנות אותו מיד ליחה תוך כדי שיעול, ויש לספק כי זרימת האוויר מופנית מעובדת הבריאות:
• עם השלמת איסוף האלוטום, על העובד הרפואי לסגור בזהירות את הבקבוקון במכסה ולהעריך את הכמות והאיכות של כיח שנאספו. לאחר מכן הבקבוק מתויג ומוכן ב bix מיוחד להובלה למעבדה.

אם החולה אינו מייצר ליחה, אמש בשעות הבוקר המוקדמות ביום אוסף של החומר הדרוש כדי לתת לו מכייח :. תמצית של השורשים של מרשמלו (mukaltin), bromhexine, ambroxol, וכו '- או להחיל שאיפה מעצבן באמצעות הציוד המותקן בחדר לאסוף ליחה. החומר שנאסף בדרך זו אינו כפוף לשימור ויש לבחון אותו ביום הגבייה. כדי למנוע "culling" שלה במעבדה בכיוון צריך לעשות סימן מיוחד.

אם לא מבוצעים מחקרים מיקרוביולוגיים במתקן זה, יש להעביר את החומר האבחוני שנאסף למרכז למעבדה, בתנאי שהחומר נשמר במרווחי זמן בין משלוחים במקרר או עם שימוש בחומרים משמרים. מסירת חומר למעבדה בקופסאות הובלה, אשר ניתן לחטא בקלות. כל מדגם צריך להיות מסופק עם התווית המתאימה, ואת כל צריך להיות מלא עם טופס נלווה.

[29], [30], [31],

מצבים ותדירות בחינה של המטופלים

בשלב הראשון, שנקרא אבחון, בדיקה של החולה לשחפת, יש צורך לבחון לפחות 3 מנות כיח עבור 2 או 3 ימים. שנאספו תחת פיקוח של אנשי רפואה, אשר מגביר את היעילות של מיקרוסקופ.

ההקרנה העיקרית לשחפת צריכה להתבצע על ידי כל מוסדות האבחון הרפואי של מערכת הבריאות. לאחרונה, מרכזים של מיקרוסקופים כביכול, מצוידים במיקרוסקופים מודרניים ובציוד לבטיחות מגיפה, אורגנו על בסיס מעבדות אבחון קליניות כדי לשפר את היעילות של הבדיקה הראשונית.

במתקני נגד שחפת, נעשה שימוש בבדיקת סינון הכוללת בדיקת כיח או חומר אבחוני אחר לפחות 3 פעמים למשך 3 ימים. במהלך הטיפול, מחקרים מיקרוביולוגיים מבוצעים באופן קבוע לפחות פעם בחודש במהלך שלב הכימותרפיה האינטנסיבית. במעבר לשלב הטיפול נערכים מחקרים בתדירות נמוכה יותר - עם מרווח של 2-3 חודשים, בעוד שתדירות המחקר מצטמצמת לשניים.

תכונות של אוסף של חומר אבחון עבור שחפת אקסטרפולמונרי

מאפיין חומר פתולוגי עם צורות extrapulmonary של שחפת - ריכוז נמוך שחפת Mycobacterium בו, אשר דורש שיטות רגישות יותר של מחקרי מיקרוביולוגיות, בעיקר על מדיום טכניקות זריעה.

עם שחפת של מערכת genitourinary, שתן הוא חומר הלימוד הנגיש ביותר. איסוף שתן צריך להיעשות על ידי אחות מאומן במיוחד.

האיברי המין החיצוניים נשטפים במים עם סבון או פתרון חלש של פרמנגנט אשלגן. הפתיחה החיצונית של השופכה מטופלת בקפידה. בבקבוקון סטרילי, חלק ממוצע של שתן הבוקר נאסף: אצל גברים, באופן טבעי, אצל נשים, באמצעות קטטר. השתן מאגן הכליה נאסף בצינורות סטריליים עם צנתור של כליה אחת או שתיים, במקרה האחרון - בהכרח בנפרד מכל כליה. כמות קטנה של שתן זה centrifuged, משקעים נבדק.

אצל גברים, זרע, מבחנים בודדים, סוד הערמונית נתון לצנטריפוגה כדי לקבל משקע. עם כל לוקליזציה של תהליך מסוים באזור איברי המין אצל גברים, עיסוי הערמונית יכול לקדם את הפרשת הפרשות המכילות שחפת mycobacterium.

דם הווסת אצל נשים נאסף על ידי מציצה או שימוש בכובע קפקא. החומר המתקבל הוא משוחרר מתאי דם אדומים, לשטוף אותו עם מים מזוקקים ואחריו צנטריפוגה. המשקע נבדק.

הקצבות מתעלת צוואר הרחם של הרחם נאספות בתפקוד או בכובע של קפקא, כלומר, רצוי לצבור 1-2 מ"ל של חומר פתולוגי.

חומר המתקבל מהתערבויות אופרטיביות על הכליות, איברי המין. עם ביופסיות, שריטות מן האנדומטריום, homogenize. כדי לעשות זאת, היא ממוקמת מרגמה סטרילית מרוסק ביסודיות עם מספריים סטריליים. כדי תרחיף זו נוספה חול נהר סטרילי בסכום השווה למשקלו, ואז עקף עם 0,5-1.0 מיליליטר פתרון נתרן כלורי איזוטוניים, והכל היה triturated עד מסה בצקה בתוספת פתרון נתרן כלורי איזוטוניים (4-5 מיליליטר). ואז המסה מותר להסתפק 1-1.5 דקות, supernatant נבדק.

שחפת של עצמות ומפרקים. נקבים (מוגלה של מורסות) שהושג עם מזרק סטרילי ממוקם במנות סטריליות ומסר מיד למעבדה. פיפטה סטרילית, מלוחים בעבר עם תמיסת כלור נתרן איזוטוני סטרילי, לקחת 2-5 מ"ל של מוגלה, להעביר אותו בקבוק של חרוזים להוסיף עוד 2-3 מ"ל של תמיסת כלורי נתרן איזוטוני. הבקבוק סגור עם פקק ומזועזע במנגנון ג 'וקר במשך 8-10 דקות. ההשעיה homogenized נבדק.

בצורות נוקבות של שחפת אוסטאורטיקולרית, מוגלה מהפיסטולה נלקחת. פריקה שופע נאסף ישירות לתוך מבחנה. במקרים פיסטולה pyorrhea רזה נשטף עם פתרון נתרן כלורי איזוטוני סטרילית, לבין כביסות נאספו לתוך מבחנה, או פיסת טמפון ספוג עם מוגלה נשלח לניתוח.

החומר הכירורגי המתקבל במהלך התערבויות כירורגיות על העצמות והמפרקים יכול להכיל המוני המוניים, גרגירים, רקמת צלקת, רקמות עצם, רקמת ממברנה סינוביאלית ומצעים אחרים. הטיפול שלה מתבצע, כמו שחפת של הכליות.

מחקר מיקרוביולוגי של נוזל סינוביאלי ב 3% נתרן ציטראט פתרון (יחס 1: 1) כדי למנוע קרישה מתבצעת מיד לאחר לנקב.

שחפת של בלוטות הלימפה. מוגלה, שחולצו במהלך לנקב של בלוטות לימפה, נבדק גם. כמו מוגלה של המורסות. הרקמות של בלוטות הלימפה המתקבלות במהלך התערבויות כירורגיות, ביופסיות, נבדקות, כמו עם צורות אחרות של שחפת.

המחקר של מסות צואה על שחפת mycobacterium הוא נדיר ביותר, בשל היעדר כמעט מוחלט של תוצאות חיוביות.

[32], [33], [34], [35], [36],

מיקרוסקופיה

מיקרוסקופיית כיח היא שיטה מהירה יחסית, פשוט וזול כי יש להשתמש בכל המקרים עם חשד שחפת. בנוסף, מחקר זה נערך על מנת להעריך את היעילות של כימותרפיה כדי לוודא את ההתאוששות או כישלון הטיפול אם אין מבחן תרבות.

נעשה שימוש בשתי שיטות בדיקה מיקרוסקופיות:

• שיטת המיקרוסקופיה הישירה, כאשר מריחה מוכנה ישירות מחומר האבחון;
• שיטה של מיקרוסקופיה של משקעים מוכנים מחומר מטוהרים לטיפול בתרבות.

השיטה הראשונה משמשת במעבדות אלו, בהן מתבצעות רק מחקרים מיקרוסקופיים (מעבדות קליניות ואבחון של הרשת הרפואית הכללית).

התוצאות הטובות ביותר של בדיקה מיקרוסקופית מתקבלות על ידי ריכוז החומר האבחוני (לדוגמה, על ידי צנטריפוגה).

כדי לזהות שחפת mycobacterium עם הסתברות של 50% בעת ביצוע מיקרוסקופיה, 1 מ"ל של כיח צריך להכיל יותר מ 5000 תאים מיקרוביאליים. כיח של חולים עם צורות ריאות של שחפת בדרך כלל מכיל כמות משמעותית של חיידקים מהר חיידקים, אשר מאפשר להם להיות מזוהה באופן מהימן על ידי חיידקי. ניתן לשפר את רגישות האבחון של שיטה זו על ידי בחינת מספר דגימות כיח מחולה אחד. תוצאה שלילית של בדיקה בקטוריוסקופית אינה שוללת את האבחנה של שחפת, כמו כיח של חלק מהחולים מכיל פחות mycobacteria מאשר יכול להיות מזוהה עם מיקרוסקופ. הכנה גרועה של כתם כיח יכול גם לגרום לתוצאה שלילית של בדיקה בקטריוסקופית.

השיטה הנפוצה ביותר עבור איתור של mycobacteria חומצה מהירה במריחה הוא צבע על פי Tsiol-Nelsen. השיטה מבוססת על חדירת fuchsin carbolic לתוך תא מיקרוביאלי דרך קרום הכוללת שכבת שומנים דונג, בעוד בו זמנית חימום וחריטה חזקה פעולה של פנול. שינוי לאחר מכן של כתם עם פתרון של 25% של חומצה גופרתית או 3% חומצה הידרוכלורית תוצאות שינוי צבע של כל מבנים שאינם חומצה מהר. האלמנטים דהוי של כתם מוכתמים עם פתרון 0.3% של מתילן כחול. Mycobacteria לא לתפוס את הצבעים aniline הרגיל, וכתוצאה מכך mycobacteria חומצה מהירה מוכתמות אדום ארגמן, חיידקים אחרים ואלמנטים הסלולר - בכחול.

כדי לחקור את הכתמים המוכתמים על ידי Tsillu-Nelsen, השתמש מיקרוסקופ המשקפת אור עם מטרה טבילה (הגדלה 90 או 100 פי) ו עינית עם הגדלה 7 או 10 פי. חקור 100 שדות ראייה, וזה מספיק כדי לזהות mycobacteria אחת במריחה. אם התוצאה של מחקר כזה היא שלילית, עבור אישור מומלץ להציג עוד 200 שדות ראייה. לרשום את התוצאות, המציין את מספר הזיהום חומצה מהירה bacilli (KUM).

בנוסף טכניקה זו, fluorochromes צבע משמשים עבור מיקרוסקופ זוהר, אשר מאפשר להשיג את התוצאות הטובות ביותר. השימוש בשיטה זו מגביר את היעילות של מיקרוסקופ ידי 10-15%. כאשר מטפלים mycobacteria עם צבעים זוהרים (auramine, rhodamine, וכו '), חומרים אלה גם להיקשר מבנים דמויי שעווה של תא מיקרוביאלי. כאשר מקרינים תאים צבעוניים עם מקור אור מרגש (ספקטרום מסוים של קרינה אולטרה סגולה), הם מתחילים זוהר עם אור כתום או אדום בהיר על רקע שחור או כהה ירוק. בשל בהירות גבוהה בניגוד של התמונה גלוי, הגדלה הכוללת של המיקרוסקופ ניתן לצמצם 4-10 פעמים, שדה המבט מתרחבת ואת זמן הצפייה של ההכנות פוחתת. יחד עם זאת, בשל עומק השדה הרבה יותר, אתה יכול להגדיל את הנוחות של המחקר.

כאשר מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש כדי להציג את אותו אזור, מרחם מוציאה זמן פחות משמעותי מאשר עם מיקרוסקופ אור של צביעת Tsiol-Nelsen. אם ליום עבודה מיקרוסקופ בוחן על 20-25 כתמים כאלה, ולאחר מכן בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הוא יכול לבחון יותר מ 60-80 דגימות בו זמנית. מיקרוסקופים מנוסים יודעים כי צבע של תאים עם תערובת של אוראמין ו rhodamine הוא ספציפי באופן מסוים עבור bacilli מהיר חומצה, אשר במקרה זה נראה כמו מקלות הזהב. ספרופיטים צבועים בצבע ירקרק.

יתרון חשוב נוסף של שיטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי - היכולת לזהות Mycobacterium שינו, איבד תחת השפעת גורמים לוואי, כולל כימותרפיה אינטנסיבית, רכוש kislotousotoychivosti והוא לא זוהה קשר עם מכתים זו Ziehl-Nelsenu.

החסרונות של השיטה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי כוללים את העלות הגבוהה יחסית של המיקרוסקופ ואת פעולתו. עם זאת, במעבדות מרכזיות או גדולות אחרות, שבו העומס עולה על הנורמה של 3 טכנאים מעבדה עובד עם שלושה מיקרוסקופים קונבנציונאלי, זה זול יותר להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי אחד במקום.

שיטות Bacterioscopic יש ספציפיות גבוהה במיוחד (89-100%). כ 97% מן התוצאות החיוביות המתקבלות על ידי כל שיטה של מיקרוסקופיה הם אישר באופן חד משמעי על ידי תוצאות הזריעה.

יש לציין כי כאשר בדיקה מיקרוסקופית של כתם של חומר פתולוגי, אי אפשר לקבוע את מינים השייכים של mycobacteria זיהו מהר חומצה. שיטה מיקרוסקופית מאפשרת לתת דעה רק על קיומו או אי קיומו של חומצה בהכנת מיקרואורגניזמים, אשר יכול להיות מוסבר על ידי הקיום בטבע של מספר רב של דומה מורפולוגית מיקרואורגניזמים עמידים חומצת nontubercular מורכבים mycobacteria שהחוף.

תוצאות המיקרוסקופיה מוערכות ביחידות semiquantitative.

על מנת להיות מסוגלים להשוות את התוצאות של שיטות שונות של מיקרוסקופיה, מקדמי אמפירי מוצגים. לדוגמא, כדי להשוות את התוצאות של מריחות מוכתמות צבעי ניאון, מיקרוסקופ אור מחקר נתונים (גדלת 1000 פעמים), יש צורך לחלק את מספר חיידקי חומצה-מהר זוהו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מקדם המקביל בהגדלה 250 של פי - אל 10, 450 לקפל - ל 4, עם 630 פי - ל 2.

תכונות של מיקרוסקופיה עבור שחפת extrapulmonary

מיקרוסקופ ישיר מבוצע, כמו גם מיקרוסקופיה של כתמים שהוכנו לאחר העשרה, ואחריו צביעת ציול נלסן או צבעים זורח. מיקרוסקופיה ישירה של כתמים אינה יעילה בגלל ריכוז נמוך של mycobacteria בחומר, ולכן זה יותר הגיוני להשתמש בשיטות העשרה. היעיל ביותר הוא צנטריפוגה. אם החומר הביולוגי הוא צמיג, צנטריפוגה משמש עם homogenization ועיבוי בו זמנית של החומר, אשר מבוצע באמצעות צנטריפוגות במהירות גבוהה עם צנטריפוגה כוח של 3000 גרם ו hypochlorite פתרונות. שיטות אחרות של העשרה, כגון הנפקה מיקרו, אינם משמשים כיום בשל היווצרות של אירוסולים מסוכנים ביולוגית.

[37], [38],

השיטה התרבותית של אבחנה של שחפת

שיטת הזריעה, או שיטת התרבות, רגישה יותר ממיקרוסקופיה המרחפת, ויש לה מספר יתרונות על פני השנייה. זה מאפשר לזהות כמה עשרות mycobacteria קיימא בחומר הבדיקה יש ערך אבחון גדול. זה חשוב במיוחד כאשר בוחנים את החומר מחולים שאובחנו לאחרונה או מטופלים אשר משחררים כמות קטנה של mycobacteria.

בהשוואה למיקרוסקופיה, מחקר התרבות מאפשר להגדיל את מספר חולי השחפת שאובחנו על ידי יותר מ 15-25%, כמו גם אימות של שחפת בשלבים מוקדמים יותר, כאשר המחלה עדיין ניתנת לטיפול. יתרון חשוב מאוד של המבחן התרבותי הוא האפשרות של קבלת תרבות exciter כי ניתן לזהות ולמד לגבי רגישות לסמים, ארסיות ותכונות ביולוגיות אחרות.

החסרונות של שיטות הטיפוח כוללים את משך הזמן שלהם (זמן ההמתנה של החומרים מגיע ל -10 שבועות). עלות גבוהה יותר, המורכבות של עיבוד של חומר אבחון.

עקרונות הטיפול בחומר אבחוני

שיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונליות לא ניתן להשתמש בניהול מחקרים על שחפת. זאת בשל העובדה. כי שחפת mycobacterium גדל לאט מאוד, רוב הדגימות הקליניות מכילים במהירות מיקרואורגניזמים pyogenic ו preogenfactive, פטריות. הצמיחה המהירה שלהם במדיה המזינים עשירים מעכבת את התפתחות mycobacteria ואינה מאפשרת להקצות את הגורם הסיבתי של שחפת, ולכן לפני נטיעת חומר אבחון בהכרח הוא שטופל מראש. בנוסף, mycobacteria משוחרר מן דרכי הנשימה של המטופל מוקפים בדרך כלל על ידי כמות גדולה של ריר, מה שהופך אותו קשה לרכז אותם. בהקשר זה, לפני שתילת כיח וחומרים דומים אחרים, נזלת שלהם, טיהור הכרחי.

כל חומרי הניקוי ו decontamins יש פחות או יותר מובהק השפעה רעילה על mycobacteria. כתוצאה של עיבוד, עד 90% של mycobacteria יכול למות. כדי לשמור מספיק מאוכלוסיית mycobacterial, חוסך את הצורך להשתמש בטכניקות עיבוד המאפשרים, מצד אחד, על מנת לדכא את חיידקי ממגל גדלו במהירות ומתועבת, ומצד שני - כדי לשמר את יכולת הקיום של mycobacteria נוכח החומר.

בהתאם החומר, ומידתה של הומוגניות וזיהום עבור עיבוד מראש באמצעות decontaminant שונים: כיח - פתרון הידרוקסיד 4% נתרן, פתרונות trohzameschonnogo פוספט נתרן 10%, בנזלקוניום כלוריד, פוספט Trisodium, NALC-NaOH (N-Acetyl-L-ציסטאין נתרן הידרוקסידי) בריכוז סופי של 1% NaOH, בשתן וחומרים נוזליים אחרים - פתרון חומצה גופרתית 3%, עבור דגימות מזוהמות, חומרים המכילים שומן - פתרון של חומצה אוקסלית כדי 5%. בנוסף, במקרים מסוימים, אנזימים, פעילי שטח (דטרגנטים) משמשים. השימוש Tween וכמה דטרגנטים אחרים מלווה מוות קטן יותר של תאים mycobacterial (40-50% לשרוד). עם זאת, הם יכולים לשמש רק עבור חומרים נוזליים. ההפצה הגדולה ביותר בעולם היתה NALC-NaOH. המיוצר בקבוצות. שיטה זו מאפשרת להקצות יותר מ 85% של האוכלוסייה של תאים mycobacterial. Decontamination של חומרי בד המכילים מוצק קשה יותר, שכן קשה לנחש את מידת הפיזור של החומר במהלך תהליך homogenization. לדוגמה, טיפול ביופסיות של בלוטות לימפה הוא מלווה לעתים קרובות על ידי תדירות מוגברת של זיהום על ידי הצומח זר. במקרה זה, 1% של etonium ניתן להשתמש.

חומר שאינו הומוגני הוא homogenized עם חרוזי זכוכית בנוכחות של חומרי ניקוי. החומרים הנוזליים הם מראש centrifuged ורק משקע מטופל.

טכניקות זריעה ודגירה

לאחר הטיפול, החומר הוא centrifuged, ובכך להאיץ את mycobacteria ולהגדיל את התוכן שלהם משקעים ("העשרה בוצה"). משקע וכתוצאה מכך הוא מנוטרל ו מחוסן (מחוסן) עם מדיה מזין צפופה או צינורות עם התקשורת נוזלי (סמיילי). משאר המשקעים מוכנים למבחן מיקרוסקופי. הטכניקה זריעת צריך למנוע זיהום צולבות של חומר אבחון.

עבור פרשנות קלינית מהימנה לתוצאות המחקר המיקרוביולוגי, יש להקפיד על הכלל הבא: מחקרים מיקרוסקופיים ותרבותיים חייבים להתבצע במקביל מאותו מדגם של חומר האבחון.

צינורות מחוסנים ממוקמים תרמוסטט ב 37 ^מעלות צלזיוס למשך 2 ימים במצב אופקי. זה מבטיח קליטה אפילו יותר של החומר לתוך המדיום התרבות. לאחר יומיים, צינורות מועברים למצב אנכי אטום הרמטית עם גומי או תקעים סיליקון כדי למנוע ייבוש התקשורת נזרע.

הגידולים הם וטופחו על 37 ^על C במשך 10-12 שבועות עם הצפייה השבועית. עבור כל תצוגה מקדימה, מתועדים הפרמטרים הבאים:

• התקופה נצפתה ויזואלית מיום זריעת הצמיחה;
• (מספר יחידות CFU);
• זיהום של היבול על ידי הצמח חיידקים זרים או פטריות (צינורות כאלה מוסרים);
• חוסר צמיחה גלוי. הצינורות נשארים תרמוסטט עד הצפייה הבאה.

מדיה מזין

חומרי הזנה שונים משמשים לטיפוח המיקובקטריה; צפופה, נוזלית למחצה, נוזלית. עם זאת, אף אחד מן התקשורת מזין ידוע יש מאפיינים המבטיחים את הצמיחה של כל התאים mycobacterial. בהקשר זה, 2-3 חומרי הזנה של הרכב שונים מומלץ להשתמש בו זמנית כדי להגדיל את האפקטיביות.

ארגון הבריאות העולמי ממליץ על סביבת לוונשטיין-ג'נסן כאמצעי תקני לבידוד העיקרי של הגורם הסיבתי של שחפת ולקביעת רגישות התרופה. זוהי סביבת ביצה צפופה שבה הגידול של mycobacteria מתקבל ביום 20-25 יום לאחר זריעת חומר חיובי bacterioscopically. גידולים של חומר חיידקי שלילי דורשים תקופת דגירה ארוכה יותר (עד 10-12 שבועות).

במדינה שלנו, המוצע E.R. Finn ביצה סביבה Finn-II. זה שונה בכך, במקום L-asparagine, הוא משתמש גלוטמט נתרן, אשר מפעילה דרכים אחרות של סינתזה של חומצות אמינו של mycobacteria. הצמיחה מופיעה על המדיום הזה קצת קודם לכן, ואת תדירות ההקצאה של mycobacteria הוא 6-8% גבוה יותר מאשר במדיום Lowenstein-Jensen.

כדי לשפר את היעילות של אבחון בקטריולוגי של שחפת אקסטרפולמונרי, רצוי לכלול התקשורת שונה פיין II במכלול של חומרי הזנה התקשורת. כדי להאיץ את הצמיחה, נתרן thioglycolate 0.05%, אשר מפחיתה את ריכוז החמצן, נוסף גם על בינוני מזין Finn-II. כדי להגן על אנזים ממערכות Mycobacterium מוצרים רעילים של חמצון השומנים ב אצטט בינוני פין-II מנוהל החומר נוגד החמצון α-טוקופרול בריכוז של 0.001 מ"ל / מק"ג. הזריעה של חומר האבחון מתבצעת על פי נוהל סטנדרטי.

במעבדות נגד שחפת של רוסיה, שינויים אחרים של חומרי הזנה צפופים משמשים; הציע G.G. Mordovian מזין בינוני "חדש", שפותח על ידי V.A. אמצעי תקשורת מזין A-6 ו- A-9, וכו '

בשל העובדה כי בתהליך של כימותרפיה הוא ניזק למערכות מטבוליות שונות של תאי חיידקים, אוכלוסיית mycobacterial כמה מאבדת את היכולת להתפתח באופן נורמלי בתקשורת מזין קונבנציונלית ומחייבת אוסמוטי תקשורת והתרבות מאוזנת (או חצי נוזלי).

הערכה והקלטת תוצאות זריעה של חומר אבחון

כמה זנים ומינים של mycobacteria לגדול לאט, הצמיחה יכולה להופיע אפילו על ידי 90 יום. מספר גידולים כאלה הוא קטן, אבל זה מאפשר לעמוד בגידולים תרמוסטט במשך 2.5-3 חודשים.

תרבויות virulent של שחפת mycobacterium בדרך כלל לגדול על סביבות ביצים צפופה בצורה של מושבות R- בגדלים שונים ומינים. מושבות יבשות, מקומטות, שנהב, מעט פיגמנט. בתקשורת אחרים, המושבה של שחפת mycobacterium עשוי להיות לח יותר. לאחר קורס של כימותרפיה או במהלך הטיפול, מושבות חלקות עם צמיחה לחה (S- טפסים) ניתן להקצות.

כאשר מבודדים יבולים, קבוצה של מחקרים מיוחדים משמש להבחין בין שחפת mycobacterium מ mycobacteria שאינם שחפת ו saprophytes עמיד חומצה.

תגובה חיובית ניתנת לאחר בדיקה מיקרוסקופית חובה של כתם Tsiol-Nelsen מוכתמת מן המושבות הבוגרות. במקרה של צמיחה של mycobacteria ב כתמים, מקלות אדומים בהירים נמצאים כי לשקר או בקבוצות יוצרים אשכולות בצורה של לבד או צמות. בתרבויות צעירות, מבודדות במיוחד מטיפול ארוך טווח של חולים עם כימותרפיה, mycobacteria שונה פולימורפיזם הביע, עד בנוכחות מוט בצורה, יחד עם קצר, כמעט גרסות coccoid או מוארכות שדומה תפטיר.

קצב הגידול של mycobacteria מסומן על ידי התוכנית הבאה: (+) - 1-20 cfu במבחנה (הפרשת חיידקים דלילה); (++) - 20-100 CFU במבחנה (הפרשת חיידקים מתונה); (+++) -> 100 CFU במבחנה (הפרשת חיידקים בשפע). באבחון המעבדה של שחפת, זה לא מספיק כדי לענות אם mycobacterium מזוהה בשיטה זו או אחרת. יש הבנה מפורטת של היקף ואופי של האוכלוסייה mycobacterial, הרכב הרכב שלה. נתונים אלה מאפשרים לנו לפרש נכונה את מצב התהליך, לתכנן טקטיקות ולעדכן את הטיפול.

בשנים האחרונות, כדי להאיץ את הצמיחה של mycobacteria, התקשורת מזין על בסיס אגר עם תוספי צמיחה שונים ואת השימוש של תערובת גז מיוחדת הוצעו. כדי להשיג את הצמיחה של mycobacteria על מדיה אלה, במהלך הטיפוח, אווירה עם תוכן גבוה של פחמן דו חמצני (4-7%) נוצר. מיוחד CO _2- incubators משמשים למטרה זו . עם זאת, המערכות האוטומטיות המפותחות ביותר לטיפוח מיקובקטריה: MGIT-BACTEC-960 ו- MB / Bact.

מערכת אחת כזו - מערכת MGIT (צינור המציין צמיחת mycobacteria), אשר מתייחסת לפיתוח של טכנולוגיה גבוהה מיועדת לאבחון בקטריולוגית מהיר של שחפת ורגישותם Mycobacterium לתרופות הקו הראשון, וכמה תרופות קו שני. MGIT מתמקדת בשימוש בו כחלק מהמכשיר VASTES-960. מיקרואורגניזמים מעובדים בצינורות מיוחדים עם בינוני מזין נוזלי על בסיס בינוני Middlebrook -7H9 שונה. כדי לעורר את הצמיחה של mycobacteria ו לדכא את הצמיחה של microflora חיצוני, MGIT גידול מוסף תערובת של תרופות אנטיבקטריאליות PANTA משמשים.

הצמיחה של מיקרואורגניזמים נרשמת באופן אופטי. הוא מבוסס על פלואורסצנציה, אשר מתרחשת כאשר החמצן הוא נצרך על ידי mycobacteria במהלך הצמיחה. צבע fluorochromic תלוי חמצן נמצא בתחתית של מבחנה מיוחדת מכוסה בשכבת סיליקון. Mycobacteria שכפול מוביל לירידה בכמות החמצן בצינור וצמצום הריכוזיות גורמת לעלייה הקרינה, אשר הופך לגלוי תחת קרינה על ידי צינורות אור אולטרה סגול מובנה photosensor רשומים אוטומטית VASTES-960 מכשיר. עוצמת הארה נרשמת ביחידות של צמיחה (יחידות גידול GU). נתוני הצמיחה נרשמים במחשב, שם ניתן לשמור אותם באופן אוטומטי. ניתוח מחשב של עקומות הצמיחה יכול לספק מידע על נוכחות של בריכות שונות של mycobacteria, כולל לא שחפת, וגם מסייע להעריך את מאפייני הצמיחה של mycobacteria.

כתוצאה מהכניסה של מערכות כאלה, הזמן לצמיחה של mycobacteria ירד באופן משמעותי, ממוצעים של 11 ימים על VASTES-960 ו 19 ימים על MB / Bact לעומת 33 ימים על תקן בינוני מזין צפוף. יש לציין כי מערכות אלה דורשות כוח אדם מוסמך ביותר. זריעת החומר על מדיה נוזלית מלווה בהכרח בזריעה על מדיום לבנשטיין-ג'נסן, הממלא את תפקידו של מעתק באותם מקרים בהם שחפת השחפת אינה גורמת לצמיחה בתקשורת אחרת.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

קביעת רגישות התרופה של mycobacteria

קביעת הספקטרום ומידת הרגישות של mycobacteria לתרופות נגד שחפת יש חשיבות קלינית רבה, כמו גם הערכה אפידמיולוגית של התפשטות שחפת עם עמידות לתרופות. בנוסף, ניטור של עמידות לתרופות מאפשר להעריך את היעילות של תוכנית שחפת בכללותה, להיות אינדיקטור אינטגרלי של הביצועים של כל המרכיבים של פעילויות אנטי שחפת.

ריבוי ועיתוי רגישות לתרופות:

• לפני תחילת הטיפול פעם אחת לקביעת האסטרטגיה והטקטיקה של הטיפול:
• כאשר מבודדים מתרבויות חולה מחומרים שונים (כיח, נוזל BAL, שתן, exudates, liquor, וכו '), כל זנים בודדים נבדקים:
• בסוף השלב האינטנסיבי של הטיפול בהעדר דינמיקה קלינית ורדיולוגית:
• אם יש צורך לשנות את משטר הטיפול במקרים הבאים:
  • העדר כתם כיח;
  • בידוד מחדש של התרבות לאחר כיח כתם שלילי;
  • עלייה דרסטית במספר CMU ב ספוגית לאחר הירידה הראשונית. זה ידוע היטב כי זנים של שחפת mycobacterium, שהם הטרוגניים במונחים של רגישות לסמים, מבודדים מן החומר מחולה עם שחפת. הרגישות של זנים לתרופות נגד שחפת עשויה להיות שונה בספקטרום של תרופות, דרגה, תדירות וקצב התרחשות ההתנגדות.

מידת עמידות לתרופות של מחלת שחפת Mycobacterium נקבעה בהתאם לקריטריונים שנקבעו, אשר מתמקדים המשמעות הקלינית והיציבות תלוי בפעילות של תרופה אנטי-TB, פרמקוקינטיקה שלה, ריכוזיות הנגע. המינון הטיפולי המקסימלי וכן הלאה.

קביעת רגישות התרופה של mycobacteria מתבצעת כיום בשיטות מיקרוביולוגיות:

• ריכוזים מוחלטים (שיטת דילול על מדיה מזינה צפופה או נוזלית)
• פרופורציות,
• מקדם התנגדות.

בדרך כלל, ההתנגדות באה לידי ביטוי בצורה של צמיחה נצפתה חזותית של המושבות של שחפת mycobacterium, אבל יש שיטות המניעות צמיחה בשלבים המוקדמים של חלוקת התא של mycobacteria בצורה של תגובות צבע. שיטות אלה לקצר את זמן הבדיקה מ 3-4 עד 2 שבועות.

כפי מאוחד ברוסיה הוארך, המומלץ על ידי שיטת כימותרפיה WHO ועדת ריכוזים מוחלטים, וזה מנקודת מבט מתודולוגית, הוא הפשוט ביותר, אבל זה דורש דיוק וסטנדרטיזציה גבוהים של נהלי מעבדה. מבחן הרגישות לסמים מורכב ממערכת של מבחנות עם מדיום מזין שונה עם תרופות נגד שחפת. סט מורכב של 2-3 צינורות עם ריכוזים שונים של כל אחת מהתרופות, צינורות מלאה אחת בלי סמים לסביבה צינור אחד המכיל 1000 מק"ג / מ"ל של נתרן סאלי tsilovokislogo או 500 מיקרוגרם / מ"ל paranitrobenzoynoy nontubercular חומצה לזהות צמיחה של mycobacteria.

כדי להכין קבוצה של התקשורת עם ההכנות, בינוני שונה Levenstein-Jensen (ללא עמילן) משמש, אשר נשפך לתוך צלוחיות. בכל אחת מהבקבוקות, מתווספת כמות מסוימת של דילול מתאים של ההכנה האנטי-גולמית. התוכן של צלוחיות מעורבבים היטב, שפכו לתוך צינורות וקיפל במצב נוטה במשך 40 דקות בטמפרטורה של 85 ° C. מומלץ לסליל את המדיום במעגל חשמלי עם בקרת טמפרטורה אוטומטית. יום רביעי עם תרופות נגד שחפת

1-st בסדרה ניתן לאחסן במקרר ב 2-4 מעלות צלזיוס במשך חודש 1, עם הכנות של השורה השנייה - לא יותר מ 2 שבועות. אחסון של חומרי הדפסה עם הכנות בטמפרטורת החדר אינו מקובל. בעת הכנת פתרונות של תרופות נגד שחפת, הפעילות שלהם נלקחת בחשבון, חישוב הריכוז מותאם למשקל המולקולרי של החלק הלא ספציפי של הכנה, טוהר וכו '. כדי לקבוע רגישות לסמים, רק חומרים טהורים מבחינה כימית משמשים.

העיקרון של השיטה הוא לקבוע את הריכוז של תרופה אנטי-מעכב אשר מעכב את הצמיחה של חלק משמעותי של האוכלוסייה mycobacterial. אם נעשה בצורה נכונה, שיטה זו יש אמינות טובה.

לפני הבדיקה, יש צורך לוודא כי התרבות המבודדת של שחפת mycobacterium אין microflora חיצוני. מהתרבות של mycobacteria ב 0.9% נתרן כלוריד פתרון, ההשעיה הומוגנית המכיל 500 מיליון גופים מיקרוביאליים לכל מ"ל מוכן (עכירות אופטי תקן של 5 יחידות). התוצאה slurry הוא מדולל עם 0.9% נתרן כלוריד פתרון (1:10) ו 0.2 מ"ל של slurry מתווסף כל צינור של מערכת התקשורת. הצינורות המחוסנים הוצבו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס והחזיקו במצב מאוזן במשך 2-3 ימים לפני השטח המשופע של המדיום היה מחוסן באופן שווה עם השעיה של שחפת Mycobacterium. צינורות מועברים לאחר מכן למצב אנכי מודגרת במשך 3-4 שבועות. התוצאות נרשמות לאחר 3-4 שבועות.

מאז עיתוי הפרשת הפרשת החומר הקליני על חומרי הזנה הוא לפחות 1-1.5 חודשים, את התוצאות של קביעת רגישות התרופה בשיטה זו ניתן להשיג לא לפני 2-2.5 חודשים לאחר זריעת החומר. זהו אחד החסרונות העיקריים של השיטה.

לפרש את התוצאות של קביעת הרגישות התרופה של mycobacteria על בסיס קריטריונים מסוימים. על תקשורת והתרבות המוצקה נחשב רגיש ריכוז התרופה כי היא מכילה את המדיום, אם מספר מושבות של mycobacteria לגדל במבחנה עם התרופה הזאת היא לא יותר מ 20 עם צמיחה בשפע בצינור המלא ללא תרופות. רק בנוכחות יותר מ -20 מושבות הוא נחשב תרבות עמידים ריכוז זה. בפועל, כאשר קבלת תוצאות הצמיחה מבחנות הבדיקה קרוב 20 cfu. יש צורך להודיע על היחידה הקלינית כי רגישות או התנגדות במקרה זה היא גבולית, שכן לפעמים זה יכול להסביר את הדינמיקה מטושטשת של אינדיקטורים קליניים.

עבור תרופות שונות ריכוז מסוים הוא הקים, שבו שכפול של שיעור קריטי של האוכלוסייה mycobacterial הוא ציין. ריכוזים אלה נקראים "קריטיים". כקריטריון של יציבות, הגידול של האוכלוסייה של mycobacteria על מדיום מזין עם הכנה בריכוז קריטי משמש.

ב תרגול שחפת המקומי, בקביעת עמידות התרופה, הם אינם מוגבלים לקביעת ריכוזים קריטיים בלבד. זאת בשל העובדה. כי הרמה בהגדרה המורחבת של עמידות לתרופות מאפשרת למטפל בצורה מדויקת יותר למקם את כימותרפיה טקטיקות באמצעות ידע של potentiating הפעולה של שילובי תרופות, שחוצה התנגדות צפויה או ליישם קבוצת תרופות יעילה יותר בשימוש בתרופות אנטי-TB.

שיטת הריכוז המוחלטת היא הפשוטה ביותר, אבל היא גם הרגישה ביותר לטעויות שנעשו כאשר היא מבוצעת. מהימן יותר, במיוחד בקביעת הרגישות לתרופות קו שני, ו משותף מחוץ לרוסיה היא שיטת הפרופורציות. היא לוקחת בחשבון את החסרונות של שיטת הריכוזים המוחלטת, אבל בביצוע היא יותר מייגעת.

השיטה דומה מאוד לשיטת הריכוז המוחלטת. הכנה של מבחנות עם תרופות מתבצעת באותו אופן. כמו בשיטת הריכוז המוחלט. עם זאת, מנה זרע ההשעיה של שחפת mycobacterium מצטמצם על ידי גורם של 10. אשר מבטלת את התדירות של התנגדות ספונטנית של זנים מסוימים של שחפת mycobacterium לתרופות כגון Etambutol, protionamide, capreomycin. כמו שליטה, 2 או 3 צינורות עם מינון זרע שווה במבחנות הבדיקה, מדולל ברציפות 10 ו -100 פעמים, משמשים. הקריטריון של יציבות הוא שיעור הצמיחה הנצפית חזותית של שחפת mycobacterium. עבור תרופות של הסדרה הראשונה, קריטריון היציבות הוא עודף של צמיחה של 1% מכלל האוכלוסייה הראשונית, עבור תרופות של השורה השנייה - עלייה של 1 או יותר מ -10% הראשונית, בהתאם לריכוז קריטי נבחר.

בשנת 1997, קבוצת עבודה של ארגון בריאות עולמית והאיחוד הבינלאומי לזיהוי עמידות לתרופות TB טוב שחפת עשתה התאמות לקריטריונים אלה, מציע mycobacteria עמיד נחשב, אשר גדל על לוינשטיין-ג'נסן תקשורת ביצה המוצקה בריכוזים הבאים:

• dihydrostreptomycycin - 4 מיקרוגרם / מ"ל;
• isoniazid 0.2 מיקרוגרם / מ"ל:
• rifampicin 40 מיקרוגרם / מ"ל:
• Ethambutol - 2 מיקרוגרם / מ"ל.

בשנת 2001 הוצעו ריכוזים קריטיים עבור תרופות הקו השני (עבור חלק קריטי של 1%):

• capreomycin - 40 mcg / ml;
• פרוטיונמיד - 40 mcg / ml;
• קנמיצין - 30 מיקרוגרם / מ"ל;
• viomycin - 30 mcg / ml;
• cycloserine 40 מיקרוגרם / מ"ל;
• חומצה aminosalicylic - 0.5 מיקרוגרם / מ"ל;
• ofloxacin - 2 מיקרוגרם / מ"ל.

תוצאות הצמיחה מוערכות לאחר 4 שבועות כתהליך ראשוני ואחרי 6 שבועות של טיפוח - כמו האחרון.

כדי לקבוע את הרגישות לתרופה pyrazinamide, אשר נעשה שימוש נרחב בכימותרפיה המודרנית לשחפת, הריכוז הקריטי המומלץ הוא 200 מיקרוגרם / מ"ל. עם זאת, עד כה אין שיטה מקובלת לקביעת עמידות התרופה לתרופה זו על מדיה מזין מוצק, שכן הפעילות האנטיבקטריאלית שלה מתבטאת רק בינוני בינוני (pH <6), אשר מבחינה טכנית קשה לקיים. בנוסף, תרבויות קליניות רבות של שחפת mycobacteria גדל באי רצון על סביבות ביצה עם סביבה חומצית.

כדי להעריך את איכות התוצאות של קביעת רגישות התרופה של mycobacteria, מומלץ כי כל אצווה חדשה של המדיום Levenstein-Jensen להיות פיקוח על ידי קביעת מקבילה של הרגישות של זן המוזיאון סטנדרטי H37Rv. בנוסף, ישנם קריטריונים מיקרוביולוגיים מסוימים שיש לשמור על כך טכניקות לתת תוצאה לשחזור היטב מתפרשת כראוי. אלה כוללים את הכדאיות של התרבות של שחפת mycobacterium, הכללים להשגת השעיה הומוגנית ההשעיה, הכללים לבחירת תרבויות של שחפת mycobacterium, ייצוגיות של מסה חיידקים נבחרים. האמינות של קביעת עמידות התרופה יורדת עם שחרור חיידקי נדירים ביותר.

לאחרונה, שיטה לקביעת רגישות התרופה באמצעות מערכות אוטומטיות נחשבה מבטיחה. המושלם ביותר בתחום זה הם התפתחויות המבוססות על VASTES MGIT-960. במקרה זה, הרגישות התרופה של שחפת mycobacterium נקבעת על בסיס שיטה שונה של פרופורציות. בתהליך של קביעת, שיעור הצמיחה של שחפת mycobacterium בצינור בקרה וב מבחנות המבחן עם תרופות מושווה. כדי לקבוע את הרגישות streptomycin, isoniazid, rifamp-picin ו ethambutol, תוספי העשרה ואנטיביוטיקה הכלולים ערכת SIRE משמשים. כדי לקבוע את הרגישות ל- pyrazinamide, השתמש בערכת ה- PZA. במהלך מבחנות מחוסנות שחפת Mycobacterium מבחן השעיה עם סמים, כמו גם צינורות המלאים עם השעיה מחדש 100 פעמים עבור כל התרופות למעט pyrazinamide, שבו ההשעיה היא דילול של 10 פעמים. הקריטריון של יציבות הוא מדד הצמיחה של mycobacteria של 100 GU כאשר הצמיחה מושגת צינור הבקרה 400 GU (ראה "שיטות תרבות לבידוד mycobacteria"). חשבונאות ופרשנות של התוצאות מתבצעות באופן אוטומטי נקבעים על ידי קלט או תוכנית נבחרת.

כמו ריכוזים קריטיים, ריכוזים הסופי משמשים במבחנה עם המדיום נוזל מזין. נכון לעכשיו, ריכוזים קריטיים פותחו עבור שתי שורות קו ראשון והשורה השנייה. יש לציין כי הרגישות של שחפת mycobacteria כדי cycloserine וחומצה aminosalicylic נקבעת רק על התקשורת ביצה.

פרוטוקול מפורט של העבודה על המערכת המתוארת מאפשר ללמוד רגישות לסמים הן על תרבות מבודדת (עם בינוני מזין צפוף) ושימוש בצמיחה העיקרית של mycobacterium בצינור MGIT. האפשרות האחרונה מפחיתה באופן משמעותי את הזמן לתרבות, המאפשרת לך לקבל את התוצאות המלאות של התרבות של שחפת Mycobacterium (כולל מידע על רגישות לתרופה) לאחר 3 שבועות מיום האוסף של החומר, ואילו בשיטה המסורתית אפשר להשיג החודש 3 בלבד. עם הזמן, התוצאות המתקבלות, כאשר החולה נמצא בשלב אינטנסיבי של טיפול, יכולות לפצות על העלות הגבוהה יחסית של המחקר.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

בידול של mycobacteria

אם ניקח בחשבון כי התקשורת מזין משומשים אינם סלקטיביים לחלוטין. ההבחנה הבאה של mycobacteria מבודד מוכר כחובה. צורך הבידול של mycobacteria בשל מספר התכונות של תהליכים פתולוגיים שמקורם הסוג: כמובן שונה תוצאה של שחפת שה- Mycabacteriosis, בנוכחות עמידה לתרופות טבעיות לתרופות מסוימות נגד שחפת.

הוא הכיר בכך זיהוי ראשוני של קומפלקס שחפת Mycobacterium M. Nontubercular מן mycobacteria מבוצע על ידי המאפיינים הבאים: שיעור הצמיחה על תקשורת מזינה מוצקה, פיגמנטציה, מורפולוגיה מושבה, בנוכחות התנגדות חומצה וצמיחה אופטימלית בטמפרטורה.

למרבה הצער, לא קיים שיטת מעבדה יחידה להבדיל באופן אמין M. שחפת mycobacteria המורכבת מ חיידקי חומצה מהירים אחרים, בכל זאת השילוב של תכונות שתוארו לעיל עם התוצאות המפורטות להלן של מספר בדיקות ביוכימיות מאפשר זיהוי של מורכבות שחפת Mycobacterium עם M. סביר 95%.

עבור בידול של M. שחפת מורכבים Mycobacterium (שחפת, M. בוביס, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii ואחרים) מן mycobacteria ההולכת וגואה בשימוש בדיקות הביוכימיות nontubercular המזהים נוכחות מהתופעות הבאות:

• היכולת לייצר חומצה ניקוטינית (בדיקת ניאצין):
• פעילות ניטראט רדוקטאז;
• תרמוסטט תרמוסטאבל;
• צמיחה על בינוני עם נתרן salicylate (1 מ"ג / מ"ל).

כמו בדיקות נוספות, צמיחה על מדיום המכיל 500 מיקרוגרם / מ"ל של חומצה paranitrobenzoic או 5% נתרן כלורי יכול לשמש גם.

מעבדות בקטריולוגיות רבות לזהות אלה מיקרואורגניזמים רק ברמה של המתחם, אשר בשל היכולות המוגבלות של מעבדות ויכולות מתודולוגיות של מומחים.

ברוב המקרים, אולם, בפועל להבחנה שחפת ו בוביס M. מספיקה את הבדיקות הבאות: ניאצין, עבור נוכחות של ניטראט, רישום נוכחות וצמיחה pirazinamidazy במדיום המכיל 2 UG / ml hydrazide של חומצה thiophene-2-קרבוקסילית. זה נלקח בחשבון כי mycobacteria של מ 'שחפת מורכבים מאופיינים על ידי קבוצה הבאה של תווים:

• צמיחה איטית (יותר מ -3 שבועות);
• טמפרטורת הצמיחה בטווח של 35-37 ^o C;
• העדר פיגמנטציה (שנהב);
• צבע מהיר חומצה מסומנת;
• מבחן ניאצין חיובי;
• בדיקה חיובית של ניטראט רדוקטאז;
• היעדר catalase thermostable (68 ^מעלות צלזיוס).
• העדר צמיחה על מדיום לבנשטיין-ג'נסן המכיל:
  • 1000 מיקרוגרם / מ"ל salyclate נתרן,
  • 500 מיקרוגרם / מ"ל של חומצה paranitrobenzoic,
  • 5% נתרן כלורי:
• צמיחה בנוכחות של 1-5 מיקרוגרם / מ"ל thiophene-2-carboxylic חומצה.

הרלוונטיות של בידול mycobacteria מבודדת יגדל במידה ניכרת עם הגידול בתדירות של הקלטה מקרים HIV / איידס הקשורים שחפת או mycobacteriosis. כיום, אין ודאות מוחלטת על נכונותם של מעבדות אזוריות מעשיות לבצע כראוי את נפח העבודה הזה.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

אבחון אימונולוגי של שחפת

ישנן מספר תופעות אוניברסליות, תרופות ומחקרים אימונולוגיים שנמצאו במקור עם שחפת או על המודל של התגובה החיסונית mycobacteria. אלה כוללים BCG טוברקולין, כגון תופעה כמו עורית DTH (tuberculin - Pirquet ו Mantoux תגובה), תגובה לבעלי חיים רגיש tuberculin תת עורית (תופעת קוך). אחד הנוגדנים הראשונים במחלות זיהומיות התגלה גם בשחפת. כמובן, עמוק יותר את ההבנה של מנגנוני חיסון שחפת טוב הבקרה הגנטית שלהם, כך גדל עשוי להיות השימוש בשיטות אימונולוגיות תרופות המשפיעות על מערכת החיסון, על מנת לפתור בעיות מעשיות של TB.

הבעיה המעשית החשובה ביותר כיום נחשבת לאיתור שחפת בתהליך ההקרנה ההמונית של האוכלוסייה. עם זאת, למרות דיווחים רבים של "הצלחות" (על חומר מוגבל), אין שיטה חיסונית מתאימה (לשחזור "כל נשק") וסמים המתאימים למטרה זו.

שיטות אימונולוגיות, במיוחד מחקרים סרולוגיים (קביעת אנטיגנים, נוגדנים) ומבחני שחפת, נמצאים בשימוש נרחב מאוד בקליניקה.

מלכתחילה בין המחקרים החיסוניים המשמשים לאבחון דיפרנציאלי, ישנן שיטות סרולוגיות - קביעת אנטיגנים ונוגדנים בסביבות שונות של הגוף.

הספציפיות של נוגדנים לשחפת mycobacteria תלוי האנטיגנים המשמשים immunosay. כמות משמעותית של אנטיגנים מוצע, הראשון שבהם הוא שחפת PPD:

• PAP ותכשירים מורכבים אחרים מנוזל התרבות;
• התפוררות קולית;
• תמצית טריטון ותכשירים מורכבים אחרים של קירות התא;
• 5-אנטיגן (דניאל);
• 60-אנטיגן (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• גורם-חוט (Trehalose-6,6-di-mycollate);
• פנולים וגליקוליפידים אחרים;
• lipopolysaccharides;
• אנטיגן מחייב פיברונקטין;
• חלבונים (לרוב רקומביננטי); 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDA וכו '

כתוצאה שנות מחקר על ידי מדענים רוסים וזרים חשפו את חוקי היסוד ואת האפקטיביות של אבחנה סרולוגית נוגדן שחפת: האנטיגן מורכבים יותר, רגישות גבוהה וספציפיות התחתון של המבחן. סגוליות במדינות שונות משתנה בהתאם לאוכלוסיית זיהום שחפת ו mycobacteria nontubercular מלבצע חיסון BCG ואחרים. אצל ילדים, תוכן המידע של serodiagnosis הוא נמוך יותר מאשר אצל מבוגרים. בשחפת הראשית (לעתים קרובות יותר ילדים), ההגדרה של IgM אינפורמטיבית יותר. עם משני IgG. בחולים נגועים ב- HIV, הערך האינפורמטיבי של serodiagnosis בקביעת נוגדנים מצטמצם. נחישות של נוגדנים יעילים תלוי במספר של "היבטים קליניים": פעילות תהליך (קיומו או אי קיומו של "בידוד" ריקבון נוכחות mycobacteria של חללים, מידת החדירה), השכיחות של התהליך, משך הזרימה שלו.

הרגישות של שיטת אנזים אימונואי (ELISA) הוא כ 70%. יעילות מספקת של המחקר נובעת מהספציפיות הנמוכה. בעבר, נלקח בחשבון האפשרות להשתמש בהקרנה סרולוגית בקבוצות בסיכון גבוה, במיוחד בקרב אנשים עם שינויים בשחפת שלאחר הריאה.

כדי לשפר את הספציפיות ELISA להמשיך בחיפוש אחר אנטיגנים ספציפיים יותר, כולל אלה המיוצרים על ידי הנדסה גנטית: (. ראה לעיל) ESAT-6, ואחרים .. שימוש ספציפי אנטיגנים ספציפיים (38 kDa, ESAT) מגדילה את הספציפיות. אך מפחית באופן משמעותי את הרגישות של הניתוח. יחד עם IFA (מערכות בדיקת מעבדה ניסיונית. ערכת דוגמה: Pathozyme ELISA) מספקת גם ערכות עם סינון immunochromatographic לרוחב (Mycodot), כמו גם בדיקות דומות אחרות (dot-אנליזה על הממברנה) עם הערכה חזותית של תוצאות הבדיקה. בבדיקות אלה, הניתוח מתבצע במשך 10-30 דקות; הם אינם דורשים ציוד מיוחד, הם דורשים הערכה חזותית של התוצאות, אשר מזוהה עם סובייקטיביות מסוימת. לשיטות אלה יש את אותה הרגישות ואת מאפייני הייחודיות (70% ו 90-93%, בהתאמה) כמו ELISA המסורתית.

לשימוש בשיטות של ניתוח החיסון יש ערך מובהק כמרכיב נוסף, שנלקח בחשבון במכלול השיטות בהן נעשה שימוש, באבחנה הדיפרנציאלית של שחפת, במיוחד באבחון צורותיו האקסטרפולמונריות. השיטה היעילה ביותר ELISA היא באבחון של דלקת קרום המוח של חקר במחקר של נוזל מוחי. במקרה זה, הרגישות של הניתוח היא 80-85%, ואת הספציפיות היא 97-98%. ישנם נתונים על היעילות של איתור נוגדנים לשחפת mycobacteria בנוזל מדמיע באבחון של uveitis שחפת.

אינדוקציה של סינתזת גראמה אינטרפרון במבחנה

אינטרפרון Gamma (IFN-γ) הוא גורם הגנה החיסונית ספציפי המבוצע על ידי הפעלת מערכות אנזים מאקרופאג. אינדוקציה של סינתזה IFN-γ על ידי לימפוציטים מסוג T רגיש גורם אינטראקציה שלהם עם אנטיגנים של mycobacteria.

כמו אנטיגנים המשמשים שחפת PPD. ואת אנטיגנים ספציפיים, מתקבל על ידי הנדסה גנטית, ב אנטיגנים מסוימים ESAT-6 (בראשית מופרש אנטיגן בעל משקל מולקולרי 6 KDA) ו CFP-10 (חלבון תסנין תרבות 10 KDA). הנדסה גנטית או אנטיגנים רקומביננטי נעדרים בתאי חיסון BCG ו mycobacteria אחרים. כאשר משתמשים בשחפת, התוצאות של בדיקת אינדוקציה IFN-γ ניתנות להשוואה לתוצאות של בדיקת עור השחפת (מתאם ישיר). כאשר משתמשים באנטיגנים מהונדסים גנטית, תוצאות הבדיקה הן ספציפיות יותר ואינן תלויות בחיסון הקודם של BCG. כאשר בודקים אנשים מחוסנים שלא היה להם קשר עם זיהום שחפת, הספציפיות של הבדיקה היא 99%. הרגישות של הבדיקה בקרב חולים עם שחפת נע בין 81 ל 89%.

בדיקות וכלי אבחון פותחו בהתבסס על טיפוח לטווח קצר של תאים או תאים mononuclear הדם כולו מבודדים מהדם עם אנטיגנים של Mycobacterium שחפת במבחנה בנחישות הבאות של ריכוז IFN-γ או על ידי ספירת מספר לימפוציטים מסוג T אשר לסנתז IFN-γ. ריכוז אינטרפרון מסונתז במבחנה נקבע על ידי ELISA באמצעות נוגדנים חד שבטיים מחייב IFN-γ. לאחר מכן, על ידי כיול תקן IFN-γ, הריכוז שלו נקבע במבחנה או בארות של הצלחת.

בעת ביצוע הבדיקה אליספוט, מספר לימוזיטים T- מסונתז IFN-γ. נספרים על משטח של צלחת מצופה נוגדנים ל- IFN-γ.

מפתחים של diagnosticum על בסיס אינדוקציה של IFN-γ במבחנה, אשר אושרה על ידי הסוכנות האמריקאית לתרופות ומוצרים, טוענים כי לא ניתן להבדיל בין זיהום שחפת סמויה מ שחפת פעילה בעזרת הבדיקה. לכן, באזורים עם רמה גבוהה של זיהום, הבדיקה אינה אבחון ישיר. עם זאת, במדינה שלנו זה יכול לשמש כדי להבדיל זיהום שחפת אצל ילדים מן החיסון שלאחר האלרגיה, ועל מנת להעריך את רמת החסינות הספציפית בתהליך הטיפול.

כיום, מערכת הבדיקה המקומי לקביעת אינדוקציה של סינתזה IFN-γ על ידי אנטיגנים ספציפיים שחפת במבחנה נלמדת.

מצב החיסון ומסלול שחפת, חיסונים

בתהליך הטיפול בשחפת אצל בני אדם, קיימים שינויים באנטיגנמיה ומצב המערכת החיסונית.

נתונים על שינויים אקסודטים ורקמות סותרים במידה רבה. הדבר היחיד שניתן לציין עם סיבה טובה היא כי granulomas שחפת, ככלל, מספר משמעותי של T- לימפוציטים מופעלים מזוהים.

זה הגיוני להתעכב על שתי הוראות נוספות כי יש צורך להבין את התפקיד של מנגנונים החיסונית בטיפול שחפת בבני אדם:

• לחולי איידס יש שכיחות גבוהה במיוחד של עמידות תרופה מרובה;
• עם התנגדות מרובה של תרופות (ובהיעדר זיהום ב- HIV), הפרעות חסינות (במיוחד הקשר בין תאי ה- T) הן משמעותיות במיוחד.

כאשר שחפת נרחב ליישם שיטות שונות של תפקוד מערכת החיסון: זה בעיקר בתרופות הפועלות בעיקר על חסינות T-cell ומערכת של פגוציטים mononuclear (הורמונים הַרתִי, isophorone, likopid, polioksidony et al.). כמו גם מיקובקטריה שלמה (מוחלשת) ומרכיביהם.

אבחנה מולקולרית ביולוגית של שחפת

עבור שיטות הביולוגיה המולקולרית באבחון מחלות זיהומיות כוללות, בעיקר, שיטות המבוססות על מניפולציה עם חומר גנטי של פתוגנים חיידקים ווירוסים לזהות חומר גנטי ספציפי - קטעי DNA בעל רצף נוקליאוטידים ספציפיים עבור זנים סוג או פתוגן מסוים לנתח ספציפיים רצפי DNA בגנים הקובעים את הרגישות של הפתוגן לחומרים מרפא מסוימים, וכן לניתוח תפקודי פעילות של גנים מסוימים של הפתוגן. בשיטות ביולוגיות מולקולריות היו נרחבות במחקר מדעי ויישום מעשי באבחון וניטור של זיהומי חיידקי וירוסים שונים לאחר פתיחת 1985, קארי Myullisom (חתן פרס נובל. 1989) תגובת השרשרת של פולימראז.

עקרונות ואפשרויות של שיטת תגובת שרשרת פולימראז

PCR מאפשר להגביר (להכפיל) במבחנה רצף נוקליאוטידים (קטע DNA של הפתוגן) במשך מספר שעות מיליוני פעמים. התגובה בנוכחות של רשתות ה- DNA יחיד קובע את הרגישות הגבוהה ביותר של assay.

רצף נוקליאוטידים של אזורים מסוימים בשרשרת ה- DNA קובע את הזהות הגנטית של מיקרואורגניזם, מה שמסביר את הספציפיות הגבוהה של PCR.

הערך של הטכניקה הזו לצורך זיהוי והחקירה של המאפיינים נגרמים על ידי מאפיינים ביולוגיים שחפת Mycobacterium של מיקרואורגניזם בעל צמיחה איטית מאוד: הכפלת זמן של DNA שחפת Mycobacterium כאשר culturing הוא 12-24 שעות.

העיקרון של שיטת ה- PCR מורכב הגברה - מרובים, מיליוני פעמים. הכפלת החלקים של רצף DNA ספציפי בצינור microvolume במהלך מחזורי הישנות של שלושת שלבי התגובה הבאים, שכל אחד מהם עובר במשטר טמפרטורה שונה:

• שלב I - denaturation של DNA כפול תקועים על חימום עם סטייה של הרשתות שלה;
• שלב II - משלים משלים (הכלאה) של primers (priming oligonucleotides) עם חלקים סופיים של שרשראות ספציפיות, שנבחרו עבור כפל של קטע ה- DNA;
• שלב III - השלמת שרשרת ה- DNA שרשרת בעזרת פולימרז DNA thermostable.

עבור הגברה במבחנה, חייבת להיות מולקולה של DNA מטריצה. ארבעה סוגים של triphosphates deoxynucleoside (נוקליאוטידים) המכילים בסיסים חנקניים מתאימים: אדנין (A), תימין (T), גואנין (G), ציטוזין (C); סינתזה מלאכותית פרימינג oligonucleotides (primers) בהיקף של זוגות 18-20 בסיס; האנזים דנ"א פולימראז thermostable שיש אופטימלית בטמפרטורה של 68-72 ^על C, ויונים מגנזיום.

הספציפיות של PCR תלוי בבחירת קטע ה- DNA. בהתאם לכך, oligonucleotides זרע אגן מסונתזים. הייחודיות של הכלאה והשלמה של שרשרת ה- DNA נובעת מעיקרון השלמה של זוגות בסיסים ניטרוגניים: adenine-thymine, guanine-cytosine.

כדי לקבוע את מורכבות mycobacteria שחוף גנומי הגברת יעד היעילה ביותר ברוב מערכות בדיקה שנבחרו קטע DNA של IS6110, אשר ברוב הזנים של הגנום שחפת Mycobacterium יש מספר לא מבוטל (10-20) של חזרות, אשר מספק, יחד עם ייחוד, רגישות גבוהה של assay. במקביל, זני שחפת Mycobacterium תארו עם מספר קטן של חזרות או לא שבר IS6110.

בידוד של מולקולות דנ"א מדגימה ביולוגית

עבור ביצוע PCR, מולקולות ה- DNA של הפתוגן צריך להיות מבודד מן החומר הביולוגי בנפח מינימלי, עם כמות מינימלית של DNA ספציפיים ומעכבים שונים של פולימראז DNA האנזים.

הכנת דגימות צריך להתבצע בתנאים המונעים זיהום צולב של דגימות על ידי מולקולות DNA בודדים. כדי לעשות זאת, טיפול מראש של החדר עם אולטרה סגול, רצפות ומשטחי עבודה של שולחנות ומכשירים הוא הכרחי עם פתרונות המכילים כלור. גם שימוש חובה של כפפות נקיות, צינורות בדיקה חד פעמיות וטיפים כדי טפטפות אוטומטיות.

כדי לבודד את ה- DNA של שחפת Mycobacterium מ דגימות קליניות (הנוזל השדרתי, לשטוף הסימפונות) לא המכיל מספר רב של תאים, פסולת הסלולר, או מלחים מזה, מספיק כדי צנטריפוגות מדגם ב 3-4 אלף. סל"ד, מוסיפים% בוצה 20-30 ul של 2 פתרון טריטון X-100 וחממו ב 90 ^בערך צלזיוס למשך 30 דקות.

להכנת דגימות כיח חייב להיות עיבוי יעיל, אשר משמש בדרך כלל עבור פתרון 4% של נתרן הידרוקסידי ו- N-Acetyl-L-ציסטאין (NALC) בסכום של 50-80 מ"ג לדגימה - תלוי צמיגות מדגם. הפתרון NALC חייב להיות מוכן לשעבר טמפור או אבקת NALC ניתן להוסיף יבש המדגם ישירות. לאחר נזילה, דגימות צריך להיות centrifuged במשך 15 דקות ב 3.5-4000 סל"ד (3000 גרם) ב 50 בקבוקונים מ"ל עם כובעים בורג, א ' תחת אותם תנאים המומלצים להכנת presowing של ליחה.

להפקת DNA משייטת הגלולה משמש לרוב מבוסס על שימוש פתרון 5-6 טוחן של ריאגנט ימס isothiocyanate guanidine כמו חלקיקי microporous ו תחמוצת צורן ( "ארץ diatomaceous") sorbing מולקולת ה- DNA. חומרים ספציפיים, כוללים מעכבים אפשריים, אז ירחצו בתמיסת 2.5 טוחנת של isothiocyanate guanidinium פתרון אתנול, שלאחריו מולקולת הדנ"א desorbed במים, ודוגמאות אלה שמשו לביצוע PCR. כדי לפשט את הטכנולוגיה של מיצוי דנ"א, "כדור הארץ diatomaceous" מוחלף לעתים קרובות על ידי microparticles מגנטיים מצופה תחמוצת סיליקון. במקרה זה, עמדה מגנטית מיוחדת עבור microtubes משמש במקום צנטריפוגה כדי להאיץ את החלקיקים.

ברוסיה פותחה שיטה מקורית להפרדה אימונו-מגנטית של המיקובקטריה, ואחריה מיצוי הדנ"א של הפתוגן. עבור ההפרדה immunomagnetic שחפת Mycobacterium באמצעות גודל ferroparticles של 3-5 מיקרון, מצופה סיליקה, שאליו מחוברים על ידי polyclonal קשר כימי (ארנב) נוגדנים כדי שחפת Mycobacterium. דוגמאות של כיח לאחר תמוגה אלקליין הם מנטרלים עם תמיסת חומצה tris- HCl מודגרת עם sorbent immunomagnetic. לאחר מכן, immunoperparticles נאספים עם מוט מגנטי עם קצה להחלפה, הועבר microtube, וזרז. הוסף 20-30 μl של פתרון 2% Triton X-100 וחם במשך 30 דקות ב 90 ^° C. Supernatant משמש כתבנית DNA לניתוח PCR.

בעיה קשה היא בידוד של mycobacterium שחפת DNA דגימות ביופסיה. עבור אנזימים ביופסיה, האנזים proteinase K משמש ריכוז סופי של 200-500 מ"ג / ליטר בטמפרטורה של 56 ^מעלות צלזיוס למשך הלילה. יתר על כן, אחת השיטות הידועות משמש. עודף DNA ספציפי בניתוח PCR של ביופסיות לעיתים קרובות גורם לעיכוב של התגובה, אשר דורש הפקת חוזרת של DNA.

שיטות לאיתור תוצאות

לאחר השלמת התגובה, שברי DNA מוגבר של הפתוגן מזוהים בשיטות שונות.

שיטת ג'ל אלקטרופורזה ידועה היטב. קטע ה- DNA שנוצר מזוהה על ידי שליטה חיובית המכילה את קטע הדנ"א הספציפי הרצוי, או לפי גודל ידוע (מספר זוגות נוקליאוטידים) של השבר, אשר נקבע באמצעות סמן מולקולרי סטנדרטי.

בנוכחות של צבע מסוים, ethidium bromide נכלל DNA כפול תקועים. קטע הדנ"א מסונתז מזוהה כמו להקה מאירה תחת הפעולה של אולטרה סגול.

גודלו של קטע ה- DNA, שנקבע על ידי אלקטרופורזה מן המרחק מן ההתחלה, חייב להתאים סמן משקל מולקולרי ידוע או שליטה חיובית.

שיטות אחרות של קביעת תוצאות PCR מבוסס על הכלאה של מוצרי PCR-שרשרת אחת עם oligonucleotide לכך משלימים - בדיקת DNA שכותרתו עם ביוטין, ואחריו זיהוי באמצעות תגובות אנזימטיות, למשל באמצעות קשירת phosphatase אלקליין-ביוטין streptavidin.

בהתבסס על סוג זה של זיהוי, מנתחי PCR נוצרו שבו איתור של תוצאות PCR מתבצעת באופן אוטומטי כתוצאה מקריאת צפיפות אופטית בדגימות לאחר הביטוי של התגובה האנזימטית.

החסרונות של השיטות הללו הם האפשרויות של זיהום תוך-משתני על ידי שברי קצר יחסית של מולקולות דנ"א. כאשר מולקולות להיכנס דגימות חדשות, הם הופכים מטריצה עבור PCR ולהוביל לתוצאות חיוביות כוזבות.

בהקשר זה, כדי למנוע תוצאות כוזבות חיוביות, כללים קפדניים ההפרדה ובידוד של הנחות הם הציג: לחלץ דנ"א מדגימות ביולוגיות; הנחות עבור איתור של תוצאות (אלקטרופורזה) מהאזור נקי. הנחות אלה הם אזור של זיהום סביר. אזור מבודד נוסף הוא חדר נקי עבור הצגת דגימות DNA כדי להיבדק בצינורות עם תערובת תגובה עבור PCR. לבסוף, יש להניח כי המכשיר הראשי - מגבר ה- DNA - צריך להיות ממוקם בחדר נפרד, אולי במשרד.

כדי למנוע זיהום של תוצרי התגובות הקודמות - חלק במבחן מערכת Likon אמפר PCR במקום dezoksinukleozidtimidina מכיל dezoksinukleoziduridin אשר, כאשר מעגל סינתזה במבחנה משולב במקום בעמדה הנכונה, דהיינו, הבסיס החנקני של נוכחות thymine ב DNA יליד מוחלף על ידי uracil. Uracil- DNA glycosylase, הוסיף לתערובת התגובה לחומר תחת ניתוח, הורס רק את השברים מזהמים עם deoxyuridine, אבל לא DNA יליד להיות מנותח. Lt; / RTI & gt; חימום לאחר מכן ב 94 ^° C מנטרל אנזים זה אינו מפריע הגברה ב- PCR.

יש מערכת בדיקה המבוססת על הגברה isothermal של rRNA, אשר שעתוק לאחור סינתזה של מולקולות דנ"א מתבצעים הראשון. אשר, בתורו, היא מטריצה לסינתזה הבאה של מולקולות RNA. RPNA amplicons מזוהים באמצעות בדיקה דנ"א מוכתם אקרידין כאשר הכלאה בפתרון צינור התגובה. שיטה זו, בנוסף רגישות גבוהה, יש את היתרון של ניתוח בצינור אחד, אשר מונע זיהום. לדברי המחברים, הרגישות של שיטה זו בדגימות הנשימה מגיע 90% עם ספציפיות של 99-100%.

שיטות גילוי חדשות מיושמות בזמן אמת PCR. שיטות אלה נבדלות בעיקר כי PCR וזיהוי התוצאות שלה מתבצעים בו זמנית בצינור סגור אחד. זה לא רק מבחינה טכנולוגית מפשט את הטכניקה של ניתוח, אלא גם מונע זיהום של חדרי מעבדה דגימות הבדיקה עם מוצרים של PCR הקודם.

בתוצאות איתור PCR בזמן אמת בשל הקרינה המתרחשים במהלך DNA בדיקת כלת fluorogenic עם amplifitsi רוי-PCR במהלך קטע DNA ספציפי. מבנה בדיקות דנ"א fluorogenic בנוי כך בסמן פלורסנטי משתחרר כתוצאת תגובה אנזימטית או להרחיק את קרינת המולקולה מרווה רק תחת הכלאה ספציפית עם מולקולת ה- DNA הרצוי להיות מוגבר במהלך PCR. ככל שמספר מולקולות בדיקת הכלאה עם עליית הקרינה הוא פרופורציונאלי לרמה המזוהית של מספר מולקולות של המוצר המוגבר. מאז בכל מספר מחזור של מולקולת ה- DNA שבר PCR מוכפל וחצי, מספר המחזור שבו הקרינה נקבעת ומגביר ביחס הפוך למספר מולקולות DNA במדגם הראשוני. אם התגובה היא להציג את כיל בכמה ריכוזים שונים ומוכרים של מולקולות מקבילות קטע DNA של שחפת Mycobacterium, באמצעות תוכנת מחשב ניתן לחשב את כמות הדנ"א הגנומי בחומר הבדיקה.

כל מדגם סטנדרטי משוכפל. הקריטריון הכמותי הוא המספר המינימלי של מחזורי PCR הדרושים להתפתחות וצמיחה של הקרינה נקבע. על abscissa - מספר המחזורים; לתאם הוא ערך הקרינה. ריכוזי ה- DNA הם ביחס הפוך למספר מחזורי הנדרש עבור הופעת הקרינה. בעמודה הימנית (21-32), מספרי מחזור עבור הריכוזים המתאימים מסומנים. הבדלים בין 10 ריכוזי ריכוז של שברי דנ"א 10 ² -10 ⁶ מ"ל - 3.2-3.4 מחזורים. עבור שני חולים, הריכוזים של שברי IS6110 היו בערך 10 ³ / מ"ל ו 10 ⁴ / מ"ל. אם ניקח בחשבון את מספר החזרות (6-20) של שברי ניתוחים בגנום של שחפת Mycobacterium, מספר חיידקים myco בדגימות קליניות הוא כ 100 ו 1000 תאים, בהתאמה.

השימוש PCR באבחון של שחפת

השיטה PCR משמש ביותר לאבחון מואץ של שחפת - זיהוי של שחפת mycobacterium בדגימות קליניות: כיח. שטיפת הסימפונות, exudate pleural, שתן, נוזל מוחי, osteolysis לדקלם, דרכי הנשי דרכי הנשי דגימות ביופסיה שונים. כאשר לומדים כ -500 דגימות של כיח ובסימפונות של 340 חולים עם אבחנה מאובחנת של שחפת ריאתית בהולנד, נחקרה הרגישות היחסית של PCR, תרבות ומיקרוסקופיה. הרגישות של הניתוח הייתה 92.6.88.9 ו - 52.4%, בהתאמה. הספציפיות של כל השיטות היתה כ -99%.

האפקטיביות של זיהוי של שחפת mycobacterium על ידי מיקרוסקופ מריחה, זריעה על המדיום Levenstein-Jensen, מערכת הבדיקה VASTES וניתוח PCR הושווה. PCR הראה רגישות של 74.4%, מיקרוסקופיה - 33.8%, זריעה על מדיום צפוף - 48.9% ו- VASTES - 55.8%. זמן האיתור הממוצע לזריעה במדיום של לווינשטיין-ג'נסן הוא 24 ימים. VASTES - 13 ימים, PCR - 1 יום.

האפשרויות של שימוש PCR כשיטה רגישה ומהירה לניטור האפקטיביות של טיפול בשחלת הם דנו גם.

איתור של DNA שחפת Mycobacterium ידי PCR עם כימותרפיה יעילה נקבע לאורך זמן ארוך יותר - בממוצע 1.7 חודשים לעומת למרוח מוגדר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ועל ידי 2.5 חודשים לעומת בדיקה בקטריולוגית.

אבחון של צורות של שחפת אקסטרפולמונארית

המשמעות של PCR כשיטה רגישה היא גדולה במיוחד עבור צורות extrapulmonary, שכן זה עם צורות אלה כי קליני רדיולוגי שיטות ושיטות בקטריולוגיות מסורתיות לקביעת mycobacteria של שחפת בחומרים אבחון אינם יעילים.

במחקר של דגימות שתן, התוצאות של ניתוח PCR היו חיוביות ב -16 מתוך 17 חולים עם שחפת פעילה של מערכת השתן ושלילי ב -4 חולים עם שחפת לא-פעילה ו -39 חולים עם מחלות לא-שחפת של מערכת השתן.

היעילות של ניתוח PCR במחקר של aspirates מוח העצם בחולים עם חום ממוצא לא ידוע הוכח במקרים של חשד שחפת. כדי לאבחן לימפדניטיס שחפת, 102 נפיחות לנקב ודגימת ביופסיה של 67 ילדים עם חשד לימפדניטיס חשודה נלמדו בילדים. תוצאות חיוביות הושגו: 71.6% בזמן אמת PCR. מיקרוסקופ פלואורסצנטי - 46.3%. מחקר תרבות - 41,8%. במחקר של 50 ביופסיות של בלוטות הלימפה בחולים עם מחלת "חתך שריטה", כל התוצאות היו שליליות. לפיכך, 100% הספציפיות של ניתוח PCR הודגם. באותה עבודה, עם ביופסיה לנקב של בלוטות לימפה, האפשרות של זיהוי של אביום M. הוכח.

אבחון שחפת של איברי המין באזור איברי המין הנשי, כידוע, הוא אחת הבעיות הקשות ביותר של האבחון. במחקר PCR של ביופסיות רירית הרחם, aspirates רירית הרחם ודגימות נוזל מהחלל בדוגלס, 14 (56%) מתוך 25 חולים שנבדקו לפרוסקופי עם חשד לשחפת קיבלו תוצאות חיוביות. באמצעות מיקרוסקופיה מריחה ותרבות, 1 ו -2 תוצאות התקבלו, בהתאמה. מקרים אלה היו גם PCR חיובי. רוב תוצאות ה- PCR היו קשורות במקרים עם סימנים אופייניים של שחפת על פי המחקר ההיסטולוגית; מספר קטן יותר - בחשד לשחפת על פי נתוני לפרוסקופיה. רק תוצאה חיובית אחת של ניתוח PCR התקבל בהעדר נתונים לפרוסקופי עבור שחפת.

כאשר מאבחנים צורות של שחפת, יש לעיתים קרובות שאלה לגבי האפשרות לגילוי הפתוגן בעת בדיקת דגימות דם בשיטת ה- PCR. נתונים ספרותיים מצביעים על כך שגילוי דנ"א משחפת המיקובקטריום מדגימות דם אפשרי עם צורות מרחיקות לכת של הידבקות ב- HIV. דנ"א של שחפת mycobacterium זוהה רק עם שחפת כללית של איברים שונים בחולים עם כליה מושתלת ו דיכוי החיסון.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

זיהוי מינים של מיקובקטריה

שיטת PCR יכולה להיות יעילה למדי עבור זיהוי מהיר של mycobacteria של מורכבות שחפתים וכמה מינים של mycobacteria nontubercular לאחר קבלת הצמיחה הראשונית שלהם. במקרה זה, השימוש PCR יכול לחסוך 7-10 ימים, הכרחי עבור ההזדהות התרבותית הבאה של תוצאה חיובית. הבדיקה PCR היא פשוטה מאוד מבחינה טכנית, שכן היא אינה דורשת הכנה מדגם מורכב של החומר הקליני כדי להשיג רגישות גבוהה. במחקר של 80 תרבויות חיוביות במערכת זו הבדיקה (MB VaT של Organon) תרבויות, כל התוצאות החיוביות של ניתוח PCR היו ספציפיים בהחלט בוצעו במשך יום אחד. כדי לזהות מינים אחרים של mycobacteria בהכנת DNA של תרבות הפתוגן הכלאה עם בדיקות DNA ספציפיים שכותרתו עם acridine זנים זוהה על ידי הופעת chemiluminescence באמצעות רצועות chemiluminometer או nitrocellulose עם הערכה חזותית לאחר הכלאה. בעזרת סט כזה, מספר מוגבל של מינים מזוהים: מורכב שחפת mycobacterium. מ 'אביום, מ' אביום מורכבים, מ קנזאסי ומ 'גורדונה.

A.Telenti et al. גם פיתח שיטה פשוטה וזולה יחסית של זיהוי מינים של מינים חשובים קלינית של mycobacteria ידי PCR וטיפול שלאחר מכן עם שני אנזימי הגבלה (אנזימי בעלי תכונות לחתוך מולקולת DNA בנקודות ספציפיות). קטע הדנ"א מוגבר. אשר מקודד חלבון הלם חום (65 kDa), ולאחר מכן את הקטע PCR של 439 זוגות נוקליאוטידים המיוצרים על ידי PCR מטופל בנפרד עם שני אנזימים, Bste II ו Nae III. ואז נתח באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose השיגה שני מוצרים, קביעת גודלם (מספר זוגות בסיסים) באמצעות סט סטנדרטי של שברי דנ"א (DNA-סמנים מולקולריים) באורך 100 כדי 1000 זוגות בסיסים. בכל אחד מהמינים הספציפיים (מ 'שחפת, מ' אביום, מ 'intracellulare, מ' קנזאסי, M.fortuitum), 2 או 3 שברי דנ"א בגודל שונה מזוהים עבור כל אנזים הגבלה. השילוב של גדלי דנ"א שונים המתקבלים מאפשר הבדל אלה מינים בינם לבין עצמם.

הטכנולוגיה של microarrays DNA ביולוגי הוא מפותח. אשר יסייע לזהות יותר מ -100 מינים של mycobacteria במחקר אחד.

זיהוי הזנים יכול להתבצע גם על ידי הגברה PCR של אזור 16R rRNA משתנה ואחריו רצף amplicon בהשוואה למבנה הראשוני המקביל, המאפשר זיהוי יותר מ -40 מינים של mycobacteria.

בעזרת PCR, זיהוי מין בתוך השחלת mycobacterium מורכב יכול להתבצע גם, כולל הבחנה של מ 'בוביס מ' בוביס BCG. לשם כך, נוכחות או היעדר של כמה גנים באזורים הגנומיים של RD1 מנותח. RD9 ו RD10. RD1 נעדר ב M. Bovis BCG, אך קיים מינים ארסיים, כולל מ 'בוביס.

קביעת רגישות התרופה של שחפת Mycobacterium ידי PCR

יעדים של שיטות גנטיות מולקולריות עבור רגישות לתרופה או התנגדות של שחפת Mycobacterium להפחית לזהות מוטציות רצפי נוקליאוטידים ספציפיים של גנים ידועים. שיטות בסיסיות מבוססות גם על prochityvanii ישירה (רצף) של רצפים אלה לאחר הגברה או הכלאה של שברי DNA שכותרתו ביוטין מוגבר במהלך בדיקות DNA PCR. שתי החלופות כוללות זיהוי החלפות נוקלאוטיד רצפים כי בדיקות דנ"א באמצעות להוביל בהעדר או הכלאה שלם כדי קרום nitrocellulose באמצעות המצומד אנזים (phosphatase אלקליין-streptavidin) - ליפא-Rif-TB שיטה.

שיטה למדידת הקרינה קבועה מקומית microsections DNA הבוחן משלים מוטציות ידועות באזורי הגן המוגברים PCR האחראים התנגדות או רגישות לתרופה, שנקראות mikrobiochipov שיטה. האלגוריתם העיקרי לביצוע מחקר זה הוא כדלקמן. לאחר לבודד DNA ממדגם קליני או התרבות של mycobacteria יש צורך לבצע הגברת PCR של שברים רלוונטיים של גן rpoB אחראי רגישות לתרופה אל ריפמפיצין או katG ו inhA גני המקודדים חלבונים של Mycobacterium אחראים רגיש איזוניאזיד. תוצאות ה- PCR מוערכים על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל, שבו שברי ה- DNA המקביל של אורך הרצוי מאושרים. לאחר מכן, בסיבוב השני של PCR מתבצע להציג תווית ניאון לתוך ה- DNA. התוצאות של PCR מאושרים שוב על ידי אלקטרופורזה ג'ל. לאחר מכן, כלאה בוצעה (דגירת הלילה), ואחריו כביסת החומר המתקבל על biochip, וזה מספר גדול של קבועים בהסכם גדילי דנ"א קצרים צלחת זכוכית קטנה (בדיקות) אשר משלימות נוקלאוטיד רצפים של שחפת Mycobacterium סוג התרופה רגישה בנקודות של מוטציות אפשריות. כמו גם את רצפי מוטציה אחראי ההתנגדות לסמים. מיקום של בדיקות DNA על הצלחת - מוגדר בקפדנות, ורמת הקרינה נצפתה על כלאה כדי לקבוע את התוצאה באמצעות מכשיר קריאה מיוחד מותקנת. לעניין זה, תוצאות הניתוח נקבעות באמצעות תוכנית מחשב מיוחדת.

בשנים האחרונות, שיטות חלופיות לקביעת הרגישות התרופה של שחפת mycobacteria על בסיס בזמן אמת PCR הטכנולוגיה פותחו, אשר מאפשרים לערוך מחקרים אלה במבחן צינור סגור.

באיור. 13-13 מציג את התוצאה של ניתוח תרבויות קליניות של שחפת mycobacterium בקביעת עמידות התרופה כדי rifampicin ידי PCR בזמן אמת: 218 - מדגם שליטה (רגיש ריאמפפיצין); 93 - שליטה חיובית על המוטציה של Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - שליטה חיובית עבור מוטציה של Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - דוגמאות ניסיוניות. תוצאה של חישוב עקומות קינטי של הגברה על 4 ערוצים: ערוץ 1: 393 - שליטה חיובית עבור מוטציה של Ser-Trp TCG-TGG; ערוץ 2: 4482 - שליטה חיובית עבור מוטציה של Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - דוגמאות ניסיוניות; ערוץ 4: עקומות קינטי של הגברה של כל הדגימות המשתתפים בניסוי. שליטה חיובית של תגובת הגברה. מסקנות: בהתבסס על תוצאות הניתוח, זוהו המוטציות הבאות הקובעות את ההתנגדות לריאמפפיצין: בדגימות 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. אותו עיקרון שימש כדי לקבוע את עמידות התרופה ל- isoniazid עבור הגנים katG ו- inhA, הקובעת את המוטציות השכיחות ביותר.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

זן זיהוי של שחפת mycobacterium

השיטה היותר נחקרות לעומק של זיהוי זני שחפת Mycobacterium הוא פולימורפיזם אורך קטע הגבלה שנקרא טכניקה (RFLP RFLP,. או בגרסה האנגלית) ואשר מבוססת על fragmentirovanin (הגבלה) של האנזים דנ"א Mycobacterium שחפת Pvu השנייה ואת שברי שהושג הכלאה עוקבות עם רצפים ספציפיים מסוימים על ה- DNA אלמנט חוזר שלה IS6110. השתנות Intraspecific הוא הבין בשל מספר שונה של חזרות של IS6110 ואת המיקום שלהם על DNA. כמו גם את מגוון המרחקים בין אנזים מסוים הגבלת נקודות התקפה אנזים (אתרי הגבלה) ו IS6110 אלמנט. טכנולוגיה זו היא מאוד מסובכת זמן רב. לאחר טיפול עם DNA שחולץ מתרבות של שחפת Mycobacterium, ג'ל אלקטרופורזה מבוצע עם אנזים הגבלה, ולאחר מכן הועבר שברי DNA של באורכים שונים על קרום nitrocellulose, הכלאה בוצעה עם שברים-אלמנט IS6110 ו- זוהתה באמצעות תגובות אנזימטיות. דפוס מסוים שנוצר של להקות מאפיין את ה- DNA של זן מסוים של שחפת Mycobacterium. בעזרת ניתוח מחשב, זהות או זיקה של זנים מתגלה. למרות ששיטת ה- RFLP היא המפלה ביותר, כלומר. המזהה את מספר ההבדלים בגודלה הזנים נתחו, זה לא יעיל עבור מספר קטן (פחות מ 5) IS6110-חזרות שנצפו זנים מסוימים. באיור. 13-14 מציג את התוצאות של הקלדת RFLP של זנים.

חלופה עשויה להיות השיטה של spoligotyping - ניתוח של פולימורפיזם של רצפי DNA spacer - ביניים בין חוזר ישיר של אזור DR. בעת ביצוע spoligotyping של זנים, PCR מתבצעת עם primers הגובל באזור DR, לאחר מכן שברי באורך שונה נוצרים אשר הכלאה עם המשתנה אזורים ביניים של ה- DNA. ניתוח של רצפים spacer של אזור DR מוצג. על פי החוקרים, פשוט יותר, פרודוקטיבי ומתאים בדיקות ראשוניות של זנים אנליזה אפידמיולוגית ראשונית, כמו גם מחקר קליני חומר ישיר.

ברור, שיטה יעילה יותר ונגיש טכנולוגית היא VNTR (קיצור של מילים באנגלית), או שיטה לקביעת מספר משתנה של חוזרת טנדם המדויק בדנ"א של שחפת mycobacterium. שיטה זו מבוססת רק על השימוש PCR ואינו דורש מניפולציה נוספת. מאז מספר חוזר טנדם בזנים שונים ובמקומות שונים הוא שונה, שברי בגדלים שונים נקבעים ונותחו על electrophoregram כתוצאה של מוצרים PCR. לדברי החוקרים, באמצעות VNTR משיגה מידה רבה יותר של אפליה של זנים מאשר עם שיטת RFLP.

תשומת לב רבה שולמה בשנים האחרונות להפצת זנים של שחפת Mycobacterium של משפחת W-Beijing (המכונה לעתים זן בבייג'ינג), שהם במידה רבה עמידות לתרופות.

דרישות בסיסיות לאיכות המחקר הביולוגי המולקולרי

[72], [73], [74], [75],

מסמכים רגולטוריים בסיסיים עבור PCR

הזמנות רוסית משרד הבריאות: №45 מן 2000/07/02 g .. מספר 109 מ- G 2003/03/21 .. מספר 64 מן 2000/02/21, הנחיות: 1.3.1888-04 "ארגון העבודה במחקרים באמצעות PCR חומר נגוע ביולוגיים פתוגניים סוכני קבוצות III-IV של פתוגניות "; 1.3.1794-03 "ארגון עבודה בחקר חומר PCR, נגוע מיקרואורגניזמים של I-II פתוגניות הקבוצות". 2003; 3.5.5.1034-01 "טיהור של החומר, נגועה בחיידקי קבוצות פתוגניות I-IV כאשר באמצעות PCR," 2001 הנספח 11 להוראות האחידות שיטות בדיקת מיקרוביולוגיות בזיהוי, האבחון והטיפול של שחפת.

[76], [77], [78]

הצוות

ביצוע של מחקר מולקולרי ביולוגי עשוי להחזיק הרופאים של לאבחון קליני מעבדתי, בקטריולוגים רופאים, וירולוגים, רופאים, ביולוגים, מעבדה לאבחון קליני, כמו גם מומחים בעלי השכלה רפואית משנית, עברה התמחות והכשרה מתקדמת בדרך שנקבעה.

סידור חדרי מעבדה

חדרי המעבדה הבאים נדרשים:

• אזור הטיפול המדגם הוא מעבדה המותאמת לעבודה עם סוכנים זיהומיים של קבוצות פתוגניות III-IV, על פי ההוראות המתודולוגיות 13.1888-04.
• אזור להכנת תערובות תגובה PCR - חדר מעבדה, המספק הגנה מפני זיהום פנימי במעבדה - "נקי" אזור.
• • אם אלקטרופורזה או הכלאה משמש לניתוח מוצרים PCR. במעבדת חדר שבו שברי DNA הכפולים המחולצים הצינורות וההגברה, בהתאמה, עשוי להיכנס לסביבה, בהתאם לדרישות למעבדות PCR (1.3.1794-03 הנחיות, הדרכת 1.3.1888-04) חייב להיות מלא הוא מבודד מן המקום המצוין בפסקאות הקודמות. התנועה מן האזור אלקטרופורזה לאזור טיפול המדגם ואת "נקי" אזור של כל אדם, ציוד, כל החומרים והאובייקטים, כמו גם הובלה אווירית באמצעות מערכת אוורור או כתוצאה של טיוטות, יש להימנע. אזור זה אינו נדרש לגילוי fluorimetric של מוצרי PCR.
• חדר לעיבוד ועיבוד של תוצאות מצויד במחשבים וציוד משרדי הדרושים. חדר זה עשוי להכיל ציוד המספק זיהוי של מוצרי PCR מבלי לפתוח את הצינור. - גלאי PCR ניאון תרמי cyclers בזמן אמת PCR.

הדרישות התברואתיות והאפידמיולוגיות לטיפול הראשוני בכיחום דומות לדרישות המיקרוביולוגיות המקובלות לעבודה עם שחפת מיקובקטרית.

[79], [80], [81], [82],

השלמת ציוד מעבדה לאבחון PCR

המעבדה כוללת ציוד לחדרים הבאים.

• חדר להכנת הכנה, מכיל את הציוד הבא: למינרית של המעמד השני של הגנה "SP-1.2": מצב מוצק thermostat עם כיסוי חימום עבור מבחנות של סוג "Eppendorf"; microcentrifuge ב 13,000 סל"ד; צנטריפוגה (וורטקס); מקרר עם טווח טמפרטורות מ -20 ^о С עד 10 ^о С; פיפטות של נפח משתנה של סדרת "Rroline"; משאבה עם בקבוקון מלכודת OM-1; חצובה על פיפטות; חצובה תחנת עבודה 200x0.5 מ"ל; חצובה תחנת עבודה 50x1.5 מ"ל; מעמדים לאחסון מבחנות 80x1.5 מ"ל;
• התגובה תערובת בחדר ההכנה: חדר מגן PCR-box ("Laminar-C 110 ס"מ); צנטריפוגה - וורטקס; פיפטים בנפח משתנה של סדרת Proline; חצובה על פיפטות; חצובה תחנת עבודה 200x0.2 מ"ל; מעמדים לאחסון מבחנות 80x1.5 מ"ל; מקרר עם טווח טמפרטורות מ -20 ^о С עד 10 ^о С;
• חדר אלקטרופורזה: מצלמה עבור אלקטרופורזה אופקית; ספק כוח; transilluminator;
• מגברי DNA או מנתח חומצה גרעין (PCR בזמן אמת) עם מחשב ותוכנה; ניתן להציב בכל חדר חילוף. אם הטכנולוגיה PCR בזמן אמת משמש. חדר אלקטרופורזה אין צורך.

[83], [84], [85], [86]

בקרת איכות חיצונית

כדי להיות בטוחים בהשגת תוצאות אמינות אובייקטיבית, מעבדות צריך להשתתף במערכת של הערכה חיצונית של איכות המחקר במעבדה.

המשתתפים במערכת בקרת האיכות מקבלים; 12 בקבוקונים של השעיות תא החיידק מיובשים בהקפאה, שניים מהם מכילים את קוקוס E. E. Coli, 3 מבחנות עם שחפת Mycobacterium (זן לֹא אַלִים) בשעה 10 ² / מ"ל; 3 אמפולות עם תאים של זן דומה בריכוז של 10 ⁴ / מ"ל; 2 אמפולות עם mycobacteria ללא שחפת מ 'אביום intracellulare ו מ kansasii בריכוז של 10 ⁵ / מ"ל.

בדיקות מבוזרות להערכת איכות חיצונית נבחנות מראש בשתי מעבדות עצמאיות בעלות ניסיון רב בתחום.

[87], [88]