עבודה נסיונית על השתלת קרטינוציטים אלוגניים על צלקות שנוצרו באופן מלאכותי של חולדות לבנות

הרצון להשתמש בפוטנציאל הסלולר והצורך לחפש שיטות יעילות חדשות לשיפור המראה האסתטי של הצלקות הובילו לרעיון לנסות לבחון את האפשרות של השתלת קרטינוציטים למשטחי הצטלקות.

על מנת להוכיח את האפשרות של שימוש בתרבות keratinocyte כדי לשפר את המראה של צלקות עבודה ניסויית נעשתה על חולדות מעבדה לבנות, אשר נוצרו משטח צלקת. המודל של rumen של חולדות הושג כתוצאה של ריפוי פצעים שנגרמו באופן מלאכותי על הגב, לאורך עמוד השדרה. חולדות נחתכו לחתיכות מאותו עור, גודל ס"מ 2x3. אחרי 2.5 חודשים לאחר הניתוח "הצטלקות סימולציה" חולדות נערך ניתוח שיוף עור (הסרת השכבות העליונות באמצעות בכרס ignioperation) ו קרטינוציטים אלוגנאית המושתלים, מבודד מן העור של חולדות צעירות 2-4 ימים לאחר הלידה.

בידוד וצמיחה של epidermocytes חולדה בוצע במעבדה של טכנולוגיות הסלולר של המכון של ציטולוגיה RAS של הטכנולוגיה הבאה.

העור נשטף תמיסה מלוחים הנקס המכיל 200 U / מ"ל ג'נטמיצין, לחתוך לחתיכות קטנות עם שטח של 0.2-0.5 ס"מ ². קוביות העור הודגרו בפתרון של 0.5% של disaspase במאזן מאוזן מלחי פוספט שנאגרו ב 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. החלקים הועברו לאחר מכן לפוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים והאפידרמיס הופרד מן הדרמיס. האפידרמיס הודגר בתמיסה טריפסין 0.125% במשך 10-15 דקות עם ערבוב ב 50 סל"ד, לאחר מכן הפעולה של האנזים הופסקה על ידי תוספת של 5% בסרום שור עוברית. שליש ההשעיה התא שהושג שימש בצורתו הטהורה עבור אחד הווריאנטים של השתלת לצלקות, והשלישי גדל על biocompatible ציפויי הסרט המקומי "Polypor", השלישי - על צלחות פטרי ללא המצע. הניתוח של dermabrasion של צלקות שהתקבלו בחולדות עם השתלה לאחר מכן של אפידרמוציטים חולדה על אותם בוצע תחת הרדמה אתר באמצעות כובע חום.

הקבוצה הראשונה של חולדות לאחר שיוף עור על מלוטש, נשטף עם מליחים בכרס סטרילי השטח המיובש גבי פיסות דשא, אשר הופקד מקושקשות תרחיף epidermotsitov עכברוש אלוגנאית בריכוז של 1.5 מיליון תאים לכל 1 מ"ל (על פי המכון ציטולוגיה). חתיכות Batistovye להתאים על צלקת מלוטשת כך התאים שוכבים על פני הצלקת. תחבושת של כמה שכבות גזה נתפרה למעלה, שנתפרה לקצות הצלקת.

חלק ההשעיה התא שהתקבל היה מצופה בצלחות פטרי על סרטים פוליפור סטרילי לחתוך בצורה של כוסות, החלק השני על צלחות פטרי ללא סרט. הטיפוח בוצע במדיום FAD המורכב מתערובת של DMEM ו- F12 ביחס של 3: 1. עם תוספת של 10% בסרום שור עוברית, 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין (סיגמא), 0.5 מיקרוגרם / מ"ל hydrocortisone hemisuccinate (Sigma). 10 מיקרוגרם / מ"ל אפידרמיס גורם הצמיחה EGF (המכון של RAS ציטולוגיה, סנט פטרסבורג). הקבוצה השנייה והשלישית של חולדות עם 7 אנשים הופעלו 6 ימים לאחר הראשונה. בשלב זה, שכבות multilayer נוצרו ההשעיה של קרטינוציטים שנזרעו בצלחות פטרי, אשר הושתלו חולדות. הקבוצה השנייה הושתלה עם אפידרמוציטים על הסרט, הקבוצה השלישית - עם שכבת multilayered ללא המצע. לאחר 7 ימים, שכבות מרובות שכבות של קרטינוציטים אלוגיים (MPALK), שנזרעו על סרטי פוליפור, הושתלו על ידי התרבות ישירות על משטח הפצע. למעלה, הסרט, כדי למנוע את קרע, היה קבוע עם גזה רב שכבתי ההלבשה ותפור העור של חולדות.

לפני השתלת קרטינוציטים קבוצה של חולדות שלישיות, גדל בלי המצע, ייצור פרדה של PAC מעומק טיפול dispase צלחת פטרי, בעלת היכולת סלקטיבית לשבור את התקשורת אפידרמיס-דרמו. תחת פעולה של dispase מאגר רב שכבתי הורס את הקשר של שכבת התאים הבזליים לתחתית צלחת פטרי ובמידה פחותה בהרבה, זה משפיע על תקשורת בין תאית, אשר מאפשרת "להוציא" את השכבה כולה. ניתוק שכבת התאים הרב שכבתית נעשה על פי הנ"ל. מ צלחות פטרי מעורבבות בינוני תחבורה, גיליונות התא נשטפו שלוש פעמים עם מדיום המכיל אנטיביוטיקה, בפרט - גנטמיצין (0.2 מ"ג / מיליליטר). שכבות רבות שכבתיות נוצקו 0125 פתרון% dispase ( «סיגמא») והניחו באינקובטור שבו הם הודגרו ב t = 37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. המראה של קורולה לבן מתגלגל פריפריה של היווצרות היא אינדיקציה של תחילת תהליך של הפרדת אותו מקצוות התחתון של צלחת פטרי. כמה דקות לאחר תחילת תהליך ההפרדה, הפתרון של disaspase מוזגה, שכבות אפיתל נשטפו 2-3 פעמים עם המדיום. על פני השטח של שכבת אפידרמיס יושם, לחתוך ל פצע סטרילי חתיכת כוס בגודל ההלבשה "Leith-צבע, אשר הוא בקע מופרדי dispase היווצרות, delamination נוספת בתחתית הכוס עם מרית. בעזרת פינצטה עיניים שכבה יחד עם הציפוי של המפית" Leith-הצבע "(רוסית ) פרשו מן התחתון של צלחת פטרי והועברו בזהירות אל פני השטח מוכן של הצלקת. מפיות "ליטה-צבע" מכיל בהרכבו ו eksolin גנטמיצין (תמצית קולגן), אשר כאשר רטוב הסביבה נשארת נבט בעתיד תמיסת מלח שם התנפחה והפכה ציפוי הפצע מודרני המספק הגנה טובה מפני זיהום חיצוני וריפוי מהיר עקב רטיבות מתחלה עם מבנה.

סרטי פוליפרופ ופיות ליטה היו מרופדים בתחבושות גזה שנתפרו על עור החולדות לשם קיבוע עמיד יותר. כל עכברוש היה נטוע בכלוב נפרד, כדי ליצור תנאים אופטימליים לתחזוקה שלה engraftment של קרטינוציטים המושתלים. חולדות תחבושות כי מושתלי השעיה dispase מאגר epidermotsitov ירה רב שכבתי, כל יום כמה פעמים ביום, טבולות תמיסת מלח סטרילית כדי ליצור את התנאים הטובים ביותר עבור תאי engraftment. בהתחשב בכך שהסרט "פוליפור" היה בלתי ניתן להשגה, חולדות הקבוצה השנייה לא הרטיבו את הרוטב, שהיה אחד היתרונות על השתלות ללא סרטים. לאחר 10 ימים הוסרו התחבושות. התמונה הקלינית של צלקות לאחר השתלת תאים נבדלה מעט מצלקות ללא השתלה, פרט לצביעה ורודה יותר (עקב dermabrasion) וקילוף גדול יותר. עובדה זו מצביעה על כך. כי מיד לאחר היעלמות כיסוי הפצע עם IPC, לא התרחשו שינויים ב rumen.

נטילת חומר ביופסיה בחולדות.

לאחר 1, 2, 5 ו - 9 חודשים לאחר העברת חוליות אלוגי חולדה אל הצלקות של gratsed חולדות לבן, החומר נלקח עבור בדיקה היסטולוגית היסטולוגית, cytomorphological אלקטרונים. כמו דגימות בקרה של עור חולדה רגילה צלקת נלקחו ללא השתלת תאים. הרדמה בחולדות בוצעה עם הרדמה באתר.

לאחר ההרדמה, מן האזורים המסומנים, אשר לתוך קרטינוציטים היו מושתלים, ביופסיה piercer עם קוטר של 2 מ"מ. החלקים של רקמות צלקת נלקחו והוכנסו פתרון glutaraldehyde 2.5% להכין את החומר עבור מיקרוסקופ אלקטרונים. חתיכות של רקמות שנלקחו לבדיקה היסטולוגית הונחו בפתרון של 10% של פורמלין נייטרלי, ואחריו חיווט דרך רוחות ושופכים לתוך פרפין, ואחריו חיתוך קטעים דקיקים וצפייה בהם מיקרוסקופים אור אופטי.

שליטה I. עור חולדה רגילה.

על מנת לראות את ההבדל בין התמונה המיקרוסקופית של העור הרגיל של חולדות וצוואר בזמנים מסוימים לאחר השתלת ה- IPC, מוצגים תצלומים ותיאורים להם בכל שלבי המחקר.

האפידרמיס של עור רגיל מורכב של 7-9 שכבות של תאים. שכבה חרמנית של עובי בינוני. במקומות הוא מורכב 6-8 שכבות של קשקשים חרמנית. השכבה הבסיסית מיוצגת על ידי תאים של צורה גלילית עם אור גדול, גרעינים רגילים וכמה גרעינים. קשרים דסמוזומליים בין התאים לבין הממברנה הבסיסית מתבטאים בבירור. תחת קרום בסיס מוגדר היטב שבו יש בליטות קנס במקביל שקר שכבת subepidermal אל החבילות העדינות של סיבי קולגן ואלסטין, כוללים פיברובלסטים מוארכים, כלי קטן. בשכבות עמוקות יותר, צרורות של סיבי קולגן ואלסטין נמצאים בכיוונים שונים. ביניהם יש כלים רבים עם קירות דקים של אותו קליבר, אלמנטים הסלולר (fibroblasts, תאי התורן, leukocytes). במספר גדול של זקיקי שיער, בלוטות החלב.

שליטה 2. צלקת של חולדה 2 חודשים.

תמונה קלינית. צלקות ורודות בהירות, עם קילוף, במקומות הקרום להישאר. ושטחם ירד בשל התכווצות של סיבי הקולגן הופכים כ 3.0-3.5 ס"מ ^:. העור קבצים מצורפים נעדרים.

תמונה מיקרוסקופית. האפידרמיס מורכב 3-5 שכבות של תאים, קפלים, המיוצג על ידי תאים הבזליים מעוגלים, אחד בשורה subulate, 1-2 שורות keratohyalin גרגיר עם דגנים בשכבה העליונה, ישנם חלקים של בצקת תאית. שכבת הקרנית השתנתה הטרוגנית מ דק מאוד כדי מעובה. יש קיפול של rumen עקב (התכווצות) של רקמת צלקת. הקפלים חודרים אל שכבת האפיפיור ומביאים את הרושם של פפיליות. הגבול בין האפידרמיס לבין הדרמיס הוא קו ישר. הממברנה הבסיסית לא ניתן למצוא בכל מקום. בחלק התחתון של השכבות התת-קרקעיות והעמוקות יותר - כלי עם קיר עבה, משוחרר, רבים נטושים, עם תופעות קיפאון. סביב כלי - אשכול של מקרופאגים, fibroblasts. מקרופאגים מקיפים את אריתרוציטים המתעוררים מן הנימים ו phagocytize אותם. בשכבות שטחיות יותר - נימים קטנים. מתחת לאפידרמיס, סיבי הקולגן משוחררים. בשכבה עמוקה יותר של החרוז - צרורות גס של סיבי קולגן ביניהם שיש fibroblasts רבים.

הצטלקות של חולדה בחודש לאחר השתלת עכברוש MPAl חולדה עכברים keratinocytes.

תמונה קלינית. צלקות ורודות, שטחן ירד, במיוחד בקוטר ממוצעים 2.5-3 ס"מ ². שיער בלוטות החלב נעדרים.

בדיקה מיקרוסקופית אלו של החומר המתקבל חולדות עם העברת MPAlK MPAlK על הסרט ואת המצע בלי זהות משמעותית. עם זאת, מבחינה טכנית, עבודה עם MPAlK הנתמך הרבה יותר קשה ומייגע יותר כאשר גדל MPAlK על המצע, כך במחקר הנוסף של הנושא על ההשתלה kertainotsitov צלקות השתמשנו כבסיס לטיפוח ( "מצע") דשא שכבתי.

תמונה מיקרוסקופית. יש עיבוי של האפידרמיס עד 15-20 שכבות, כמעט עד אמצע שבו קרטינוציטים יש צורה אנכית צרה, מוארכת, הסדר קומפקטי. התאים הבסיסיים מסודרים בקו אחיד. הגרעינים שלהם הם אור, גדול, עגול בצורת עם אחד או שניים nucleoli, אשר מצביע על פעילות סינתטי גבוהה שלהם. הגבול בין האפידרמיס לבין הדרמיס הוא קו ישר. שכבת קוצני מפותח היטב, מורכב 3-5 שכבות של תאים צורה עגולה, ישנם 2 תאים נוקלאולוס.

מיד מתחת לקרום הבסיסי - ממוקם בצפיפות חבילות דק של סיבי קולגן, במקביל להם מספר רב של כלי ריק, סיבי קולגן עמוק יותר גס, שנאספו צרורות צפופים. פיברובלסטים גדולים רבים, תאי תורן (2-3 בתחום הראייה), מקרופאגים, לויקוציטים וכלי ריקים, שהקירות שלהם משתחררים, סביבם נמצאים סיבי קולגן רפויים. בחלק כלי - stasis, diapedesis של אלמנטים אחידים. סביב כלי - fibroblasts, לימפוציטים בודדים. העור קבצים מצורפים נעדרים.

כאשר ההשעיה keratinocyte מושתלת צלקת מלוטשת, התמונה מיקרוסקופית שונה מזו הקודמת. ברוב בעלי החיים - האפידרמיס הוא דק, מורכב 5-6 שכבות של תאים. השכבה התחתונה מורכבת מתאים של צורה לא סדירה, מצולעת עם גרעינים מעוגלים בצורה לא סדירה. מצבו של השכבה התת-דלקתית דומה לזה של קבוצת בעלי החיים ללא השתלה.

במקרה זה, אפשר לדבר גם על עיכוב של תהליכים המלווים השתלת תאים, או של הפסד גדול של תאים מושתלים בצורה של השעיה. לפיכך, המסקנה היתה כי תיקון הצטלקות על ידי השתלת קרטינוציטים בצורה של ההשעיה אינו הולם.

הצטלקות של חולדה 2 חודשים לאחר השתלת חולדה עכברוש עכברוש קרטינוציטים.

תמונה קלינית. הצלקת נראית רזה, עדינה. במקומות יש אקדיזה, קשקשים.

תמונות מיקרוסקופיות. שכבת הקרנית מעובה, במקומות - היפרקרטוזיס. האפידרמיס מעובה, הוא מורכב 12-20 שורות של תאים. הגבול בין האפידרמיס לבין הדרמיס הוא קו ישר. סיבי קולגן עדינים מתחת לאפידרמיס מונחים בחוזקה. בשכבות עמוקות יותר של הרומן הם נאספים בחבילות גדולות וגסות. בשכבת תת-תת-עורית מופיעה מערכת חדשה של כלי שיט. בשכבות התחתונות של רקמת הצלקת - כלי ריק רבים, הממוקם במקביל לפני השטח של האפידרמיס. Fibroblasts גדול מופצים באופן שווה בעובי של רומן, יש מקרופאגים ענקיים, רב פנים, רבים.

הצטלקות של חולדה 5 חודשים לאחר השתלת MP של spermocytes חולדה.

תמונה קלינית. הצלקת נראית חלקה, חלקה ללא קילוף, יש שערות בודדות, הצפיפות שלהם גדולה יותר בפריפריה של הצלקות, מה שמראה את הצמיחה השולית של זקיקי השיער לתוך הצלקת ואת היווצרות זקיקי השיער. שטח הצלקות ממשיך לרדת.

תמונה מיקרוסקופית. האפידרמיס עדיין עבה (15-20 שכבות, לפעמים עד 30) בשכבות העליונות מלא גרגרי keratogialin. בבירור את הממברנה הבסיסית. תחת סיבי הקולגן שלה משוחרר. בשכבות התחתונות - קולגן הוא חזק יותר ארוז היטב. בין הקורות של קולגן יש נימים רבים .. בשכבות העליונות מספר כלי ריק ירד. האפידרמיס ודרמיס הם מעט גליים. בצמחי הצלקת יש פריחה עמוקה של האפידרמיס. בין סיבי הקולגן נראים כלי שיוצרו זה עתה. מופיעים זקיקי שיער בודדים ובלוטות החלב.

הצטלקות של חולדה 9 חודשים לאחר ההשתלה של עכברוש עכברוש עכברוש עכברוש.

תמונה קלינית. צלקות הפך הרבה יותר קטן בהשוואה למונחים קודמים, הממוצעים שלהם באזור על 1.5-2.0 ס"מ ². צלקות מכוסות בצורה לא אחידה עם שיער דק, במיוחד סביב הפריפריה. צלחת קטנה צלחת קטנה נשמרת.

תמונה מיקרוסקופית.

האפידרמיס נעשה דק יותר, המיוצג מ 6-8 שורות של תאים, מזכיר את המבנה האפידרמי של עור רגיל של עכברושים, רק את הצפיפות של תאים על ידי 1 מ"מ. גבוה יותר והם קטנים יותר. שכבת בזל מורכבת מתאים קטנים של צורה עגולה גלילית. קרום הבסיס הוא מוגדר היטב, hemidesmosomes נראים בבירור. הנוכחות של תולעים האפידרמיס בשכבת תת-פנימיים הוא ציין. שכבת papillary באה לידי ביטוי לאורך כל הצלקת. עובדות אלה מצביעים על כך במשך תקופה זו של זמן הדבקה של קרטינוציטים המושתלים הפך חזק יותר עם הרקמות הבסיסית של רומן. כתוצאה מכך, טיפול בצלקות של אנשים עם השתלת MALC 9 חודשים לאחר השתלת IPC יכול להיות מסורתי. מתחת לאפידרמיס סיבי קולגן עדינים יותר מאשר בשכבות העמוקות. היו שם הרבה כלי שיט, בעיקר על פני השטח. בכלי גדול יותר הקירות מעובים. זקיקי שיער ובלוטות החלב בכמויות גדולות. הדגם המיקרוסקופי דומה לרקמה עורי.

תוצאות העבודה הניסיונית והדיון בהם.

במהלך עבודה זו על צלקות בעור מלאכותיות של חולדות לאחר שיוף פעולה, קרטינוציטים מושתלים שונה formah- על משטחי פצעים, כמו השעיה עדינה היווצרות שכבתית ללא מצע. העבודה נעשתה כדי להשיג נתונים מורפולוגיים על ההשפעה של קרטינוציטים allogenic המושתלים על צלקות, כמו גם קביעת משתנים אופטימליים השתלה.

נמצא כי כל שלוש שיטות ההשתלה הן אמיתיות, אך השתלת IPAA ללא מצע היא הליך מייגע מאוד, שבמהלכו ניתן להיפצע IPAC, המשפיע על תוצאות ההשתלה. יתר על כן, שיטה זו של השתלה אינה כוללת עבודה על משטחים גדולים.

השעית keratinocyte השתלה - היא שיטה יותר חסכונית באופן משמעותי אינה מחייב תאי culturing ארוך פשוט ההתגלמות הנוכחית, קשר באמצעות Preforms העדין סטרילי, שממדיה להיות קשורים לערך של הצטלקות. צבר השפעה טיפולית כאשר השתיל השעית התא במשך כחודש, לעומת IPC על הלבשת הפצע - לא רגע משמעותי כאשר משך סכומי טיפול לחודשים רבים. זה ידוע כי במהלך השתלת IPC לשרוף חולים, השינוי של מבנה מבנה העור התרחשה בהדרגה במשך כמה שנים. השתלת התרבות keratinocyte על כיסוי הפצע היא השיטה הנוחה ביותר ומבטיחה, עם זאת, היא גם הרבה יותר יקר. בנוסף, הדורש היום את החיפוש אחר ציפויים מתוחכמים יותר, כי חייב להיות פלסטיק, hygroscopic, יש תכונות bacteriostatic או bactricidal ולהיות נייטרלי ביולוגית עבור תאים. הסרט "Polipor" - גרסת ביניים של כיסוי פצע קולנוע המקומי, למרות כמה חסרונות, אפשרה לנו ללמוד חולדות השתלת keratinocyte בניסוי על צלקות ולהסיק מסקנות לגבי המידה האפקטיבית של הצטלקות משיכה בכיוון זה.

המחברים שביצעו את השתלת ה- IPC על פצעים שרופים ציינו כי במהלך השבוע הראשון לאחר השתלת שכבת קרטינוציטים רב שכבתית על פצעים סניטציה, האפידרמיס מעובה ורבד. כל שכבות האפידרמיס היו מוגדרות היטב. זה מעניין כי מספר שכבות תאים השתלות הוא 10-30% יותר מאשר בדגימות ביופסיה העור. המחברים ציינו את הופעתם של גרגירים של keratogialin ביום החמישי לאחר השתלת MPA, הממברנה הבסיסית ואת hemidesmosomes - כבר ביום השלישי.

J.Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); NM קוזנצוב ואח '. (1998) מצא כי בתקופות המוקדמות הבאות חולי BMD להשתלה עם פגמים בעור polnosloynymi לאחר כוויות, תקשורת בין הדרמיס לאפידרמיס היא מאוד חלשה היא קו ישר, שכבת פפילרי נעדר. בסוף החודש השני, מתחילה היווצרותן של פפיליות רדודות ונספחים של העור, הקשר בין הדרמיס והאפידרמיס נעשה עמיד יותר. נתוני הספרות מדברים על השתלת קרטינוציטים allogenic על פצעים של חולים שרופים, כשיטה מבטיחה. למרות העובדה כי דחיית קרטינוציטים אלוגנאית מתרחשת שהוגשה בידי מחברים שונים בתקופה שבין 10 ימים ל 3 חודשים, אולם, יש להם תפקיד הריפוי של משטח הפצע, משחרר גורמי גדילה מכאני סגירת הפגם. הוא האמין כי MPAlK צמצמו פעילות אנטיגני, כמו כאשר בתרבית במבחנה לאבד תאי לנגרהנס המאפשר להם להתקיים במשך זמן רב בגוף של הנמען. בנוסף, לתרבות האלוגנית המתקבלת מעורם של אנשים בריאים צעירים יש פוטנציאל ביולוגי גדול יותר מאשר התרבות האוטולוגית של מטופלים לאחר טראומה.

המטרה העיקרית של המחקר שלנו היתה לברר אם קרטינוציטים allogenic ישרדו על הצלקות ומה יהיו השינויים ברקמה הצלקתית תחת ההשפעה של פעיל כזה ביולוגית "ציפוי הפצע". במקרה של תוצאה חיובית, לחשב את הטכנולוגיה היעילה ביותר ופחות אינטנסיבי עבודה בתחום זה של שיקום רפואה.

הנתונים שהתקבלו על ידינו במובנים רבים התברר להיות דומה לנתוני הספרות על השינויים המורפולוגיים המתרחשים באפידרמיס האנושי לאחר העברתם של קרטינוציטים allogenic כדי לשרוף פצעים. אבל יש הבדלים משמעותיים, הן מבחינת המצע המורפולוגי, המושתל, והן מבחינת הטכנולוגיה. לכן ההיווצרות של אג"ח הממברנה עורי-אפידרמיס הבסיסי (poludesmosom, גבשושיות) מתרחשת במועד מאוחר יותר לעומת העברת קרטינוציטים על משטחי הפצע ללא הצטלקות. זה נראה בגלל תזונה לקויה של רקמות רקמה לעומת dermis או fascia שריר. הצלקת, במיוחד הישנה, היא רקמת חיבור צפופה עם מספר קטן מאוד של כלי שיט, החלק התחתון של הפצע הוא שריפת רקמת גרגר עשירה בכלי הדם. לכן, ברור כי התנאים שבהם השתלה engraftment של קרטינוציטים להתרחש הם שונים לחלוטין. ככל וסקולריזציה יותר את האזור של השתלת תאים, כך קל יותר לעבד אותם. מן הנחה זו יש מסקנה על העדפה לעבודה עם צלקות צעירות, שבו רקמת החיבור עדיין רופף מספיק ועשיר בכלי הדם.

כתוצאה מעבודה ניסויית זו, הוכח כי:

1. השתלת MALK לצלקות אפשרי. 
2. השיטה האופטימלית להשתלה היא השתלת קרטינוציטים על כיסוי הפצע.
3. פני השטח של הצלקת צריך להיות הקרקע באמצעות drermabrasion אופרטיבית באמצעות לייזר של שומן או חותך.
4. תחת השפעת MPALK, אפיתליזציה מהירה של פני הקרקע של הריומן מתרחשת.
5. הצלקת הצלקתית הטובה יותר, כלומר הצלקת הצעירה יותר, כך התוצאות טובות יותר של השתלת קרטינוציטים.
6. רקמת הצלקת בהשפעת הקרטינוציטים המושתלים הופכת בהדרגה והפכה לרקמה צלקתית יותר (עם צלקות של העור).
7. הרפיה הדרגתית של רקמת הצלקת מתחילה בשכבת תת-פני. משפר את כלי הדם שלה, חבילות של סיבי קולגן בחלקים העליונים והתחתונים של הרומן לוקחים מיקום פריך יותר מאשר ברקמת הצלקת ללא השתלת תאים. יש זקיקי שיער בלוטות החלב. האפידרמיס במבנהו, לאחר שעבר את שלב היפרטרופיה, מתקרב לאפידרמיס של עור רגיל.
8. השינויים שנצפו קשורות לגורמי גדילה של קרטינוציטים, ציטוקינים, אשר משפרים את הגזע של הרקמה הצלקתית ומאפשרים את הפיכתם מרקמת סיבים גסה ליותר רופפת, מה שמוביל לשיפור בסוג הצלקת.

לפיכך, בהתבסס על מחקר זה, ניתן להסיק כי ההשפעה החיובית של קרטינוציטים המושתלים על רקמת צלקת, אשר עשוי להיות בעל חשיבות מעשית לשיקום של חולים עם סוגים שונים של צלקות.

עבודה זו על חולדות גם מותר לגבש דרישות. כדי כיסוי הפצע, שבו קרטינוציטים גדלים.

כיסוי הפצע צריך להיות:

• biocompible עם תאים,
• לנשימה,
• יש בסיס אלסטי, בניית מבנה,
• להיות הידרופילי,
• כמו תוספים רפואיים מכילים תרופות אנטיבקטריאלי נוגדי חמצון אינם רעילים לתאים בתרבית.

תוצאות קליניות של טיפול ביוטכנולוגי בצלקות.

מוקדם יותר, נ 'Carver et al. (1993) מצא כי תחבושות occlusive הם הטובים ביותר עבור הצמדת הפצע והישרדות של קרטינוציטים, אך אינם מאפשרים היווצרות של האפידרמיס מרובדת (בוגר). כדי ליצור את האפידרמיס מרובד, הסביבה האוויר נחוץ. לכן, לאחר חיבור שכבה מרובת שכבות, הוצע כיסוי לאחר הפציעה לאחר 7-10 כדי להסיר ולבצע פצעים תחת תחבושות יבשות או משחות מסיסות במים. אנו יכולים לומר כי איכות המאפיינים של "המצע" שבו התאים גדלים חשובים מאוד עבור האפקטיביות של השתלת החומר הסלולרי, וכתוצאה מכך על תוצאות עבודתם של הרופאים. אבל אין פצע אידיאלי מכסה היום, למרות שפע של האפשרויות המוצעות (עור מלאכותי, בדים ארוגים של carboxymethylcellulose, ציפויים פיברין, סרטים פוליאוריטן למחצה sempermeable). לא חשוב ברגע זה את העלות של "מצעים" (ציפויים מיוחדים הפצע), שכן העלות הגבוהה שלהם מגדילה את העלות הכוללת של טיפול ביוטכנולוגי.

האפקטיביות של הטכנולוגיות הסלולריות הוכחה עד כה, אך למרבה הצער, טכנולוגיות אלה הן יקרות מאוד, במיוחד במדינות שבהן הייצור התעשייתי של יצירות הסלולר לא הוקמה. עם זאת, מדינות כמו ארצות הברית הקימו מזה זמן רב תעשייה לייצור חומרים סלולריים להשתלת שריפה. בפרט, החברה Inc טכנולוגיה BioSurface, מאז 1989, גייסה 37,000 שכבות למינציה של קרטינוציטים, אשר שימשו לטיפול 240 חולים ב 79 מדינות ברחבי העולם (R.Odessey, 1992) עם 1 ס"מ ² תרבית תאים עולה בערך 7-8 $ US.

הטכנולוגיה של טיפול במחלות שונות ובעיות עור יש מספר הבדלים, אבל בלב כל טיפול עם תאים הוא ייצור של חומר התא איכות השתלת שלה.

תהליך זה מורכב מהפעולות הבאות:

• בחירת העור מן המושפע (או מתורמים),
• הסעת דשני עור למרכז הביוטכנולוגיה,
• הבידוד של תאי השכבה הבסיסית והכפלה שלהם,
• לבנות של שכבות מרובות שכבות של קרטינוציטים (IPC).
• השתלת תרבויות תאים.

הבעיה העיקרית בטיפול עם השתלת שכבות קרטינוציטים רב שכבתיות היא הצורך בתאים קיימא בכל שלבי השתלת התא. חתיכות העור לבידוד תאים אוטולוגיים או אלוגניים צריך להיות דק ככל האפשר, שכן במקרה זה הם יותר קל להפריד בשיטות מכניות אנזימטיות כדי להשיג ההשעיה של תאים חיים לצמיחה. הם יכולים להיות מושגת על ידי ניתוק dermatome או באמצעות העור של העפעפיים, את העורלה, את המשטח הפנימי של הכתף. בהתחשב בכך התאים רגישים הלוגנים (כלור, יוד), מי חמצן, הם לא יכולים לשמש לטיפול של העור בזמן נטילת החומר.

התשואה הכמותית והאיכותית של התאים משרידי העור ויעילות הטיפוח שלהם תלויים גם במצב הבריאותי ובגילו של התורם. בנוסף, דגימות ביופסיה של העור יש להעביר למעבדה בהקדם האפשרי ובתנאים מתאימים (סביבה, טמפרטורה) נמסר למעבדה מוסמכת ומוכרת.

Eagle בינוני או בינוני 199 עם תוספת של 10% בסרום שור, בינוני DMEM בתוספת 5% בסרום עוברי בסרום ואנטיביוטיקה ניתן להשתמש כדי לאחסן ולהעביר דשי העור.

במעבדה הציטולוגית, הביופסיה העורית מחולקת תחילה באופן מכני לחלקים קטנים, ולאחר מכן עיבוד של שברי עור מתבצע בעזרת אנזימים: טריפסין, קולגן, דיספז וכו '.

תחת הפעולה של אנזימים, הרס על ידי desmosomes מתרחש קרטינוציטים משתחררים לתוך המדיום כמו תאים נפרדים או אגרגטים המורכבת ממספרים שונים של תאים. עבור התרבות, רק keratinocytes הבסיס משמשים אשר גדלים על מדיה מיוחדת באינקובטורים המכילים 5% CO, ב צלחות פטרי או בקבוקונים ב t = 37 ° C. בתוך 48 שעות, היווצרות מושבות keratinocyte הוא ציין, אשר בהדרגה מתכנסים monolayer. לאחר קבלת מספר מספיק של תאים, ההשעיה וכתוצאה מכך הוא התפשט על מכסה הפצע מוכן למטרה זו והניח בצלחת פטרי. מן ההשעיה, תחילה monolayer ולאחר מכן שכבת multilayered של קרטינוציטים נוצרים. באופן סכמטי, השלבים של תהליך גידול קרטינוציטים מוצגים באיור. (33.43.54.65).

היווצרות של מבנה קרטינוציט multilayer מתאים להשתלה בדרך כלל לוקח 7-10 ימים. לפעמים תקופה זו ארוכה יותר, אשר תלויה באיכות חומר המקור (גיל, בריאות התורם, נכונות החומר, איכות המדיה המשמשת וכו '). אם שכבת multilayered overgrows, אז על פני השטח שלה יש תאים עם אפופטוזיס תופעות שאינן מתאימות להשתלה. מנות פטרי, עם גדל בהם על כיסוי הפצע על ידי שכבות multilayered של קרטינוציטים (IPC), מועברים למרפאה במיכלים מיוחדים בטמפרטורה לא נמוך מ + 15 ° C.

השיטה של גרין שונה לגידול IPC

בעבודתנו כציפוי של פצע, השתמשנו בקומבריקות רב שכבתית, שנטשנו את סרטי הפוליפור שבהם התחלנו לעבוד בניסוי עם עכברושים. לכן, שכבות קרטינוציטים רב שכבתיות גדלו על ידינו על prefat ו batiste סטרילית, למרות שזה גם לא כיסוי פצע אופטימלי.

מחקרים קליניים נערכו על מתנדבים עם שמירה על הנורמות האתיות הנדרשות: חתימה על הסכם והסכמה מדעת.

1. התרבות של עצמו (autologous) ו נלקח מתוך תאי הבנק (allogenic) keratinocytes יושמה.
2. קרטינוציטים משלו נלקחו מחתיכת עור שנחתכה מתוך הכתף של המטופלים.
3. מבצע של dermabrasion של scars בוצע בעזרת thermocoupling, דיסקים סיבובית ו erbium לייזר.
4. קבוצות של חולים עם צלקות נורמוטרופיות, היפוטרופיות ו היפרטרופיות נלקחו.

התהליך הטכנולוגי ליישום טכנולוגיה סלולרית לשיפור סוג צלקות העור כלל את השלבים הבאים:

1. בחירת המטופלים.
2. להסביר את מהות הטיפול, את העיתוי של קבלת התוצאות הצפויות, חתימה על הסכם והסכמה מדעת.
3. מינוי של חולים 2-3 שבועות לפני הניתוח selmevit עבור 1t. 3 פעמים ביום, zinkteral על 1t. 3 פעמים ביום.
4. נטילת פיסת עור 2.0 ס"מ ו 0.7-1.0 ס"מ רוחב מן פני השטח הפנימי של הכתף, גבוה, כמעט בחלק התחתון של האזור השחי, כדי לקבל keratinocytes autologous.
5. במקרה של חולים שסירבו לבודד את הקרטינוציטים שלהם בשל האפשרות לקבל צלקת ליניארית על פני השטח הפנימיים של הכתף, החומר הסלולרי נלקח מבנק תא (קרטינוציטים allogenic).
6. Keratinocytes היו מבודדים וגדלו בתנאים של מעבדה מוסמכת עבור סוג זה של עבודה.
7. לאחר שקיבלו IPC מספיק להשתלה, ניתח יום ניתוח לצלקות במרפאה, שם הובא חומר במיכלים מיוחדים במנות פטרי.
8. הניתוח של dermabrasion של רומן, ההמוסטזיס בוצע, משטח הקרקע נשטף עם תמיסת מלח סטרילית, מיובש, לאחר IPC היה מושתלים על batiste סטרילי "תאים למטה". כלומר, התאים שהיו העליון MIC היו נמוכים יותר, סמוך משטח מלוטש.
9. סרט סטרילי היה על גבי העליון, אשר היה קבוע על העור עם תחבושת אלסטית או Omnifix גומי גמיש סיוע. במקום הסרט, ציפויים פצע אדיש המכיל סיליקון, למשל Mepitel, Mepiform, צלחות סיליקון ג'ל, ניתן להשתמש גם.

לאחר 5-7 ימים, הסרט או ציפוי סיליקון מוסר. בשלב זה, כל keratinocytes יש לזחול על צלקת מלוטשת לצרף את פני השטח שלה.

10. הסביבה הרטובה שנוצרה תחת הסרט ציפוי סיליקון פעיל תורם לכך. המטביל שנותר על הצלקת מנקודה זו יכול להיות ספוג עם קריש או ג'ל chitosan. כתוצאה מכך, ביום השני, נוצר קרום צפוף, אשר לנוחות המטופל, עדיף לתקן עם טיח אלסטי, חדיר אוויר, למשל Omnifix. קרום נשימה מאפשר אפידרמיס החדש שנוצר כדי להבדיל ולהפוך אחד בוגרת.

בהתאם לסוג הצלקת ואת עומק השחיקה, ההלבשה נדחית לאחר 8-10 ימים. האפידרמיס כרגע יש 30-40% יותר שכבות הסלולר מאשר בעור רגיל. הממברנה הבסיסית אינה נוצרת. קרטינוציטים של האפידרמיס העבה משחררים כמות של מולקולות פעילות ביולוגית לתוך הרקמה הצלקתית.

ההצלחה של טיפול ביוטכנולוגי בצלקות תלויה במידה רבה בדרך הטיפול בהם בתקופה שלאחר הניתוח. תרבויות תאים הן סוג "רך" של כיסוי פצע ובתקופות המוקדמות לאחר ההשתלה, ה- BMD יכול בקלות להיות מנותק מן הרקמה הבסיסית. לכן, המטופלים מומלץ לטפל בצלקת לאחר הניתוח. במשך 8-9 חודשים, לא לשפשף בקלות לעבוד עם מים מבושלים קרים כדי למנוע קרע את האפידרמיס דק, שנוצר לאחרונה כי אין אחיזה הדוקה עם הרקמות הבסיסית.

הערה:

לפני הניתוח ובמהלך השימוש שיוף עור של הלו-אוקסידנטים וחומרים משמרים (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, כלורהקסידין, מי חמצן) מותר לפני השתלה kletok- לחלוטין התווית בשל השפעות ציטוטוקסיות שלהם. רעילים לתאים הם גם מתילן כחול. ירוק מבריק.

כדי למנוע זיהום, במיוחד כאשר עובדים עם צלקות hypertrophic, אפשר לטפל בתחום ההפעלה עם neomycin סולפט, polymyxin או גנטמיצין. הם אינם מפעילים אפקט ציטוטוקסי על קרטינוציטים.

כתוצאה מטיפול זה, מושגת השפעה משולשת.

1. יישור פני השטח של הכרומן.
2. יצירת שכבה מעל זה של האפידרמיס החדש, עובי רגיל.
3. המרה של רקמה צלקתית dermopodobnuyu ידי פעולה של ציטוקינים, גורמי גדילה ומולקולות ביו אחרים המופרשים מתאי המושתלים לבין קרטינוציטים מגורה על ידם, פיברובלסטים ו מקרופאגים.

הצלקת הופכת פחות בולט, אלסטי יותר, הנקבוביות מופיעות בו, שיער נפוח, פיגמנטציה ניתן לשחזר בשל נוכחות של melanocytes ב MPC.

עם זאת, כל אלה רגעים חיוביים cicatrix לא באים מיד. בהקשר זה, יש צורך להזהיר חולים. כי תהליך השינוי של רקמת הצלקת לתוך הדרמיס הוא איטי ואת התוצאה האופטימלית של טיפול כזה ניתן לצפות לא לפני 10-14 חודשים. מיד לאחר ההלבשה נדחית, משטחים מלוטשים יש בולט בולט, בהיר יותר את תהליך השחזה. הנזק לפחות לעור מתרחשת כאשר טחינה צלקות normotrophic עם לייזר ארביום. צבע הצלקות והעור שמסביב שוחזר בתקופה שבין 3 ל -8 שבועות. למרות אמצעי זהירות אלה, לפעמים יש היפרפיגמנטציה לאחר הניתוח, אשר יכול להמשיך באופן עצמאי במשך כמה חודשים.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]