עבודה ניסיונית על השתלת קרטינוציטים אלוגניים על צלקות שנוצרו באופן מלאכותי של חולדות לבנות

הרצון לנצל את הפוטנציאל התאי והצורך למצוא שיטות חדשות ויעילות לשיפור המראה האסתטי של צלקות הובילו לרעיון לנסות לחקור את האפשרות של השתלת קרטינוציטים על משטחי צלקת.

על מנת להוכיח את הסבירות לשימוש בתרבית קרטינוציטים לשיפור מראה הצלקות, נערך מחקר ניסיוני על חולדות מעבדה לבנות, עבורן נוצרו משטחי צלקת. מודל צלקת החולדה הושג כתוצאה מריפוי פצעים שנגרמו באופן מלאכותי בגב, לאורך עמוד השדרה. לחולדות נחתכו חתיכות עור זהות, בגודל 2x3 ס"מ. 2.5 חודשים לאחר פעולת "מידול הצלקת", החולדות עברו דרמבריזיה (הסרת השכבות העליונות של הצלקת באמצעות חומר תרמוקאוסטי) וקרטינוציטים אלוגניים הושתלו, שבודדו מעור גורי חולדות 2-4 ימים לאחר הלידה.

בידוד וטיפוח תאי אפידרמיס של חולדות בוצעו במעבדה לטכנולוגיות תאים של המכון לציטולוגיה של האקדמיה הרוסית למדעים באמצעות הטכנולוגיה הבאה.

העור נשטף בתמיסת מלח של Hank המכילה 200 יחידות/מ"ל גנטמיצין ונחתך לחתיכות קטנות, בשטח של 0.2-0.5 סמ"ר ^. חתיכות העור הודגרו בתמיסת דיספאז 0.5% בתמיסה מאוזנת של מלח פוספט בופר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הועברו החתיכות לתמיסת מלח פוספט בופר של Dulbecco והאפידרמיס הופרד מהדרמיס. האפידרמיס הודגרו בתמיסת טריפסין 0.125% למשך 10-15 דקות תוך ערבוב במהירות של 50 סל"ד, ולאחר מכן פעולת האנזים הופסקה על ידי הוספת 5% סרום בקר עוברי. שליש מתרחיף התאים שנוצר שימש בצורתו הטהורה לאחת האפשרויות להשתלה על צלקות, השליש השני גודל על ציפויי סרט ביתיים ביו-תואמים "Polypor", והשלישי - על צלחות פטרי ללא מצע. ניתוח הדרמבריזציה של הצלקות שנוצרו בחולדות ולאחר מכן השתלת תאי אפידרמיס של חולדות עליהן בוצע תחת הרדמה אתרית באמצעות צריבה תרמית.

בקבוצה הראשונה של חולדות, לאחר דרמבריזיה, הונחו חתיכות קמבריק סטריליות על פני הצלקת המלוטשים, נשטפו בתמיסה פיזיולוגית ויובשו, ועליהן הונחה תרחיף מזועזע של אפידרמוציטים אלוגניים של חולדות בריכוז של 1.5 מיליון תאים לכל 1 מ"ל (על פי מכון הציטולוגיה). חתיכות הקמבריק הונחו על הצלקת המלוטשת כך שהתאים שכבו על פני הצלקת. מעל הונחה תחבושת של כמה שכבות של גזה, אשר נתפרה לשולי הצלקת.

חלק מתרחיף התאים שהתקבלה נזרע בצלחות פטרי על גבי סרטי פוליפור סטריליים שנחתכו לצורת הצלחות, והחלק השני - על גבי צלחות פטרי ללא סרט. הגידול בוצע במדיום FAD, המורכב מתערובת של מדיום DMEM ותמיסת F12 ביחס של 3:1, עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין (Sigma), 0.5 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון המיסוקסינט (Sigma), 10 מיקרוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי EGF (מכון לציטולוגיה RAS, סנט פטרסבורג). הקבוצות השנייה והשלישית של חולדות, 7 פרטים כל אחת, נותחו 6 ימים לאחר הראשונה. בשלב זה, שכבות רב-שכבתיות נוצרו מתרחיף הקרטינוציטים שנזרעו בצלחות פטרי, אשר הושתלו בחולדות. הקבוצה השנייה הושתלה אפידרמוציטים על סרט, והשלישית - שכבה רב-שכבתית ללא מצע. לאחר 7 ימים, השכבות הרב-שכבתיות של קרטינוציטים אלוגניים (MPALK) שהתקבלו, שנזרעו על סרטי "פוליפור", הושתלו כתרבית ישירות על פני הפצע. מעל, הסרט, כדי למנוע את קריעתו, חובר בתחבושת גזה רב-שכבתית ותפור לעור החולדות.

לפני השתלת קרטינוציטים לקבוצה השלישית של חולדות שגודלו ללא מצע, ה-PAC הופרד מתחתית צלחת הפטרי על ידי טיפול בו עם דיספאז, בעל יכולת לשבש באופן סלקטיבי קשרים עוריים-אפידרמליים. כאשר הוא פועל על שכבה רב-שכבתית, דיספאז משבש את החיבור של תאי השכבה הבסיסית עם תחתית צלחת הפטרי ויש לו השפעה פחותה בהרבה על הקשרים הבין-תאיים, מה שמאפשר "להסיר" את השכבה לחלוטין. ניתוק שכבת התאים הרב-שכבתית באמצעות דיספאז בוצע באופן הבא. מצע ההובלה רוקן מצלחות הפטרי, שכבות התאים נשטפו שלוש פעמים עם מצע מזין המכיל אנטיביוטיקה, בפרט גנטמיצין (0.2 מ"ג/מ"ל). השכבות הרב-שכבתיות מולאו בתמיסת דיספאז 0.125% ("סיגמא") והוכנסו לתרמוסטט, שם הן הודגרו ב-t=37°C למשך 20-30 דקות. הופעת שפה לבנה המתקלפת לאורך היקף השכבה מעידה על תחילת תהליך ההפרדה שלה מקצוות צלחת הפטרי ומתחתיתה. מספר דקות לאחר תחילת תהליך ההפרדה, תמיסת הדיספאז רוקנה, שכבות האפיתל נשטפו 2-3 פעמים עם המדיום. חתיכת תחבושת פצעים סטרילית "Lita-color" חתוכה לגודל הכוס הונחה על פני השטח של שכבת האפידרמיס, שאליה הודבקה השכבה שהופרדה על ידי הדיספאז, שקילפה בנוסף מתחתית הכוס בעזרת מרית. בעזרת פינצטה לעיניים, השכבה יחד עם ציפוי המפית "Lita-color" (רוסיה) נקרעה מתחתית צלחת הפטרי והועברה בזהירות למשטח הצלקת המוכן. המפיות "Lita-color" מכילות גנטמיצין ואקסולין (תמצית קולגן), אשר, כאשר הרטיבו אותן עם שאריות מצע הגידול ולאחר מכן עם תמיסה פיזיולוגית, התנפחו והפכו לחבישת פצעים מודרנית, המספקת הגנה טובה מפני זיהום חיצוני וריפוי מהיר הודות למבנה סופג הלחות.

תחבושות גזה רב שכבתיות הונחו על סרטי הפוליפור ומפיות בצבע ליטה ונתפרו לעור החולדות לקיבוע חזק יותר. כל חולדה הוצבה בכלוב נפרד כדי ליצור תנאים אופטימליים לתחזוקה ולהשתלת הקרטינוציטים המושתלים. תחבושות החולדות אליהן הושתלו התרחיף ושכבת האפידרמוציטים הרב-שכבתית שהוסרה על ידי דיספאזה הורטבו במי מלח סטרילית מספר פעמים ביום כדי ליצור את התנאים הנוחים ביותר להשתלת התאים. בהתחשב בכך שסרט הפוליפור היה אטום למים, תחבושות החולדות בקבוצה השנייה לא הורטבו, וזו הייתה אחת היתרונות על פני השתלות ללא סרטים. התחבושות הוסרו לאחר 10 ימים. התמונה הקלינית של צלקות לאחר השתלת תאים הייתה שונה במעט מצלקות ללא השתלה, למעט צבען הוורוד יותר (עקב דרמבריזיה) וקילוף מוגבר. עובדה זו מצביעה על כך שמיד לאחר שחבישות הפצע נשרו עם ה-MPC, לא חלו שינויים בצלקת.

לקיחת חומר ביופסיה מחולדות.

לאחר חודש, חודשיים, חמישה ו-9 חודשים לאחר השתלת קרטינוציטים אלוגניים של חולדות על צלקות מלוטשות של חולדות לבנות, נלקח חומר לבדיקה היסטולוגית, ציטומורפולוגית ומיקרוסקופית אלקטרונים. דגימות של עור חולדה תקין וצלקת ללא השתלת תאים נלקחו כביקורת. הרדמה של חולדות בוצעה באמצעות הרדמה אתרית.

לאחר ההרדמה, נלקחו פיסות רקמת צלקת מהאזורים המסומנים שאליהם הושתלו קרטינוציטים באמצעות מנקב ביופסיה בקוטר 2 מ"מ והוכנסו לתמיסת גלוטראלדהיד 2.5% כדי להכין את החומר לבדיקה במיקרוסקופ אלקטרונים. פיסות רקמה שנלקחו לבדיקה היסטולוגית הוכנסו לתמיסת פורמלין ניטרלית 10%, לאחר מכן הועברו דרך אלכוהולים והוטמעו בפרפין, ולאחר מכן נחתכו חתכים דקים במיוחד וצפו בהם במיקרוסקופ אופטי לאור.

בקרה I. עור חולדה רגיל.

על מנת לראות את ההבדל בין התמונה המיקרוסקופית של עור חולדה רגיל שעבר שינוי צלקת לבין צלקות בזמנים מסוימים לאחר השתלת MPC, מוצגים תמונות ותיאורים שלהן בכל שלבי המחקר.

האפידרמיס של עור רגיל מורכב מ-7-9 שכבות של תאים. שכבת הקרנית (stratum corneum) בעובי בינוני. במקומות מסוימים היא מורכבת מ-6-8 שכבות של קשקשים קרניים. השכבה הבסיסית מיוצגת על ידי תאים גליליים עם גרעינים גדולים, בהירים וצורתיים רגילה וכמה נוקלאולים. קשרים דסמוזומליים בין התאים ועם קרום הבסיס באים לידי ביטוי בבירור. מתחת לקרום הבסיסי המוגדר היטב, בעל גידולים קטנים בשכבה התת-אפידרמלית, במקביל אליו נמצאים צרורות עדינים של סיבי קולגן ואלסטין, ביניהם פיברובלסטים מוארכים, כלי דם קטנים. בשכבות העמוקות יותר, נמצאים צרורות של סיבי קולגן ואלסטין בכיוונים שונים. ביניהם נמצאים כלי דם רבים בעלי דפנות דקות באותו קליבר, אלמנטים תאיים (פיברובלסטים, תאי מאסט, לויקוציטים). מספר רב של זקיקי שיער, בלוטות חלב.

בקרה 2. צלקת חולדה, בת חודשיים.

תמונה קלינית. הצלקות ורודות בהירות, מתקלפות, קרום נשאר במקומות מסוימים. שטחן קטן עקב התכווצות סיבי הקולגן והפך לכ-3.0-3.5 ס"מ ^. חסרות תוספות עור.

תמונה מיקרוסקופית. האפידרמיס מורכב מ-3-5 שכבות של תאים מקופלים, המיוצגים על ידי תאי בסיס מעוגלים, שורה אחת של תאים תת-שכבתיים, 1-2 שורות של תאים גרגיריים עם גרגירי קרטוהיאלין בשכבה העליונה, ישנם אזורים של בצקת תוך-תאית. שכבת הקרנית משתנה באופן לא אחיד מדקה מאוד לעבה. קיפול צלקת ניכר עקב (התכווצות) רקמת צלקת. הקפלים חודרים לשכבת הפפילריה ויוצרים את הרושם של פפיליות. הגבול בין האפידרמיס לדרמיס הוא קו ישר. קרום הבסיס אינו נצפה בכל מקום. בחלק התחתון של התת-אפידרמיס ובשכבות העמוקות יותר ישנם כלי דם עם דופן עבה ורפויה, רבים מהם נטושים, עם קיפאון. סביב כלי הדם יש הצטברות של מקרופאגים, פיברובלסטים. מקרופאגים מקיפים את האדומים הציטים המשתחררים מהנימים ומבצעים פגוציטוזה שלהם. בשכבות השטחיות יותר ישנם נימים קטנים. מתחת לאפידרמיס, סיבי קולגן ממוקמים באופן רופף. בשכבה העמוקה יותר של הצלקת ישנן צרורות גסות של סיבי קולגן, ביניהם פיברובלסטים רבים.

צלקת חולדה חודש לאחר השתלת קרטינוציטים של חולדה.

תמונה קלינית. הצלקות ורודות, שטחן קטן, במיוחד בקוטר, והוא בממוצע 2.5-3 ס"מ ^רבוע. שיער ובלוטות חלב נעדרות.

נתוני הבדיקה המיקרוסקופית של החומר שהתקבל מחולדות עם השתלת MPaLK על סרט ו-MPaLK ללא מצע זהים כמעט לחלוטין. עם זאת, מבחינה טכנית גרידא, עבודה עם MPaLK ללא מצע היא הרבה יותר מסובכת ומייגעת מאשר בעת גידול MPaLK על מצע, לכן, במחקר נוסף של נושא השתלת קרטינוציטים לצלקות, השתמשנו בקמבריק רב שכבתי כבסיס לגידול ("מצעים").

תמונה מיקרוסקופית. נצפית עיבוי של האפידרמיס ל-15-20 שכבות, כמעט עד אמצען לקרטינוציטים יש צורה צרה, מוארכת, אנכית וסידור קומפקטי. תאי הבסיס ממוקמים בקו לא אחיד. הגרעינים שלהם בהירים, גדולים, מעוגלים עם נוקלאולי אחד או שניים, דבר המצביע על פעילותם הסינתטית והפרוליפרטיבית הגבוהה. הגבול בין האפידרמיס לדרמיס הוא קו ישר. השכבה הקוצנית מפותחת היטב, מורכבת מ-3-5 שכבות של תאים מעוגלים, ישנם 2 תאים גרעיניים.

מיד מתחת לקרום הבסיסי ישנן צרורות דקות של סיבי קולגן הממוקמים בצפיפות, במקביל אליהן יש מספר רב של כלי דם נטושים, סיבי קולגן עמוקים יותר גסים יותר, שנאספו בצרורות צפופים. פיברובלסטים גדולים רבים, תאי מאסט (2-3 בשדה הראייה), מקרופאגים, לויקוציטים וכלי דם נטושים, שקירותיהם משוחררים, סביבם יש סיבי קולגן הממוקמים באופן רופף. בחלק מהכלי הדם יש סטאזיס, דיאפדסיס של אלמנטים נוצרים. סביב הכלים יש פיברובלסטים, לימפוציטים בודדים. נספחים עוריים נעדרים.

בעת השתלת תרחיף קרטינוציטים על צלקת מלוטשת, התמונה המיקרוסקופית שונה מהקודמת. ברוב בעלי החיים, האפידרמיס דק ומורכב מ-5-6 שכבות של תאים. השכבה התחתונה מורכבת מתאים בעלי צורה לא סדירה ומצולעת עם גרעינים בעלי צורה עגולה-לא סדירה. מצב השכבה התת-אפידרמלית דומה למצבה בקבוצת בעלי חיים ללא השתלת MPALK.

במקרה זה, ניתן לדבר על עיכוב בתהליכים הנלווים להשתלת תאים, או על אובדן גדול של תאים המושתלים בצורת תרחיף. לפיכך, הוסקה מסקנה לגבי חוסר היעילות של תיקון צלקות על ידי השתלת קרטינוציטים בצורת תרחיף.

צלקת חולדה חודשיים לאחר השתלת קרטינוציטים של חולדה.

תמונה קלינית. הצלקת נראית דקה ועדינה. במקומות מסוימים נצפים כתמים מתקלפים וקשקשים.

תמונה מיקרוסקופית. שכבת הקרנית מעובה, במקומות מסוימים - היפרקרטוזיס. האפידרמיס מעובה, מורכב מ-12-20 שורות של תאים. הגבול בין האפידרמיס לדרמיס הוא קו ישר. סיבי קולגן עדינים מתחת לאפידרמיס נמצאים בצפיפות רבה. בשכבות העמוקות יותר של הצלקת, הם נאספים בצרורות גסות גדולות. בשכבה התת-אפידרמלית, מופיעה היווצרות כלי דם חדשים. בשכבות התחתונות של רקמת הצלקת, ישנם כלי דם נטושים רבים הממוקמים במקביל לפני השטח של האפידרמיס. פיברובלסטים גדולים מפוזרים באופן שווה בעובי הצלקת, ישנם מקרופאגים ענקיים, מרובי ענפים, רבים.

צלקת חולדה 5 חודשים לאחר השתלת תאי אפידרמיס של חולדה.

תמונה קלינית. הצלקת נראית אחידה, חלקה ללא קילוף, ישנן שערות בודדות, צפיפותן גדולה יותר בשולי הצלקות, דבר המצביע על צמיחה שולי של זקיקי שיער לתוך הצלקת והיווצרות זקיקי שיער חדשים. שטח הצלקות ממשיך לקטון.

תמונה מיקרוסקופית. האפידרמיס עדיין עבה (15-20 שכבות, במקומות מסוימים עד 30) בשכבות העליונות הוא מלא בגרגירי קרטוהיאלין. קרום הבסיס נראה בבירור. מתחתיו, סיבי קולגן נמצאים באופן רופף. בשכבות התחתונות, הקולגן חזק יותר ודחוס היטב. ישנם נימים רבים בין צרורות הקולגן. בשכבות העליונות, מספר כלי הדם הנטושים ירד. הצומת בין האפידרמיס לדרמיס מעט גלי. במקומות מסוימים, ישנן גידולים אפידרמליים עמוקים ברקמת הצלקת. כלי דם חדשים שנוצרו נראים בין סיבי הקולגן. זקיקי שיער בודדים ובלוטות חלב מופיעים.

צלקת חולדה 9 חודשים לאחר השתלת תאי MPA אפידרמליים של חולדה.

תמונה קלינית. הצלקות קטנות משמעותית בהשוואה לתקופות קודמות, שטחן הממוצע הוא כ-1.5-2.0 סמ"ר ^. הצלקות מכוסות באופן לא אחיד בשיער דק, במיוחד בשוליים. נותרו קילופים קלים של לוחיות דקות.

תמונה מיקרוסקופית.

האפידרמיס הפך דק יותר, מיוצג על ידי 6-8 שורות של תאים, דומה במבנה לאפידרמיס של עור חולדה רגיל, רק שצפיפות התאים גבוהה ב-1 מ"מ והם קטנים יותר. השכבה הבסיסית מורכבת מתאים עגולים-גליליים קטנים. קרום הבסיס בא לידי ביטוי טוב, המידסמוזומים נראים בבירור. נוכחות של צמיחות אפידרמליות בשכבה התת-אפידרמלית ניכרת. השכבה הפפילרית באה לידי ביטוי לכל אורך הצלקת. עובדות אלו מצביעות על כך שבשלב זה ההידבקות של הקרטינוציטים המושתלים התחזקה בהרבה עם רקמות הצלקת הבסיסיות. לכן, טיפול בצלקות אצל אנשים שעברו השתלת MPALK 9 חודשים לאחר השתלת MPC יכול להיות מסורתי. מתחת לאפידרמיס, סיבי קולגן עדינים יותר מאשר בשכבות העמוקות. כלי דם רבים הופיעו, במיוחד כלי דם שטחיים. דפנות כלי הדם הגדולים יותר מעובה. זקיקי שיער ובלוטות חלב נמצאים בכמויות גדולות. התמונה המיקרוסקופית דומה לרקמה דמוית עור.

תוצאות עבודה ניסויית ודיון בהן.

במהלך עבודה זו, הושתלו קרטינוציטים בצורות שונות על צלקות עור מלאכותיות של חולדות לאחר ניתוח דרמבריזיה - על כיסויי פצעים, כתרחיף על גבי קמבריק, וכשכבה רב שכבתית ללא מצע. העבודה בוצעה במטרה להשיג נתונים מורפולוגיים על השפעת קרטינוציטים אלוגניים מושתלים על צלקות, וכן לקבוע אפשרויות השתלה אופטימליות.

נמצא כי שלוש שיטות ההשתלה אפשריות, אך השתלת ה-MPAC ללא מצע היא הליך עתיר עבודה, שבמהלכו ה-MPAC עלול להיפגע, דבר המשפיע על תוצאות ההשתלה. יתר על כן, שיטת השתלה זו אינה דורשת עבודה על משטחים גדולים.

השתלת תרחיף קרטינוציטים היא שיטה חסכונית הרבה יותר, אינה דורשת גידול תאים ארוך טווח והיא פשוטה בגרסה שאנו מציעים באמצעות תרחיף קמבריק סטרילי, שגודלו תואם לגודל הצלקות. העיכוב באפקט הטיפולי בעת השתלת תרחיף תאים בכחודש בהשוואה ל-MPC על ציפוי פצע אינו נקודה משמעותית עם משך טיפול של חודשים רבים. ידוע שכאשר מושתלים MPC לחולי כוויות, השינוי במבנה העור מתרחש בהדרגה ולאורך מספר שנים. השתלת תרבית קרטינוציטים על ציפויי פצע היא השיטה הנוחה והמבטיחה ביותר, אך גם יקרה משמעותית יותר. בנוסף, כיום נדרש חיפוש אחר אפשרויות ציפוי מתקדמות יותר שיהיו גמישות, היגרוסקופיות, בעלות תכונות בקטריוסטטיות או חיידקיות וניטרליות ביולוגית לתאים. הסרט "פוליפור" - גרסת ביניים של כיסוי הפצעים בסרט הביתי, למרות כמה פגמים, אפשר לנו לחקור בניסוי השתלת קרטינוציטים של חולדות על צלקות ולהסיק מסקנות לגבי יעילות כיוון טיפול זה בצלקות.

המחברים שהשתילו תאי MPC על פצעי כוויות ציינו כי במהלך השבוע הראשון לאחר השתלת שכבה רב-שכבתית של קרטינוציטים על פצעים מחוטאים, האפידרמיס התעבה והתחלק. כל שכבות האפידרמיס נראו בבירור. מעניין לציין שמספר שכבות התאים בהשתלות היה גדול ב-10-30% מאשר בביופסיות עור. המחברים ציינו את הופעת גרגירי הקרטוהיאלין ביום החמישי לאחר השתלת MPC, ואת הממברנה הבסיסית וההמידסמוזומים - כבר ביום השלישי.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) מצאו שבשלבים המוקדמים לאחר השתלת MPC לחולים עם פגמי עור בעובי מלא לאחר כוויות, הקשר בין הדרמיס לאפידרמיס חלש מאוד והוא קו ישר, השכבה הפפילרית נעדרת. עד סוף החודש השני, מתחילות להיווצר פפיליות רדודות וגושי עור, הקשר בין הדרמיס לאפידרמיס מתחזק. נתוני הספרות מצביעים על כך שהשתלת קרטינוציטים אלוגניים לפצעים בחולי כוויות היא שיטה מבטיחה. למרות העובדה שדחיית קרטינוציטים אלוגניים מתרחשת, על פי מחברים שונים, תוך 10 ימים עד 3 חודשים, הם בכל זאת ממלאים את תפקידם בריפוי פני הפצע, בהפרשת גורמי גדילה ובסגירה מכנית של הפגם. ההערכה היא של-MPALC יש פעילות אנטיגנית מופחתת, מכיוון שבמהלך גידול חוץ גופי הם מאבדים תאי לנגרהנס, מה שמאפשר להם להתקיים בגוף המקבל במשך זמן רב. בנוסף, לתרבית אלוגנית המתקבלת מעורם של אנשים צעירים ובריאים יש פוטנציאל ביולוגי גדול לאין שיעור מתרבית אוטולוגית של חולים לאחר פציעה.

המטרה העיקרית של המחקר שלנו הייתה לברר האם קרטינוציטים אלוגניים ישרשו על צלקות ואילו שינויים יתרחשו ברקמת הצלקת תחת השפעת "ציפוי פצע" פעיל ביולוגית שכזה. במקרה של תוצאה חיובית, לפתח את הטכנולוגיה היעילה ביותר והפחות עתירת עבודה עבור תחום זה של רפואת השיקום.

הנתונים שקיבלנו היו דומים במובנים רבים לנתוני הספרות על שינויים מורפולוגיים המתרחשים באפידרמיס האנושי לאחר השתלת קרטינוציטים אלוגניים לפצעי כוויות. עם זאת, ישנם גם הבדלים משמעותיים, הן מבחינת המצע המורפולוגי עליו מתרחשת ההשתלה והן מבחינת הטכנולוגיה. לפיכך, תהליך היווצרות קרום הבסיס והקשרים העור-אפידרמליים (המידסמוזומים, פפילות) מתרחש בשלב מאוחר יותר בהשוואה להשתלת קרטינוציטים למשטחי פצע ללא שינויים צלקתיים. ככל הנראה, זה קורה עקב תזונה דלה יותר של רקמת הצלקת בהשוואה לדרמיס או לפאשיה השרירית. צלקת, במיוחד ישנה, היא רקמת חיבור צפופה עם מספר קטן מאוד של כלי דם, בעוד שתחתית פצע הכוויה היא רקמת גרנולציה עשירה בכלי דם. לפיכך, ברור שהתנאים שבהם מתרחשות השתלת והשתלת קרטינוציטים שונים לחלוטין. ככל שאזור השתלת התאים מפושט יותר בכלי דם, כך תהליך ההשתלה שלהם קל יותר. מפוסטולאט זה נובעת המסקנה בדבר העדפת עבודה עם צלקות צעירות, בהן רקמת החיבור עדיין רופפת למדי ועשירה בכלי דם.

כתוצאה מעבודה ניסויית זו הוכח כי:

1. השתלת MPALK לצלקות אפשרית.
2. שיטת ההשתלה האופטימלית היא השתלת קרטינוציטים על גבי כיסוי הפצע.
3. יש ללטש את משטח הצלקת באמצעות דרמבריזיה כירורגית בלייזר או חותך שומאן.
4. תחת השפעת MPALK, מתרחשת אפיתליזציה מהירה של המשטח המלוטש של הצלקת.
5. ככל שרקמת הצלקת מסודרת טוב יותר בכלי הדם, כלומר, ככל שהצלקת צעירה יותר, כך תוצאות השתלת קרטינוציטים טובות יותר.
6. תחת השפעת הקרטינוציטים המושתלים, רקמת הצלקת משתנה בהדרגה והופכת לרקמה דמוית עור (רקמת צלקת רופפת יותר עם תוספות עור).
7. התרופפות הדרגתית של רקמת הצלקת, החל מהשכבה התת-אפידרמלית. כלי הדם שלה משתפרים, צרורות סיבי קולגן בחלקים העליונים והתחתונים של הצלקת מקבלים סידור רופף יותר מאשר ברקמת צלקת ללא השתלת תאים. מופיעים זקיקי שיער ובלוטות חלב. האפידרמיס, במבנה שלו, לאחר שעבר את שלב ההיפרטרופיה, מתקרב לאפידרמיס של עור רגיל.
8. השינויים שנצפו קשורים לגורמי גדילה וציטוקינים המופרשים על ידי קרטינוציטים, אשר, על ידי שיפור הטרופיזם של רקמת הצלקת, מקדמים את הפיכתה מרקמה סיבית גסה לרקמה רופפת יותר, מה שמוביל לשיפור במראה הצלקת.

לפיכך, בהתבסס על מחקר זה, ניתן להסיק כי לקרטינוציטים המושתלים יש השפעה מיטיבה על רקמת הצלקת, דבר שעשוי להיות בעל השלכות מעשיות על שיקום חולים עם צלקות מסוגים שונים.

עבודה זו על חולדות גם אפשרה לנו לגבש את הדרישות לכיסוי פצעים עליהם גדלים קרטינוציטים.

תחבושות לפצעים צריכות להיות:

• ביולוגית תואמת לתאים,
• נושם,
• בעלי בסיס אלסטי ויוצר צורה,
• להיות הידרופילי,
• מכיוון שתוספים רפואיים מכילים תרופות אנטיבקטריאליות ונוגדי חמצון שאינם רעילים לתאים בתרבית.

תוצאות קליניות של טיפול ביוטכנולוגי בצלקות.

בעבר, נ. קארבר ואחרים (1993) מצאו כי חבישות סותמות מקדמות בצורה הטובה ביותר את ההיצמדות לפצע ואת הישרדותם של קרטינוציטים, אך אינן מאפשרות היווצרות של אפידרמיס שכבתי (בוגר). סביבה אווירית נחוצה להיווצרות אפידרמיס שכבתי. לכן, לאחר הצמדת שכבה רב-שכבתית, הוצע להסיר את חבישת הפצע הסותמת לאחר 7-10 ימים ולטפל בפצעים תחת חבישות יבשות או משחות מסיסות במים. ניתן לומר כי איכות ותכונות ה"מצע" עליו גדלים התאים הן נקודה חשובה מאוד ליעילות השתלת חומר תאי, ולכן לתוצאות עבודת הרופאים. אך כיום אין חבישת פצע אידיאלית, למרות שפע האפשרויות המוצעות (עור מלאכותי, בד לא ארוג עשוי קרבוקסימתיל תאית, ציפויי פיברין, סרטי פוליאוריטן חצי חדירים). נקודה חשובה בעניין זה היא עלות ה"מצעים" (כיסויי פצעים מיוחדים), שכן עלותם הגבוהה מגדילה את העלות הכוללת של טיפול ביוטכנולוגי.

יעילותן של טכנולוגיות תאים הוכחה עד היום, אך למרבה הצער, טכנולוגיות אלו יקרות מאוד, במיוחד במדינות בהן לא הוקם ייצור תעשייתי של קומפוזיציות תאים. עם זאת, מדינות כמו ארצות הברית הקימו זה מכבר תעשייה לייצור חומרי תאים להשתלת כוויות. בפרט, חברת BioSurface Technology Inc. גידלה מאז 1989 37,000 שכבות קרטינוציטים רב-שכבתיות, ששימשו לטיפול ב-240 חולים ב-79 מדינות ברחבי העולם (R. Odessey, 1992), בעוד ש-1 סמ"ר של תרבית ^תאים עולה כ-7-8 דולר אמריקאי.

לטכנולוגיה לטיפול במחלות ובעיות עור שונות יש מספר הבדלים, אך כל טיפול תאי מבוסס על קבלת חומר תאי איכותי והשתלתו.

תהליך זה מורכב מהשלבים הבאים:

• לקיחת עור מקורבנות (או מתורמים),
• הובלת מתלים לעור למרכז ביוטכנולוגיה,
• בידוד תאי שכבת הבסיס וריבוים,
• צמיחה של שכבות קרטינוציטים רב שכבתיות (MLK).
• השתלת תרבית תאים.

הבעיה העיקרית בביצוע טיפול באמצעות השתלת שכבות קרטינוציטים רב-שכבתיות היא הצורך בתאים ברי-קיימא בכל שלבי השתלת התאים. פיסות עור לבידוד תאים אוטולוגיים או אלוגניים צריכות להיות דקות ככל האפשר, שכן במקרה זה קל יותר להפריד אותן בשיטות מכניות ואנזימטיות ולקבל תרחיף של תאים חיים לגידול. ניתן להשיגן על ידי חיתוך בדרמטום או באמצעות עור העפעפיים, העורלה והמשטח הפנימי של הכתף. בהתחשב בכך שהתאים רגישים להלוגנים (כלור, יוד), מי חמצן, לא ניתן להשתמש בהם בעת עיבוד העור במהלך איסוף החומר.

התפוקה הכמותית והאיכותית של תאים משתלי עור ויעילות גידולם תלויות גם בבריאותו ובגילו של התורם. בנוסף, יש להעביר ביופסיות עור במהירות האפשרית ובתנאים מתאימים (סביבה, טמפרטורה) למעבדה מוסמכת ומאושרת למטרות אלה.

לאחסון והובלה של מתלי עור, ניתן להשתמש במדיום Eagle's או במדיום 199 בתוספת 10% סרום בקר, במדיום DMEM בתוספת 5% סרום בקר עוברי ואנטיביוטיקה.

במעבדת הציטולוגיה, ביופסיה של העור מחולקת תחילה מכנית לחתיכות קטנות, לאחר מכן חתיכות העור עוברות עיבוד באמצעות אנזימים: טריפסין, קולגנאז, דיספאז וכו'.

תחת פעולת אנזימים, דסמוזומים נהרסים וקרטינוציטים משתחררים למצע בצורת תאים בודדים או אגרגטים המורכבים ממספרים שונים של תאים. לגידול משתמשים רק בקרטינוציטים בסיסיים, אשר גדלים במצע מיוחד בתרמוסטטים המכילים 5% CO2, בצלחות פטרי או בצלוחיות בטמפרטורה של t = 37 מעלות צלזיוס. כבר לאחר 48 שעות נצפית היווצרות מושבות של קרטינוציטים, אשר מתמזגות בהדרגה והופכות לשכבה חד-שכבתית. לאחר קבלת מספר מספיק של תאים, התרחיף המתקבל זורע על חבישות פצעים שהוכנו למטרה זו ומושם בצלחות פטרי. ראשית, נוצרת מהתרחיף שכבה חד-שכבתית ולאחר מכן שכבה רב-שכבתית של קרטינוציטים. שלבי תהליך גידול הקרטינוציטים מוצגים באופן סכמטי באיור 12 (33,43,54,65).

היווצרות שכבת קרטינוציטים רב-שכבתית המתאימה להשתלה אורכת בדרך כלל 7-10 ימים. לעיתים תקופה זו ארוכה יותר, תלויה באיכות חומר המקור (גיל, מצב בריאותי של התורם, נכונות איסוף החומר, איכות המדיום בו נעשה שימוש וכו'). אם השכבה הרב-שכבתית גדלה יתר על המידה, תאים עם תופעת אפופטוזיס שאינה מתאימה להשתלה עשויים להופיע על פני השטח שלה. צלחות פטרי עם שכבות קרטינוציטים רב-שכבתיות (MLK) הגדלות בהן על גבי כיסויי פצעים מועברות למרפאה במיכלים מיוחדים בטמפרטורה של לפחות +15°C.

שיטת גרין שעברה שינוי לגידול MPC

בעבודתנו, השתמשנו בקמבריק רב שכבתי ככיסוי לפצע, וזנחנו את סרטי ה-"פוליפור" שאיתם התחלנו לעבוד בניסוי עם חולדות. לפיכך, גידלנו שכבות רב שכבתיות של קרטינוציטים על גבי קמבריק נטול שומן וסטרילי, למרות שגם הוא אינו כיסוי פצע אופטימלי.

מחקרים קליניים נערכו על מתנדבים בהתאם לסטנדרטים האתיים הנדרשים: חתימה על הסכם והסכמה מדעת.

1. נעשה שימוש בתרבית של קרטינוציטים (אוטולוגיים) וקרטינוציטים מאוחסנים (אלוגנאיים) של המטופל עצמו.
2. הקרטינוציטים של המטופלים עצמם התקבלו מחתיכת עור שנחתכה בחלק הפנימי של זרועותיהם העליונות.
3. ניתוח דרמבריזיה של צלקות בוצע באמצעות תרמוקאוטריה, דיסקים סיבוביים ולייזר ארביום.
4. נלקחו קבוצות של חולים עם צלקות נורמוטרופיות, היפוטרופיות והיפרטרופיות.

התהליך הטכנולוגי ליישום טכנולוגיה סלולרית לשיפור מראה צלקות עור כלל את השלבים הבאים:

1. בחירת מטופלים.
2. הסברים על מהות הטיפול, מסגרת הזמן להשגת התוצאות הצפויות, חתימה על החוזה והסכמה מדעת.
3. יש לרשום לחולים 2-3 שבועות לפני הניתוח סלמוויט טבליה אחת 3 פעמים ביום, זינקתרל טבליה אחת 3 פעמים ביום.
4. לקיחת פיסת עור באורך 2.0 ס"מ וברוחב 0.7-1.0 ס"מ מהמשטח הפנימי של הכתף, גבוה, כמעט בחלק התחתון של אזור בית השחי, כדי להשיג קרטינוציטים אוטולוגיים.
5. במקרים בהם מטופלים סירבו לבודד קרטינוציטים משלהם עקב האפשרות של צלקת ליניארית על המשטח הפנימי של הכתף, נלקח חומר תאי מבנק תאים (קרטינוציטים אלוגניים).
6. קרטינוציטים בודדו וגודלו במעבדה המוסמכת לסוג זה של עבודה.
7. לאחר קבלת כמות מספקת של MPC להשתלה על הצלקות, נקבע יום לניתוח במרפאה, לשם החומר הובא במיכלים מיוחדים בצלחות פטרי.
8. בוצע ניתוח דרמבריזיה של הצלקת, המוסטאזיס, המשטח המלוטש נשטף בתמיסת מלח סטרילית, יובש, ולאחר מכן הושתלו עליו תאי MPC על גבי תאי "תאים למטה" קמבריים סטריליים. כלומר, התאים שהיו עליונים ב-MPC התבררו כנמוכים יותר, הסמוכים למשטח המלוטש.
9. מעל הונח סרט סטרילי, אשר הוצמד לעור באמצעות תחבושת אלסטית או פלסטר Omnifix אלסטי. במקום הסרט, ניתן להשתמש בתחבושות פצע אדישות המכילות סיליקון, לדוגמה Mepitel, Mepiform, יריעות ג'ל סיליקון.

לאחר 5-7 ימים, מסירים את הציפוי או את ציפוי הסיליקון. בשלב זה, כל הקרטינוציטים אמורים לזחול על הצלקת המלוטשת ולהיצמד לפני השטח שלה.

10. הסביבה הלחה שנוצרת מתחת לסרט ולציפוי הסיליקון תורמת לכך באופן פעיל. את הקמבריק שנותר על הצלקת מנקודה זו ואילך ניתן להשרות בג'ל קוריוזין או כיטוזן. כתוצאה מכך, ביום השני נוצר קרום צפוף, אשר, לנוחיות המטופל, ניתן לקבע בצורה הטובה ביותר באמצעות מדבקה אלסטית ונושם, כגון Omnifix. הקרום הנושם מאפשר לאפידרמיס שנוצר להתמיין ולהפוך לאפידרמיס בוגר.

בהתאם לסוג הצלקת ועומק השחיקה, התחבושת נדחית לאחר 8-10 ימים. בשלב זה, לאפידרמיס יש 30-40% יותר שכבות תאים מאשר בעור רגיל. קרום הבסיס אינו נוצר. קרטינוציטים של האפידרמיס המעובה מפרישים הרבה מולקולות פעילות ביולוגית לתוך רקמת הצלקת.

הצלחת טיפול בצלקות ביוטכנולוגיות תלויה במידה רבה בשיטת הטיפול בתקופה שלאחר הניתוח. תרביות תאים הן סוג "עדין" של כיסוי פצע ובשלבים המוקדמים לאחר ההשתלה, ניתן לקלף בקלות את ה-IPC מהרקמות הבסיסיות. לכן, מומלץ למטופלים לטפל בצלקת בזהירות לאחר הניתוח. במשך 8-9 חודשים, אין לשפשף ולטפל בעדינות במים קרים רותחים כדי למנוע קריעה של האפידרמיס הדק, החדש שנוצר, שאין לו קשר הדוק עם הרקמות הבסיסיות.

פֶּתֶק.

לפני ניתוח ובמהלך דרמבריזיה, מותר להשתמש בחומרים חיטוי וחמצוניים הלוגניים (יודופירן, סוליודופירון, יודינול, יודינט, כלורהקסידין, מי חמצן), לפני השתלת תאים - אסור בהחלט בשל השפעתם הציטוטוקסית. מתילן כחול וירוק מבריק גם הם רעילים לתאים.

כדי למנוע זיהום, במיוחד בעבודה עם צלקות היפרטרופיות, ניתן לטפל בשדה הניתוח עם נאומיצין סולפט, פולימיקסין או גנטמיצין. אין להם השפעה ציטוטוקסית על קרטינוציטים.

כתוצאה מטיפול כזה, מושגת השפעה משולשת.

1. יישור פני השטח של הצלקת.
2. יצירת שכבה חדשה של אפידרמיס בעובי רגיל מעליה.
3. טרנספורמציה של רקמת צלקת לרקמה דמוית עור עקב פעולת ציטוקינים, גורמי גדילה ומולקולות פעילות ביולוגית אחרות המופשות על ידי תאים מושתלים ומגורות על ידם קרטינוציטים, פיברובלסטים ומקרופאגים.

הצלקת הופכת פחות מורגשת, אלסטית יותר, נקבוביות ושיער קלורי מופיעים בה, וניתן לשחזר פיגמנטציה עקב נוכחות מלנוציטים ב-IPC.

עם זאת, כל ההיבטים החיוביים הללו של הצלקת אינם מתרחשים באופן מיידי. בהקשר זה, יש להזהיר את המטופלים כי תהליך הטרנספורמציה של רקמת צלקת לרקמת עור מתרחש באיטיות וניתן לצפות לתוצאה אופטימלית של טיפול כזה לא לפני 10-14 חודשים. מיד לאחר דחיית התחבושות, למשטחים המלוטשים יש פוליכרומיה בולטת, ככל שהליטוש בהיר יותר, כך בוצע ליטוש עמוק יותר. הנזק הנמוך ביותר לעור נצפה בעת ליטוש צלקות נורמוטרופיות באמצעות לייזר ארביום. צבע הצלקות והעור שמסביב שוחזר תוך 3 עד 8 שבועות. למרות אמצעי זהירות אלה, לעיתים מתרחשת היפרפיגמנטציה לאחר הניתוח, שיכולה להיעלם מעצמה תוך מספר חודשים.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]