שיטות גנטיות מולקולריות לאבחון מחלות תורשתיות

שיטות טכנולוגיית DNA משמשות לקביעת מיקום גן מוטנטי בכרומוזום מסוים, האחראי למקורן של צורות מסוימות של פתולוגיה תורשתית. מכיוון שגן הוא קטע של DNA, ומוטציה גנטית היא נזק למבנה הראשוני של ה-DNA (מוטציה מובנת ככל השינויים ברצף ה-DNA, ללא קשר למיקום שלהם ולהשפעתם על חיוניותו של אדם), אזי, על ידי בדיקת תכשירים של כרומוזומי מפאזה של חולה עם מחלה תורשתית, ניתן לקבוע את מיקום הגן הפתולוגי. שיטות גנטיות מולקולריות יוצרות הזדמנויות לאבחון מחלות ברמת מבנה DNA שונה, הן מאפשרות לנו לקבוע את מיקום ההפרעות התורשתיות. שיטות גנטיות מולקולריות יכולות לזהות מוטציות הקשורות להחלפת בסיס בודד אפילו.

השלב החשוב ביותר בזיהוי גנים הוא בידודו. ניתן לבודד DNA מכל סוג של רקמה ותאים המכילים גרעינים. שלבי בידוד ה-DNA כוללים: ליזיס מהיר של תאים, הסרת שברי אברונים וממברנות תאיים על ידי צנטריפוגה, הרס אנזימטי של חלבונים ומיצולם מהתמיסה באמצעות פנול וכלורופורם, ריכוז מולקולות DNA על ידי משקעים באתנול.

במעבדות גנטיות, מבודד DNA לרוב מליקוציטים לויקוציטים בדם, ולשם כך נלקחים 5-20 מ"ל של דם ורידי מהמטופל לתוך מבחנה סטרילית עם תמיסת נוגדת קרישה (הפרין). לאחר מכן, מופרדים הלויקוציטים ומעובדים בהתאם לשלבים הנ"ל.

השלב הבא בהכנת החומר למחקר הוא "חיתוך" ה-DNA לקטעים באזורים בעלי רצף בסיסים ספציפי לחלוטין, המבוצע באמצעות אנזימים חיידקיים - אנדונוקלאזות הגבלה (אנזימי הגבלה). אנזימי הגבלה מזהים רצפים ספציפיים של 4-6, ופחות 8-12 נוקלאוטידים במולקולת DNA דו-גדילית ומחלקים אותה לקטעים במקומות בהם נמצאים רצפים אלה, הנקראים אתרי הגבלה. מספר קטעי ההגבלה המתקבלים של DNA נקבע על ידי תדירות הופעת אתרי ההגבלה, וגודל הקטעים נקבע על ידי אופי פיזור האתרים הללו לאורך מולקולת ה-DNA המקורית. ככל שאתרי ההגבלה ממוקמים לעתים קרובות יותר, כך קטעי ה-DNA קצרים יותר לאחר ההגבלה. כיום ידועים יותר מ-500 סוגים שונים של אנזימי הגבלה ממקור חיידקי, וכל אחד מאנזימים אלה מזהה את רצף הנוקלאוטידים הספציפי שלו. בעתיד, ניתן להשתמש באתרי הגבלה כסמנים גנטיים של DNA. ניתן לסדר את קטעי ה-DNA הנוצרים כתוצאה מההגבלה לפי אורך באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז או פוליאקרילאמיד, וכך ניתן לקבוע את משקלם המולקולרי. בדרך כלל, DNA בג'ל מזוהה על ידי צביעה ספציפית (בדרך כלל אתידיום ברומיד) וצפייה בג'ל באור אולטרה סגול מועבר. אתרי לוקליזציה של ה-DNA צבועים באדום. עם זאת, בבני אדם, כאשר DNA עובר עיבוד על ידי מספר אנזימי הגבלה, נוצרים כל כך הרבה מקטעים באורכים שונים שלא ניתן להפריד ביניהם באמצעות אלקטרופורזה, כלומר לא ניתן לזהות חזותית מקטעי DNA בודדים באלקטרופורזה (מתקבלת צביעה אחידה לכל אורך הג'ל). לכן, כדי לזהות את מקטעי ה-DNA הרצויים בג'ל כזה, משתמשים בשיטת ההכלאה עם גלאי DNA מסומנים.

כל מקטע חד-גדילי של DNA או RNA מסוגל להיקשר (להכליא) עם גדיל משלים, כאשר גואנין תמיד נקשר לציטוזין, ואדנין לתימין. כך נוצרת מולקולה דו-גדילית. אם עותק חד-גדילי של גן משובט מסומן בתווית רדיואקטיבית, מתקבל גלאי. הגליאי מסוגל למצוא מקטע משלים של DNA, אשר לאחר מכן מזוהה בקלות באמצעות אוטורדיוגרפיה. גלאי רדיואקטיבי הנוסף לתכשיר של כרומוזומים מתוחים מאפשר למקם את הגן על כרומוזום ספציפי: באמצעות גלאי DNA, ניתן לזהות אזורים ספציפיים במהלך סתם סאות'רן. הכלאה מתרחשת אם מקטע ה-DNA הנבדק מכיל גן תקין. במקרה בו קיים רצף נוקלאוטידים חריג, כלומר מבני הכרומוזום המתאימים מכילים גן מוטנטי, לא תתרחש הכלאה, מה שמאפשר לקבוע את מיקום הגן הפתולוגי.

כדי להשיג גלאי DNA, נעשה שימוש בשיטת שיבוט גנים. מהות השיטה היא שמקטע DNA המתאים לגן או לקטע של גן מוכנס לחלקיק שיבוט, בדרך כלל פלסמיד חיידקי (DNA חוץ-כרומוזומלי טבעתי הנמצא בתאי חיידקים ונושא גנים עמידים לאנטיביוטיקה), ולאחר מכן החיידקים עם הפלסמיד עם הגן האנושי שהוכנס מוכפלים. הודות לתהליכי הסינתזה בפלסמיד, ניתן להשיג מיליארדי עותקים של הגן האנושי או מקטעו.

עותקי ה-DNA המתקבלים, המסומנים בתווית רדיואקטיבית או בפלואורוקרום, משמשים לאחר מכן כגשושים לחיפוש רצפים משלימים בין מאגר מולקולות ה-DNA הנחקר.

כיום, קיימות שיטות רבות ושונות המשתמשות בבדיקות DNA לאבחון מוטציות גנטיות.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]