שיטות גנטיות מולקולריות לאבחון מחלות תורשתיות

הטכנולוגיה שיטות DNA משמשים כדי לקבוע את לוקליזציה בתוך כרומוזום מסוים של הגן המוטנטי אחראי מקורם של צורות מסוימות של מחלות תורשתיות. מאז הגן הוא קטע DNA ו מוטציה גנטית - נזק למבנה העיקרי של ה- DNA (מוטציה מובנת על ידי כל שינויים ברצף ה- DNA, ללא קשר למיקום שלהם ואת השפעתה על יכולת הקיום בודדים) אז דברים סמויים ההכנות של הכרומוזומים החולה metaphase מחלה תורשתית, ניתן להקים לוקליזציה של הגן הפתולוגי. שיטות של גנטיקה מולקולרית כדי ליצור את האפשרות לאבחון מחלות על מבנה הדנ"א שינה, הם מאפשרים לברר את הלוקליזציה של הפרעות בירושה. שיטות גנטיות מולקולריות יכולות לחשוף מוטציות הקשורות להחלפת בסיס יחיד.

השלב החשוב ביותר בזיהוי הגן הוא הבידוד שלו. DNA יכול להיות מבודד מכל סוג של רקמה ותא המכילים גרעינים. הצעדים של בידוד DNA כוללים תמס מהיר של התאים על ידי צנטריפוגה עם הסרת שברי אברונים הסלולר ממברנות, הרס אנזימטי של חלבוני החילוץ שלהם מהפתרון עם פנול כלורופורם, ריכוז ה- DNA על ידי משקעי אתנול.

במעבדות גנטיות, הדנ"א מבודד לרוב מבדיקות הדם, אשר עבורו הוא נלקח 5-20 מ"ל של דם ורידי בצינור סטרילי עם פתרון נוגדי קרישה (הפרין). לוקוציטים מופרדים ומעובדים בהתאם לשלבים המתוארים לעיל.

השלב הבא של הכנת חומר ללימוד - DNA "לחתוך" לתוך שברים באתרים עם רצף בסיס מאוד ספציפי מבוצע באמצעות אנזימים חיידקיים - endonucleases הגבלה (אנזימי הגבלה). אנזימי הגבלה להכיר רצפים ספציפיים של 4-6, לפחות 8-12 נוקלאוטידים לתוך מולקולת הדנ"א הדו-גדילים והמופרד שלה לרסיסים של רצפים אלה בתרגום אתרים שנקראים אתרי הגבלה. שברי הגבלה מיוצרת מספר DNA נקבעו לפי תדירות התרחשותם של אתרי הגבלה ושברי גודל - אופי חלוקת האתרים הללו לאורך מולקולת הדנ"א המקורית. לעתים קרובות יותר את אתרי ההגבלה ממוקמים, קצר יותר את שברי הדנ"א לאחר הגבלה. כרגע יש יותר מ 500 סוגים שונים של אנזימי הגבלה ממקור חיידקי, וכל אחד האנזימים האלה מזהה רצף מסוים של נוקלאוטידים. בעתיד, אתרי הגבלה יכולים לשמש כסמנים גנטיים לדנ"א. שברי ההגבלה DNA וכתוצאה מכך ניתן למיין לפי אורך ידי אלקטרופורזה ב agarose ג'לים או polyacrylamide, ובכך עשוי להיקבע המשקל המולקולרי שלהם. בדרך כלל לגילוי DNA בתוך הג'ל בשימוש על ידי מכתים ספציפיים (לרוב ברומיד ethidium) וצפייה ג'ל המשודר להדליק את האולטרה סגול. מיקומים של לוקליזציה DNA יש צבע אדום. עם זאת, אדם בעיבוד של מספר הגבלה DNA endonucleases נוצרו כל כך הרבה שברי באורכים שונים כי הם לא מצליחים להיות מופרדים על ידי אלקטרופורזה, זה לא אפשרי מבחינה ויזואלית לזהות את שברי DNA הפרט electrophoregram (צבע אחיד המיוצר לאורכה של ג'ל). לכן, שיטת הכלאה עם בדיקות DNA שכותרתו משמש כדי לזהות את שברי ה- DNA הרצוי ג'ל כזה.

כל מקטע יחיד של דנ"א או רנ"א מסוגל לקשור (הכלאה) בשרשרת המשלימה שלו, וגואנין קשורה תמיד עם ציטוזין, אדנין עם תימין. זהו מבנה של מולקולה כפולה. אם עותק חד-גדילי של הגן המשובט מסומן בתווית רדיואקטיבית, יתקבל בדיקה. החללית יכולה למצוא קטע משלים של דנ"א, אשר מזוהה בקלות על ידי הרדיו. בדיקה רדיואקטיבית שנוספה לתרופה של כרומוזומים מתוחים מאפשרת לגן להיות ממוקד על כרומוזום מסוים: דגימות DNA מסוימות מזוהות עם בדיקת DNA בדם סופג. הכלאה מתרחשת אם חלק הבדיקה של ה- DNA מכיל גן רגיל. במקרה שבו קיים רצף לא נורמלי של נוקליאוטידים, כלומר, המבנים הכרומוזומים המקבילים מכילים גן מוטנטי, הכלאה לא תתרחש, המאפשר לקבוע את לוקליזציה של הגן הפתולוגי.

כדי להשיג בדיקות DNA, שיטת שיבוט הגן משמש. מהות השיטה מורכבת כי קטע DNA מתאים לכל גן או באזור של הגן מוכנס לתוך חלקיק השיבוט, בדרך כלל פלסמיד חיידקים (בהווה DNA extrachromosomal עגול תאים חיידקיים נושאת גנים עמידים לאנטיביוטיקה), ולאחר מכן החיידקים שיש פלסמיד עם גן אנושי מובנה, מוכפלים. בשל תהליכי הסינתזה אפשר להשיג מיליארדים פלסמיד עותקים של הגן או חלק ממנה האדם.

יתר על כן, עותקים דנ"א שכותרתו עם תווית רדיואקטיבית או fluorochromes משמשים בדיקות כדי לחפש רצפים משלימים בין מאגר של מולקולות דנ"א למד.

כיום, ישנם סוגים רבים של שיטות באמצעות בדיקות DNA עבור אבחון של מוטציות גנטיות.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],